本发明涉及微生物菌种选育方法的技术领域，更具体地，涉及一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株、选育方法及其应用方法。
背景技术：
酱油是我国历史悠久、备受喜爱的传统调味品之一。我国酱油年产量达500多万吨，占世界年产量60％以上。酱油发酵主要有低盐固态法和高盐稀态法两种方法。目前我国酱油主要以低盐固态法为主，但该法生产的酱油品质不及高盐稀态发酵法。随着人们生活水平提高，对高品质酱油的需求也不断增加。由高盐稀态法酿制而成的酱油品质高、风味佳，高浓度的盐不仅能起到防腐和抑菌的作用，还能赋予酱油咸味和鲜味。但是酿造酱油所用关键菌种米曲霉的代谢活性和所产生的蛋白酶、淀粉酶的酶活及其稳定性也会受到高盐因素的影响而降低，从而导致分解蛋白质及淀粉类原料的速度和利用率降低，氨基酸态氮出品率低，淀粉糖化率低。同时，发酵过程中酵母发酵糖类生成酒精，乳酸菌发酵糖类生成乳酸以及美拉德反应等一系列生化反应带来的酱油色泽、滋味的变化减缓或减少，发酵成熟较慢，发酵周期长等问题也随之而来。日本酱油以其游离糖、总氮和有机酸含量较高等优点占据了大量海外市场和高档酱油的市场份额，虽然其生产方法与我国传统的生产方法相似，但其原料的蛋白质利用率以90％以上高居世界第一，而我国传统高盐稀态酱油酿造中蛋白质利用率只有75％-80％，这与日本先进的微生物菌种选育、复合菌种制曲及多菌种混合发酵等技术密不可分。因此，通过人工诱变选育高产优质菌株，从而获得能在高盐环境中耐受高渗透压，高产蛋白酶、淀粉酶且风味物质丰富、品质高、遗传性状稳定的米曲霉菌株意义重大。
技术实现要素：
本发明提供一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株、选育方法及其应用方法，用于克服现有微生物菌种无法适用高盐稀态法酿制高品质酱油的技术问题。
3、为实现上述目的，本发明提供一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株，保藏编号为cctccno:m2017077。
所述的一种高酶活、高耐盐的米曲霉(aspergillusoryzae)菌株的形态如下：菌落呈圆形，直径为35～40mm，质地疏松，菌丝较出发菌株稍短，但生长旺盛，颜色为黄绿色，背面无色。分生孢子头呈放射状，直径200～300μm，孢子梗2～3mm，近顶囊处直径10～20μm，壁薄且粗糙，顶囊为球形，约25μm。
本发明采用的技术方案为：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的选育方法，包括如下步骤：(1)将出发菌株接种于酪蛋白琼脂平板培养基上培养60～90h，挑选长势良好的平板进行60co-γ射线辐照诱变，诱变剂量选取1～5kgy，辐射完后放至无菌室中进行分离，继续培养60～90h，根据菌丝生长情况和菌落透明圈大小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺盛的菌株。
(2)将步骤(1)筛选出来的菌株接种于pda斜面培养基上，在25～30℃培养至萌动期后，用生理盐水冲洗斜面培养基，离心收集菌体，加入生理盐水得孢子数为106～107个/ml的孢子悬浮液；
(3)取诱变剂原液加入至缓冲液中配制成诱变剂母液，在步骤(1)所述的孢子悬浮液中以体积比1：3～5加入诱变剂母液，在25～30℃处理60～120min后离心分离，用缓冲液反复冲洗至反应终止；
(4)将步骤(3)处理后的孢子悬浮液分别涂布在添加氯化钠溶液的酪蛋白琼脂平板培养基上培养，根据菌丝生长情况和菌落透明圈大小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺盛的菌落，并随即转接至麦芽汁琼脂斜面培养基上，于25～30℃培养至成熟得初筛菌株，然后置于4℃冷藏备用；
(5)用黄豆粉、次粉、麸皮、水按一定比例配制优选培养基，将制备好的优选培养基分装至三角瓶，121℃灭菌25～30min，挑取1环步骤(4)所述的初筛菌株接种至三角瓶内，混匀后于25～30℃堆积培养60～90h，测定其孢子数、发芽率及酶活性，孢子数最高、发芽率及酶活最高的菌株即为高酶活、高耐盐的米曲霉菌株。
优选地，步骤(1)所述的出发菌株是米曲霉3.951。
优选地，步骤(3)所述的诱变剂是甲基磺酸乙酯，所述的缓冲液是ph为7.0～8.0的磷酸缓冲液。
优选地，步骤(4)所述的氯化钠溶液的初始质量分数为10～14％，递增梯度为2％，最终质量分数为22～26％。
优选地，步骤(1)、(4)所述的酪蛋白琼脂平板培养基的配方组分以重量计为15份酪蛋白胰酶消化物、5份大豆粉木瓜蛋白酶消化物、5份氯化钠、15份琼脂、1000份蒸馏水；所述的麦芽汁琼脂斜面培养基的配方组分以重量计为130份麦芽浸粉、0.1份氯霉素、5份氯化钠、15份琼脂、1000份蒸馏水。
