TMEM209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及tmem209基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中作为内参基因的应用。

背景技术：

稻螟赤眼蜂trichogrammajaponicunashmead属于膜翅目赤眼蜂科，是一种重要的害虫天敌。其成虫将卵产在寄主卵内，在寄主卵内取食、发育致使寄主卵死亡，从而达到将害虫消灭在危害之前的目的。虽然在生态上对稻螟赤眼蜂的研究较多，但对分子机理上的研究非常少。如已经有研究显示不同地理种群对稻螟赤眼蜂耐高温或耐低温的能力有所不同，但是稻螟赤眼蜂如何应对高温低温的机理还有待进一步开展研究。若能明确稻螟赤眼蜂耐高低温的机制，将对种群的筛选、放蜂效果的提高都能带来突破。

研究稻螟赤眼蜂在杀虫剂胁迫后体内相关基因的功能，其中最基本的技术方法就是对功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的印迹杂交，半定量rt-pcr等定量分析方法比较，实时荧光定量pcr具有操作简单、特异性强、灵敏度高、线性关系好、成本低等优点，是近年来最受科研工作者青睐的基因表达定量的方法。然而，实时荧光定量pcr检测的准确性很大程度上取决于内参基因的选择，其作用是校正样品量以及实验过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正样品量之间的误差，这样获得的实验结果才更为可信。昆虫中常用的内参基因有rps3、actin、gapdh、tublin、rpl10、18srrna、28srrna等，但实际上没有任何一个内参基因mrna表达水平在所有外在或内在的条件下都是恒定的，理想的内参基因是不存在的，不同物种之间差异更是巨大。所以，一般要选择一个在处理因素作用的条件下表达相对稳定的基因作内参基因或内参标准，这是实时荧光定量pcr成功与否的关键所在。

因此，要对稻螟赤眼蜂进行相关的耐杀虫剂机制研究，明确与耐杀虫剂相关的基因，就必须先筛选出合适的内参基因。昆虫体内的p450基因是与杀虫剂胁迫相关的重要基因，包括cyp4g15，cyp4c1，cyp49a1，cyp18a1，cyp6a1，cyp6a2，cyp9p3及cyp9e2等，但这些基因在稻螟赤眼蜂体内对杀虫剂胁迫的反应尚未见报道，也无研究关于杀虫剂胁迫下稻螟赤眼蜂体内稳定的内参基因的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关基因的表达量的应用，为稻螟赤眼蜂在杀虫剂胁迫下进行实时荧光定量pcr反应时选择合适内参基因提供依据。

一方面，tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关基因的表达量的应用。

优选的，tmem209基因作为内参基因在定量检测杀虫剂胁迫下稻螟赤眼蜂体内与解毒代谢相关基因的表达量的用途。

其中，所述定量检测的方法优选为实时荧光定量pcr。

本发明中，所述tmem209基因的核苷酸序列如seqidno:8所示。

优选的，在对稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关基因的表达量进行定量检测时，扩增所述tmem209基因的引物序列如seqidno:26和seqidno:27所示。

本发明中，所述与杀虫剂解毒代谢相关的基因优选p450基因。进一步优选的，所述p450基因为cyp4g15，所述cyp4g15的基因序列如seqidno:11所示。

优选的，在对稻螟赤眼蜂体内cyp4g15基因进行定量检测时，扩增所述cyp4g15基因的引物序列如seqidno:32和seqidno:33所示。

另一方面，本发明提供一种定量检测p450基因在稻螟赤眼蜂被杀虫剂胁迫后的表达量的方法，该方法包括：以tmem209基因为内参基因，检测p450基因在稻螟赤眼蜂被杀虫剂胁迫后的定量表达量，其中所述定量检测表达量的方法为实时荧光定量pcr。

