本发明属于红球菌b7740产类异戊二烯分离纯化的
技术领域：
，具体涉及北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的分离纯化方法。
背景技术：
：红球菌属是一类广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，在土壤、海底沉积物和食草动物粪便中含量丰富，且多数为营腐生生活。红球菌属(rhodococcussp.)是在1891年由zoof建立的，从建立至今，分类地位一直不确定。目前，红球菌归属于放线菌门(actinobacteria)，放线菌纲(actinobacteria)，放线菌亚纲(actinobacteridae)，放线菌目(actinomycetales)，棒杆菌亚目(croynebacterineae)，诺卡氏菌科(nocardiaceae)，红球菌属(rhodococcus)。目前，国内外对红平红球菌的研究较多，主要集中在其生物降解能力研究和分子学研究，而对红球菌产类异戊二烯物质研究较少，尤其对极地海洋来源的红球菌b7740产类异戊二烯物质的鉴定与研究尚十分匮乏，红球菌b7740是我国北极科考队于第三次北极科考时从b77站点20米的表层海水中发现，对于该菌所产物质的纯化尚未有任何文献报道。红球菌b7740产类胡萝卜素因该微生物独特的代谢通路，与常见高等植物来源类胡萝卜素相比，结构相差较大，结构种类不单一，其独特的结构不仅赋予了它独特的活性，也增大了其纯化的难度。技术实现要素：为解决上述现有技术存在的问题，本发明提供了北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的分离纯化方法，该分离方法操作方便快捷，能对红球菌b7740所产类异戊二烯物质进行有效的分离纯化。实现本发明上述目的所采用的技术方案为：北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的分离纯化方法，利用高速逆流色谱分离纯化北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯。北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的分离纯化方法，包括如下步骤：1、按正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:6-8:2-4配制溶剂体系，充分摇匀，待溶剂体系开始分层，静置分层并分离，得上层液和下层液，上层液作为固定相，下层液作为流动相；2、将类异戊二烯提取液用部分下层液溶解，配制成100-1000ug/ml样品溶液；3、打开恒温水浴，将温度设置为18-22℃；4、用无水乙醇清洗泵中的螺旋柱管；5、泵入固定相；6、平衡两相溶剂体系：打开紫外检测器，待预热完成后，将波长设置为450nm；正转转动主机，同时以10ml/min流速泵入流动相，待检测器出口端流出流动相且紫外信号稳定不变时，则溶剂体系已基本平衡；7、进样；8、接收流分。进一步，正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:8:2、10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25。与现有技术相比，本发明的优点和有益效果在于：本发明利用tbe-300c高速逆流色谱仪对红球菌b7740所产类异戊二烯物质进行有效的分离纯化，得到三种稀有海洋来源类胡萝卜素。此三种北极海洋来源的稀有类胡萝卜素，具有与常见高等植物来源类胡萝卜素完全不同的端基，该三种类胡萝卜素经鉴定为芳香类胡萝卜素，独特的结构赋予其独特的活性，具有应用于食品、药品、化妆品的价值，并因为其独特的天然来源，比人工合成的类胡萝卜素更易受市场青睐。说明书附图图1为实施例1中红球菌b7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时)的hsccc色谱图。图2为实施例1中红球菌b7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时)的hsccc色谱图。图3为实施例1中红球菌b7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时)的hsccc色谱图。图4为实施例1中红球菌b7740产类异戊二烯物质(溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时)的hsccc色谱图。图5为实施例1中分离产物一的高精度质谱图。图6为实施例1中分离产物二的高精度质谱图。图7为实施例1中分离产物三的高精度质谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。北极海洋红球菌b7740，是发明人于2008年7-9月中国第三次北极科学考察期间，用seabird911plusctd系统从北冰洋b77站点(146°49.28′w，76°58.08′n)25m深的表层海水样品中分离得到，宁波市微生物与环境工程重点实验室通过16srdna序列blast在线比对，判定该菌为红球菌属。实施例1北极海洋红球菌b7740产类异戊二烯的分离纯化实验1、实验材料1.1、实验试剂溶菌酶(20000u/mg)购自国药集团化学试剂有限公司，醋酸锌、氯化钠、甲醇和二氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司，正己烷、二氯甲烷购自国药集团化学试剂有限公司；色谱级甲醇、乙腈购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；色谱级甲基叔丁基醚购自上海阿拉丁生化科技技股有限公司。1.2、实验仪器tbe-300c高速逆流色谱仪购自上海同田生物科技有限公司；2695高效液相色谱仪购自美国waters公司；ltq-orbitrapelite质谱仪购自赛默飞世尔科技(美国)有限公司。