优选地，步骤(5)所述的优选培养基的配方组分以重量计为7.2份黄豆粉、2份次粉、0.8份麸皮、30份蒸馏水。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株应用于高盐稀态发酵酱油酿造工艺。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的应用方法是：
a、以重量份计称取7.2份大豆、2份次粉、0.8份麸皮，将大豆加水浸泡3～5小时后将水放净，取出黄豆，加入已称好的麸皮，装入常压蒸锅内蒸煮，以蒸至熟透而不烂，豆瓣分开为适宜，再与次粉进行混匀，摊开进行冷却至25～30℃，接入高酶活、高耐盐的米曲霉菌株，接种量为0.2％，混匀，于30℃堆积培养72h，则制成成曲。
b、将制作的成曲与盐水按照1：2～5的质量比添加至酱油发酵工艺中即可，进一步优选的质量比为1：3。
本发明生物材料样品已按照专利法实施细则的规定在国家知识产权局指定的保藏单位——中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日；保藏编号为cctccno:m2017077；分类命名：米曲霉hncc6.189，拉丁文学名：asporgillusorgzoehncc6.189；生物样本存活性于2017年3月11日检测完成，结果是存活。
本发明的有益效果在于：
1、本发明采用诱变育种法，通过60co-γ射线辐照及化学试剂甲基磺酸乙酯联合诱变，对米曲霉3.951菌株进行人工诱变选育高产优质菌株，成功培育了一种具有耐高盐、种曲孢子数多、发芽率高、酶活高、遗传性能稳定以及易于扩大培养等众多优良特性的米曲霉菌株(aspergillusoryzae)hncc6.189。
2、本发明选育的米曲霉菌株(aspergillusoryzae)hncc6.189将出发菌株的蛋白质利用率从80％提高到89％，提高效果明显，则通过提高蛋白质利用率、淀粉糖化率，进而提高酱油出油率达到充分利用酿造原料的目的；其次，本发明选育的米曲霉菌株(aspergillusoryzae)hncc6.189将高盐稀态酱油生产周期从原来的6个月缩短到5个月，能适应大规模工业化生产，其应用前景广阔。
3、本发明选育的米曲霉(aspergillusoryzae)菌株hncc6.189制得酱油与出发菌株发酵制得的酱油相比，其氨基酸态氮、总酸以及风味物质的含量都远远高于出发菌株发酵制得的酱油，其中风味物质的含量方面醇类物质相对含量增加了1.17％的香茅醇及0.63％的乙醇，酚类物质增加了0.19％的4-乙基愈创木酚，酸类物质增加了0.25％的2,4-己二酸、1.11％的己酸及1.57％的丁香酸，酯类物质增加了3.75％的乙酸乙酯、0.06％的硬脂酸甲酯，醛酮类物质增加了1.53％的5-甲基-2-糠醛、5.66％4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2h)-呋喃酮、1.09％的2,5-二甲基-吡嗪及0.23％的2-糠醛，以上风味物质大都具有典型的酱香及特有的香味成分，使酱油风味更加丰富、醇美。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的表1-4，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日；保藏编号为cctccno:m2017077；分类命名：米曲霉hncc6.189，拉丁文学名：asporgillusorgzoehncc6.189；生物样本存活性于2017年3月11日检测完成，结果是存活。
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的选育方法，包括如下步骤：
(1)将出发菌株接种于酪蛋白琼脂平板培养基上培养72h，挑选长势良好的平板，送于湖南省核农学与航天育种研究所进行60co-γ射线辐照诱变，选取1kgy、2kgy、3kgy作为诱变剂量，每个剂量辐照10个平板，共30个平板。辐射完后，用黑布将经60co-γ射线辐照诱变处理后的平板包好拿回，放至无菌室中进行分离，继续培养72h，根据菌丝生长情况和菌落透明圈大小，以出发菌株为对照组筛选出生长旺盛的菌株。
(2)将步骤(1)筛选出来的菌株接种于pda斜面培养基上，在25～30℃培养至萌动期后，用生理盐水冲洗斜面培养基，离心收集菌体，加入生理盐水得孢子数为106～107个/ml的孢子悬浮液；
(3)取甲基磺酸乙酯原液加入至ph为7.2的磷酸缓冲液中配制成甲基磺酸乙酯母液，在2ml的所述的孢子悬浮液中加入8ml的甲基磺酸乙酯母液，在25～30℃处理90min后离心分离，用磷酸缓冲液反复冲洗至反应终止；