优选的，所述杀虫剂为吡虫啉和/或吡蚜酮。所述杀虫剂胁迫的时间优选为0.5～4小时。

优选的，所述tmem209基因的基因序列如seqidno:8所示。

优选的，所述p450基因为cyp4g15。本发明在对稻螟赤眼蜂体内cyp4g15基因表达量进行定量检测时，扩增所述tmem209基因的引物序列优选为seqidno:26和seqidno:27所示序列。扩增所述cyp4g15基因的引物序列优选为seqidno:32和seqidno:33所示序列。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明为稻螟赤眼蜂体内基因表达谱分析提供了稳定的内参基因参考，为其他物种在特定实验条件下实时荧光定量pcr内参基因的筛选提供了借鉴。应用本发明可建立在不同杀虫剂胁迫下，利用实时荧光定量pcr检测稻螟赤眼蜂体内各基因的方法，减少检测误差，使检测结果更加准确可靠。

附图说明

图1：reffinder软件分析吡虫啉或吡蚜酮胁迫下稻螟赤眼蜂内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。

图2：以tmem209为内参基因，利用实时荧光定量pcr方法分析吡虫啉或吡蚜酮胁迫后稻螟赤眼蜂体内cyp4g15基因的相对定量表达水平。

具体实施方式

本发明采用下述方法筛选定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的内参基因。采用该方法可以筛选出合适的内参基因，并且可以作为不同杀虫剂胁迫下稻螟赤眼蜂体内相关功能基因表达量的研究。

该方法包括：提供备选的内参基因；以未处理的稻螟赤眼蜂为对照，采用不同杀虫剂对稻螟赤眼蜂成虫进行胁迫处理，处理后收集稻螟赤眼蜂样品，立即提取总rna，测定rna浓度，将rna反转录合成cdna，然后以各样品cdna为模板，利用实时荧光定量pcr对备选内参基因进行验证，采用reffinder软件进行数据分析，从而筛选出稻螟赤眼蜂在杀虫剂胁迫条件下最稳定表达的内参基因。

本发明中，稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关的功能基因优选为p450基因，如cyp4g15，cyp4c1，cyp49a1，cyp18a1，cyp6a1，cyp6a2，cyp9p3及cyp9e2等。在本发明具体实施例中优选功能目的基因为cyp4g15基因，其核苷酸序列如seqidno:11所示。

本发明对内参基因的筛选过程中，备选的内参基因为以下10种：

1、多聚腺苷酸结合蛋白(polyadenylatebindingprotein1，pabpc1)，其核苷酸序列如seqidno:1所示；

2、剪切因子(splicingfactor，sf)，其核苷酸序列如seqidno:2所示；

3、延伸因子1(elonggationfactor1,ef1)，其核苷酸序列如seqidno:3所示；

4、酪蛋白激酶(caseinkinase1alpha，ck1a)，其核苷酸序列如seqidno:4所示；

5、延伸因子1delta(elonggationfactor1deta，ef1d)，其核苷酸序列如seqidno:5所示；

6、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,gapdh)，其核苷酸序列如seqidno:6所示；

7、肌动蛋白11(actinrelatedprotein2,arp2)，其核苷酸序列如seqidno:7所示；

8、跨膜蛋白(transmembraneprotein209，tmem209)，其核苷酸序列如seqidno:8所示；

9、肌动蛋白213(actinrelatedprotein213,arp213)，其核苷酸序列如seqidno:9所示；

10、atp合成酶(atpsynthase)，其核苷酸序列如seqidno:10所示。

本发明选用的稻螟赤眼蜂优选为同一生理状态下的稻螟赤眼蜂。在本发明的具体实施例中，采用在同一条件下室内饲养的稻螟赤眼蜂，饲养条件如下：稻螟赤眼蜂的室内种群在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，用米蛾卵进行扩繁，利用初羽化的成蜂进行不同杀虫剂胁迫处理。