1.3、实验原料按照中国专利(一种红球菌b7740类胡萝卜素的微胶囊制备方法、201510016005.8)公开的方法制备类异戊二烯提取液：称取0.8g北极海洋红球菌b7740冻干菌粉(浙江万里学院提供)置于离心管中，加入16ml溶菌酶溶液(1mg/ml)，置于37℃水浴中，避光放置1h，然后加入24ml饱和醋酸锌溶液使已破壁的红球菌沉降，将该离心管于7000rpm、4℃下离心10min，丢弃上清液，再将64ml混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)加入到红球菌沉淀中，用玻璃棒搅拌均匀，离心，分离出上清液，继续向离心管中加入混合有机溶剂(甲醇：二氯甲烷＝4:1，体积比)，如此反复提取2-3次，合并上清液，得到类异戊二烯提取液。2、实验方法：2.1、用1000ml分离漏斗按正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比为10:8:2配制2l溶剂体系，充分振荡摇匀，待溶剂体系开始分层，在室温(25℃)下静置15min进行分层，分离，得上层液(固定相)和下层液(流动相)，将上层液和下层液分别放入蓝盖瓶中，超声排气20min，备用；2.2、将类异戊二烯提取液用20ml下层液溶解，配制成300ug/ml样品溶液；2.3、打开恒温水浴，将温度设置为20℃；2.4、用无水乙醇清洗泵中的螺旋柱管：以50ml/min流速泵入无水乙醇，泵入1min后停止，再打开气泵，排气5min，将螺旋柱管中的残留液体吹干；重复此过程3次(最后一次排气1h)；2.5、泵入固定相：以50ml/min流速泵入固定相，待检测器出口端流出约30-50ml固定相时，停泵；2.6、平衡两相溶剂体系：打开紫外检测器，待预热完成后，将波长设置为450nm；正转转动主机(rev为反转，fwd为正转)，转速为800r/min，同时以10ml/min流速泵入流动相，待检测器出口端流出流动相且紫外信号稳定不变时，则溶剂体系已基本平衡；2.7、进样；将进样六通阀切至到load，在装样柱的注射器中倒入样品溶液20ml，推排气泡后，将样液吸入到进样圈中，直至样液剩余1ml为止，再将load切换至inject，并将检测器、工作站调零，重新记录；2.8、接收流分：待工作站开始记录，按色谱出峰的信号的顺序收集流分；2.9、清洗hsccc仪器：断开主机与泵的连接，关闭主机，以50ml/min流速将无水乙醇泵入，冲洗螺旋柱管，泵入1min后停止，再将主机的进口与气泵的气管连接，打开气泵，排气5min，将螺旋柱管中的残留液体吹干；重复此过程3次(最后一次排气30min)；2.10、将收集的各分流用旋转蒸发仪旋干，再用甲基叔丁基醚复溶，经氮气吹干后，得到各待测流分样品，放置于冰箱负一层进行低温、避光贮藏；2.11、重复步骤2.1-2.10三次，每次重复只改变正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比，正己烷、乙腈和二氯甲烷的体积比分别变为10:6.5:3.5、10:7:3或10:6.75:3.25，其他操作不变。3、一级检测：将每次操作所得的各待测样品用高效液相色谱和紫外吸收进行检测：高效液相色谱检测条件如下：色谱柱ymcc30(5um×4.6mm×150mm)，柱温25℃，紫外吸收检测器，检测波长450nm，进样量10ul；流动相：流动相a为甲醇，b为甲基叔丁基醚，流速：1ml/min.洗脱程序：第一阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱30分钟，其中流动相a的体积百分含量由95变为70％，流动相b的体积百分含量由5变为30％；第二阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱20分钟，其中流动相a的体积百分含量由70变为50％，流动相b的体积百分含量由30变为50％；第三阶段：采用流动相a和流动相b的混合液洗脱10分钟，其中流动相a的体积百分含量由50变为95％，流动相b的体积百分含量由50变为5％。4、一级实验结果：4.1、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时的分离效果溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:8:2的条件下，类异戊二烯提取液的hsccc色谱图如图1所示，由图1可知，出现了三个峰，三个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二和峰三。峰一、峰二和峰三所对应的待测流分样品的hplc和紫外吸收检测结果如表1所示：表1类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:8:2时分离产物的hplc和紫外吸收检测结果从表1可以看出，峰一的分离效果不好，含有三种主要成分，峰二的分离效果虽然好一些，纯度达到了80.33％，但杂峰太多，峰三的分离效果最好，纯度高达95.21％，其最大紫外吸收波长为452nm。4.2、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时的分离效果溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:6.5:3.5的条件下，类异戊二烯提取液的hsccc色谱图如图2所示，由图2可知，出现了八个峰，八个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六、峰七和峰八。