(4)将步骤(3)处理后的孢子悬浮液分别涂布在氯化钠溶液质量分数为12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％的酪蛋白琼脂平板培养基上培养，并对菌种进行编号，编号分别为lp001、lp002、lp003、lp004、lp005、lp006、lp007(其中，酪蛋白琼脂平板培养基的配方组分以重量计为15份酪蛋白胰酶消化物、5份大豆粉木瓜蛋白酶消化物、5份氯化钠、15份琼脂、1000份蒸馏水)；然后根据菌丝生长情况和菌落透明圈大小，以出发菌株米曲霉3.951为对照组筛选出生长旺盛的菌落，并随即转接至麦芽汁琼脂斜面培养基上，于25～30℃培养4天后成熟得初筛菌株，然后置于4℃冷藏备用。(其中，麦芽汁琼脂斜面培养基的配方组分以重量计为130份麦芽浸粉、0.1份氯霉素、5份氯化钠5.0、15份琼脂15.0、1000份蒸馏水)
(5)以重量计称取7.2份黄豆粉、2份次粉、0.8份麸皮、30份蒸馏水配制优选培养基，将制备好的培养基分装至7个三角瓶，121℃灭菌30min，分别挑取1环不同编号的初筛菌株接种至三角瓶内，混匀后于25～30℃堆积培养72h，测定每个编号的孢子数、发芽率及酶活性(碱性蛋白酶活力、酸性蛋白酶活力、中性蛋白酶活力及淀粉酶活力)，测定的结果见表1。
表1各编号种曲测定结果
从表1可以看出，孢子数最高、发芽率及酶活最高的菌株是编号为lp001的菌株，将其冷冻保藏至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国.武汉.武汉大学,保藏日期2017年3月1日；保藏编号为cctccno:m2017077；分类命名：米曲霉hncc6.189，拉丁文学名：asporgillusorgzoehncc6.189；生物样本存活性于2017年3月11日检测完成，结果是存活。
实施例2：
将黄豆粉、次粉、麸皮、水按7.2:2:0.8:30的比例配制，并添加梯度质量浓度的氯化钠溶液，制备成不同盐浓度12％、14％、16％、18％、20％、22％、24％质量分数的培养基，于121℃灭菌30min，将实施例1中的lp001菌株和米曲霉3.951分别挑取1环孢子接种于培养基中，在30℃下培养72h。本实施例中lp001菌株和米曲霉3.951的种曲孢子数，发芽率及酶活性、渗透压的检测结果对比见表2。
表2：不同盐浓度下lp001菌株和米曲霉3.951的对比检测结果
从上表2中可以看出，本发明制得的lp001菌株最高耐受盐浓度可达20％，当盐浓度增大到22％时，其种曲孢子数、发芽率、酶活力开始下降，但都远远高于出发菌株米曲霉3.951的测定结果。结果表明，本发明lp001菌株的耐盐性能远大于出发菌株米曲霉3.951的耐盐性。
实施例3：
将实施例1中的lp001菌株在麦芽汁斜面培养基上连续传代培养10代，并将第1代、第3代、第5代、第8代、第10代的斜面菌种制作三角瓶种曲，测定其孢子数、发芽率及酶活性，判断其遗传稳定性，具体数据见表3。
表3：lp001菌株传代稳定性测试结果
从表3可以看出，从种曲孢子数、发芽率及酶活性检测结果来看，lp001菌株的遗传稳定性良好。
实施例4：
一种高酶活、高耐盐的米曲霉菌株的应用方法是：
以重量份计称取7.2份大豆、2份次粉、0.8份麸皮，将大豆加水浸泡4小时后将水放净，取出黄豆，加入已称好的麸皮，装入常压蒸锅内蒸煮，以蒸至熟透而不烂，豆瓣分开为适宜，再与次粉进行混匀，摊开进行冷却至25～30℃，接入高酶活、高耐盐的米曲霉lp001菌株，接种量为0.2％，混匀，于30℃堆积培养72h，则制成成曲。将制作的成曲与盐水按照1：3的质量比添加至酱油发酵工艺中，其后的发酵工艺与原发酵法保持一致，发酵时间150天，过滤头油，利用蒸馏萃取处理酱油样品，气相色谱-质谱(sde/gc-ms)方法检测其与出发菌株米曲霉3.951制得的酱油的各项酱油风味含量变化，同时测定原料及酱渣的全氮含量，推算蛋白质利用率，结果见表4。
表4：lp001菌株与米曲霉3.951制得的酱油样品的指标检测结果
从表4可以看出，本发明制得的米曲霉lp001菌株制得酱油与出发菌株米曲霉3.951发酵制得的酱油相比，在发酵周期缩短一个月的条件下，其氨基酸态氮、总酸、蛋白质利用率从80.02％提高到89％，提高效果明显；风味物质的含量远高于出发菌株米曲霉3.951发酵制得的酱油，其中醇类物质相对含量增加了1.17％的香茅醇及0.63％的乙醇，酚类物质增加了0.19％的4-乙基愈创木酚，酸类物质增加了0.25％的2,4-己二酸、1.11％的己酸及1.57％的丁香酸，酯类物质增加了3.75％的乙酸乙酯、0.06％的硬脂酸甲酯，醛酮类物质增加了1.53％的5-甲基-2-糠醛、5.66％4-羟基-2-乙基-5-甲基-3(2h)-呋喃酮、1.09％的2,5-二甲基-吡嗪及0.23％的2-糠醛，以上风味物质大都具有典型的酱香及特有的香味成分，使酱油风味更加丰富、醇美。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。