本发明对杀虫剂胁迫的具体方式没有特殊的限定，可以将稻螟赤眼蜂置于杀虫剂环境中进行杀虫剂胁迫。优选采用将稻螟赤眼蜂置于含有杀虫剂的药膜管中，封口后进行杀虫剂胁迫处理。本发明在具体实施例中采用的杀虫剂分别为吡虫啉和吡蚜酮，本领域技术人员可以根据研究目的选择本领域中的其他种类杀虫剂，如有机磷类、菊酯类或其它新型杀虫剂。本发明对杀虫剂胁迫的浓度没有特殊限定，根据杀虫剂的种类不同采用本领域中的常规杀虫剂胁迫浓度即可。本发明中，对稻螟赤眼蜂进行不同杀虫剂胁迫的时间至少为0.5小时，作为优选的，杀虫剂的胁迫时间为0.5～4小时，进一步优选为1～2小时。为了保证筛选试验的准确性，本发明优选每个处理设置至少3个生物学重复。

收集不同杀虫剂胁迫的稻螟赤眼蜂，并提取其总rna，测rna浓度，反转录合成cdna。本发明对此步骤没有特殊限定，采用本领域中的常规步骤进行操作即可。

以各样品的cdna为模板，利用实时荧光定量pcr对备选内参基因进行验证。

进行实时荧光定量pcr方法对备选的10个内参基因所对应的引物为：

polyadenylatebindingprotein1(pabpc1)：

正:gcgacaacatcaccaggaga，反：gaagagatggatcgcgctga；

splicingfactor(sf)：

正：ttatgttcgggagcgtggag，反：tcaggtctgcttctcgatcac；

elonggationfactor1(ef1)：

正：gccatggttcaagggatgga，反：accgttccaataccgccaat；

caseinkinase1alpha(ck1a)：

正：ggcagacctttggaactcgt，反：acatgacctccaccgttcac；

elonggationfactor1deta(ef1d)：

正：aacttacgacagggctgagc，反：caagagctgcaatgccatcc；

glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(gapdh)：

正：caccaccatcgagaaggctt，反：tgggtcgtacgagtcgagat；

actinrelatedprotein2(arp2)：

正：tccgctgactttgaaaccgt，反：gagcagcaaacctttcaccg；

transmembraneprotein209(tmem209)：

正：actcacagccaggatcagtg，反：tggggcttcaagttgtgtgt；

actinrelatedprotein213(arp213)：

正：gaccatccgctcttagtgca，反：cagtggaaggttcagcgtct；

atpsynthase：

正：acagacagcggtgccattaa；反：gaattcacccatggcgcatc。

本发明中，cyp4g15基因的引物序列为：

正：tgggtcgaaagtacgcgatg，反：cgcgaccaatgtctcgtttc。

优选的，实时荧光定量pcr的体系和条件分别为：实时荧光定量pcr的反应体系：定量pcr反应体系共20μl，包含1μl的cdna(含有总rna3μg)，10μlsybr荧光试剂(itaquniversalsybrgreensupermix)，正/反向引物各1μl，双蒸水7μl；实时荧光定量pcr的反应条件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。在本发明中，优选每个样本设置2个技术重复。

将实时荧光定量pcr获得的ct值，利用reffinder软件进行分析，筛选得到表达量最稳定的内参基因作为定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的合适内参基因。

reffinder(http://http://fulxie.0fees.us/？type＝reference&i＝1)是一个免费的网络综合评价内参基因稳定性的工具，可从大量的实验数据集评估和筛选内参基因。它能综合bestkeeper，genorm，normfinder和△ct四种方法的结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。其中，△ct法较为简单，通过比较每一对持家基因在每个样品的相对表达来确定适合的内参基因。bestkeeper通过原始ct值和引物扩增效率(e)决定出最适内参基因，并依次排序。genorm程序可用于筛选任何条件下任意数量内参基因，选择出两个以上内参基因，而不是传统地使用单一内参基因。normfinder程序运行原理与genorm程序类似，可直接运算出各基因的表达稳定值(m)，然后根据m值的大小排序，m值越小，稳定性越高。其缺点是只能选择1个合适的内参基因作标准。reffinder是整合bestkeeper，genorm，normfinder和△ct四种方法，对每个候选内参基因单独用4种分析方法评价时的排名求几何平均值，得到综合排名指数，该指数越小，说明内参基因表达越稳定；反之，则越不稳定。