峰一-峰八所对应的待测流分样品的hplc和紫外吸收检测结果如表2所示：表2类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.5:3.5时分离产物的hplc和紫外吸收检测结果hsccc分离产物hplc出峰时间hplc出峰面积hplc出峰面积％紫外吸收λmax峰一乱，峰杂＿＿峰二乱，峰杂＿＿峰三22.036130781.62274,452,468峰四26.8179165856.79434,458,484峰五32.2456200393.41282,452,476峰六29.583177893.92284,434,460,486峰七乱，峰杂＿＿峰八24.1253727380.36250,274由表2可知，峰一、峰二和峰七的分离效果很差，全是杂峰，峰三的纯度达到了81.62％，但还有一些杂峰，分离效果一般般，峰四的分离效果也不好，纯度只有56.79％，杂峰太多，峰五的分离效果非常好，纯度达到了93.41％，其最大紫外吸收波长为452nm，峰六的纯度虽然达到了93.41％，但存在拖尾现象，峰八虽然纯度达到了80.36％，但没有出现单峰，两个峰连在了一起，分离效果也一般。4.3、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时的分离效果溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:7:3的条件下，类异戊二烯提取液的hsccc色谱图如图3所示，由图3可知，出现了四个峰，四个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三和峰四，同时标出间一(峰一之前的曲线部分)、间二(峰三和峰四之间的曲线部分)和间三(峰四之后的曲线部分)。峰一-峰四以及间一-三所对应的待测流分样品的hplc和紫外吸收检测结果如表3所示：表3类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:7:3时分离产物的hplc和紫外吸收检测结果hsccc分离产物hplc出峰时间hplc出峰面积hplc出峰面积％紫外吸收λmax间接液一＿＿＿峰一22.01892634992.82274,452,468峰二＿＿＿峰三26.8283486385.1434,458,484间接液二32.2123519683.79282,452,476峰四32.2329124178.96282,452,476间接液三29.5199616991.79284,434,460,486从表3可知，间接液一、峰二的分离效果很差，峰一和间接液三的分离效果比较好，纯度分别达到了92.82％、91.79％，其最大紫外吸收波长分别为452nm、460nm，峰四的纯度虽然纯度达到了78.96％，但没有单峰出现，两峰连在了一起，分离效果一般，峰三的纯度虽然达到了85.1％，但没有单峰出现，两峰连在了一起，分离效果不好，间接液二虽然达到了83.79％，但存在拖尾现象，而且有较多小杂峰。4.4、溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时的分离效果溶剂体系在正己烷：乙腈：二氯甲烷的体积比为10:6.75:3.25的条件下，类异戊二烯提取液的hsccc色谱图如图4所示，由图4可知，出现了六个峰，六个峰按出峰顺序分别为峰一、峰二、峰三、峰四、峰五、峰六。峰一-峰六所对应的待测流分样品的hplc和紫外吸收检测结果如表4所示：表4类异戊二烯提取液在溶剂体系中正己烷、乙腈和二氯甲烷体积比为10:6.75:3.25时分离产物的hplc和紫外吸收检测结果hsccc分离产物hplc出峰时间hplc出峰面积hplc出峰面积％紫外吸收λmax峰一22.0326250272.56274,452,468峰二24.1144199762.6250,274峰三32.3949091792.87282,452,476峰四29.5435915196.39284,434,460,486峰五乱，峰杂＿＿峰六26.8756466489.7434,458,484从表4可知，峰一、峰二的分离效果一般，纯度分别只有72.56％和62.6％，峰三和峰四的分离效果较好，纯度分别达到了92.87％和96.39％，其最大紫外吸收波长分别为452nm、460nm，峰五的分离效果很差，峰六的分离效果较好，纯度为89.7％，其最大紫外吸收波长为458nm，经分析，峰六为β-胡萝卜素。5、二级检测取分离产物一(4.3中峰一对应的流分)、分离产物二(4.4中峰四对应的流分)、分离产物三(4.1中峰三对应的流分)进行高精度质谱分析：质谱条件：esi离子源，扫描范围m/z400-700，分辨率60000，离子阱dda模式，运用碰撞诱导解离(cid)和35％的碰撞能量，扫描时选取3个信号最强的离子进行串联质谱分析，加热温度250℃，毛细管温度350℃，鞘气流速：35，辅助气体流速：15，喷雾电压：3.5kv，s-lens射频水平60％，样品溶解于色谱甲醇中，进样量2ul，流速0.2ml/min。6、二级实验结果：如图5所示，分离产物一在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝589.3283，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为4.9ppm以内，鉴定分离产物一为synechoxanthin。如图6所示，分离产物二在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝533.4095，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为8.8ppm，鉴定分离产物二为chlorobactene。如图7所示，分离产物三在高精度质谱中其分子离子峰为m/z＝529.3835，即为其实际测量高精度加氢分子量值，其与理论值的偏差见表5，其误差为1.1ppm，鉴定21号峰为isorenieratene。分离产物一-三的高精度质谱数据如图5所示：productformulacalculatedmasserror(ppm)experimentalmass分离产物一c40h4404+h+589.33124.9589.3283分离产物二c40h52+h+533.41428.8533.4095分离产物三c40h48+h+529.38291.1529.3835当前第1页12