结果得到tmem209基因在稻螟赤眼蜂不同杀虫剂胁迫下表达量最稳定，因此将tmem209基因作为在定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的内参基因。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。其中内参基因稳定性分析reffinder软件的使用按其使用说明进行。

实施例1内参基因的筛选

一、稻螟赤眼蜂的饲养。

稻螟赤眼蜂实验室种群，在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，利用米蛾卵扩繁，初羽化的成蜂进行不同杀虫剂胁迫处理。

二、杀虫剂胁迫处理

分别用水、丙酮、吡虫啉和吡蚜酮制备药膜管，制备过程如下：将1ml的水、丙酮、10ppm吡虫啉和25mg/l的吡蚜酮分别加入到指型管(直径2.5cm，高6cm)中，然后迅速转动指型管，使药液均匀地涂于管内壁，立即将多余的药液倒出，指型管倒立，在室内自然风干后即成药膜管。

将稻螟赤眼蜂引入到药膜管中，用棉塞封口，处理1小时后，收集样品提取总rna；每个处理设置3个生物学重复。

三、实时荧光定量pcr分析所有基因的引物设计及扩增效率。

1.引物设计

选择10种备选内参基因和1种与杀虫剂解毒代谢相关的基因作为目的基因，利用primer3.0软件设计特异性扩增引物(表1)。

2.rna提取过程

取200头稻螟赤眼蜂放入2.0ml玻璃匀浆器中，加入500μltrizol试剂，手动匀浆5min，此后步骤参照trizol试剂(invitrogen，批号：15596026)说明书完成。rna质量和浓度检测：取1μlrna样品，利用nanodrop2000检测od260/280和浓度，od260/280值介于1.8～2.2为合格样品。第一链cdna的合成：利用3μgrna进行反转录，步骤参照thermofisher反转录试剂盒(themofisher，批号：k1622)说明书进行。

表1备选内参基因及目的基因的引物序列及扩增效率。

3.反转录合成的cdna的扩增

以上述反转录合成的cdna为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)pcr扩增备选内参基因和目的基因，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与选取的目的片段一致，然后回收pcr产物并测序进行验证。发现利用以上设计的引物可以有效扩增出目的片段，与我们设计的目的片段大小一致，条带单一，无特异性扩增。pcr扩增体系：20μl反应体系包含10μl2×pcrbuffermix，正/反向引物各1μl，cdna模板1μl，灭菌水7μl。

4.引物扩增效率的考察

以上述反转录合成的cdna按5倍等比稀释成5个不同浓度的cdna为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)进行荧光定量pcr扩增备选内参基因和目的基因。实时荧光定量pcr的反应体系共20μl，包含1μl的cdna(含有总rna3μg)，10μl2×itaqsybrgreen荧光试剂(2×itaquniversalsybrgreensupermix)，正/反向引物各1μl，双蒸水7μl，其中sybrgreen荧光试剂购于bio-rad公司；反应条件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。引物扩增效率由实时荧光定量pcr仪自带软件给出，以扩增效率e(％)是否在90％～110％之间判断引物是否合适(表1)。荧光定量pcr仪为cfx96，bio-rad公司。

5.实时荧光定量pcr

以上述cdna为模板，对备选内参基因和目的基因进行荧光定量pcr扩增(表1)，反应体系和反应条件参照【4.引物扩增效率的考察】一节。实时荧光定量pcr的反应体系共20μl，包含1μl的cdna(含有总rna3μg)，10μl2×itaq荧光试剂，正/反向引物各1μl，双蒸水7μl，其中sybrgreen荧光试剂购于bio-rad公司；反应条件：95℃30s，95℃10s，55℃30s共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。

将实时荧光定量pcr获得的ct值，按照分析软件格式要求输入reffinder软件进行分析。内参基因稳定性分析结果见图1。从图1可以看出，10种不同备选基因的稳定性为：tmem209>pabpc1>ck1a>arp213>atpsynthase>ef1d>sf>ef1>arp2>gapdh，其中tmem209最稳定。

传统来讲，实时荧光定量pcr开展时一般采用单一常见的内参基因，事实证明，这种操作方法是不可取的，任何外在条件或者内在条件的改变都会影响内参基因表达的稳定性。此外，利用不同的内参基因分析同一目的基因的表达量变化差异非常显著，有的甚至可以达到几十倍的差异，严重影响实验结果的可靠性。因此，本发明提供的不同杀虫剂胁迫下稻螟赤眼蜂内参基因的筛选方法，筛选出表达量最稳定的tmem209作为在定量检测稻螟赤眼蜂体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的内参基因。

实施例2tmem209作为内参基因的应用

1.杀虫剂胁迫

分别以吡虫啉和吡蚜酮胁迫1小时的稻螟赤眼蜂为实验样本，水和丙酮处理的稻螟赤眼蜂试虫为对照样本，tmem209为内参基因，利用实时荧光定量pcr检测稻螟赤眼蜂cyp4g15基因的表达水平。杀虫剂胁迫方法、反应体系和反应条件参照实施例1中的杀虫剂胁迫方法、实时荧光定量pcr的操作过程、条件和体系。每个处理设置2个技术重复，3个生物学重复。数据处理采用2^-△△ct方法处理，△△ct＝△ct处理样本-△ct对照样本，△ct＝△ct目的基因-△ct内参基因。各处理间差异显著性采用dps软件进行统计分析。

结果显示：不同杀虫剂处理对稻螟赤眼蜂cyp4g15基因的表达量具有显著的影响；杀虫剂的丙酮对照处理与水对照之间无显著差异，吡虫啉和吡蚜酮处理都显著提高了稻螟赤眼蜂cyp4g15基因的表达量，分别提高了56.5倍和45.7倍。

本发明利用实时荧光定量pcr对不同杀虫剂胁迫条件下稻螟赤眼蜂体内10种备选内参基因和1种目的基因进行了定量扩增，并采用reffinder软件分析了内参基因稳定性，筛选出不同杀虫剂胁迫条件下稻螟赤眼蜂体内最稳定的内参基因tmem209。在此基础上，以稻螟赤眼蜂p450基因cyp4g15为目的基因，tmem209为内参基因，明确了在杀虫剂吡虫啉或吡蚜酮胁迫条件下稻螟赤眼蜂p450基因的表达规律。本发明筛选出的内参基因tmem209适合吡虫啉或吡蚜酮胁迫下稻螟赤眼蜂体内目的基因的表达谱分析，为以后其他杀虫剂胁迫条件下稻螟赤眼蜂基因的定量pcr实验提供了参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>浙江省农业科学院

<120>tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用

<130>gw2017i0813

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ggaacttggacaaaaacattgataacaaggccatgtatgatactttctcagcttttggca240

acattcttagttgcaaagttgctcaggatgagaaaggttcctccaaagggtacggattcg300

ttcattttgaaaccgaagaagctgccaacaagtccatcgacaaggtcaatggtatgctgc360

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<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ttatgttcgggagcgtggag20

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

tcaggtctgcttctcgatcac21

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

gccatggttcaagggatgga20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

accgttccaataccgccaat20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

ggcagacctttggaactcgt20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

acatgacctccaccgttcac20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

aacttacgacagggctgagc20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

caagagctgcaatgccatcc20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

caccaccatcgagaaggctt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

tgggtcgtacgagtcgagat20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

tccgctgactttgaaaccgt20

<210>25

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gagcagcaaacctttcaccg20

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

actcacagccaggatcagtg20

<210>27

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

tggggcttcaagttgtgtgt20

<210>28

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>28

gaccatccgctcttagtgca20

<210>29

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

cagtggaaggttcagcgtct20

<210>30

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>30

acagacagcggtgccattaa20

<210>31

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

gaattcacccatggcgcatc20

<210>32

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>32

tgggtcgaaagtacgcgatg20

<210>33

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

cgcgaccaatgtctcgtttc20