一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法与流程

本发明涉及一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法，特别涉及通过利用表达突变的pcsk9的腺相关病毒感染动物来建立腹主动脉瘤疾病动物模型的方法，属于心血管实验动物模型技术领域。

背景技术：

腹主动脉瘤是指腹主动脉局部梭形或囊性膨胀，管腔内径超过正常值50％的一种病理状态，它是具有潜在致死危险的疾病，一旦瘤体破裂，死亡率超过80％。在美国，腹主动脉瘤的年发病率约为20-40/10万人，占疾病死因的第13位，在我国腹主动脉瘤的发病率也呈逐年上升的趋势，65岁以上男性超声检出腹主动脉瘤的发病率高达5％。由于腹主动脉瘤的发病机制不明，临床上一直未找到防治腹主动脉瘤的有效药物。因此，进一步阐明腹主动脉瘤的发生机制并寻找有效的干预措施是当前心血管病领域中一个亟需解决的重大课题。

由于心血管疾病受到多种遗传因素即基因的影响，所以推动了基因工程小鼠在此方向上的研究。小鼠的基因组和人类具有90％以上的同源性。大多数人类疾病的研究，特别是遗传疾病的研究，不可能直接以人类为实验材料，而通过小鼠来承载这样的实验就成为一种最佳选择。基因工程小鼠是生命科学研究的重要支撑条件，具有以下特点：基因同源性高、可控性强、使用经济、操作简单等，广泛用于探索生命奥秘、研究疾病机制及防治等领域，特别是在心血管领域的研究。传统的制备腹主动脉瘤动物模型的方法是利用apoe敲除鼠(apoe^-/-)皮下埋angii泵至少四周，时间长，而且apoe敲除鼠的市场价格为350元/只,价格高。这严重制约了相关研究工作的广泛开展。

技术实现要素：

本发明针对现有技术的不足，提供一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法。

本发明技术方案如下：

一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法，步骤如下：

第一步，paav/d377y-mpcsk9载体的构建：

1)将paav-mcs质粒经内切酶ecori和内切酶hindiii双酶切，制得paav-mcs酶切产物；

2)将paav-mcs酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收4700bp的dna片段，纯化，得到纯化后的paav-mcs酶切产物；

3)以小鼠肝脏cdna为模板，经pcr扩增，纯化，制得mpcsk9dna片段；

pcr扩增的特异引物核苷酸序列如下：

正向引物：5’gaattcatgggcacccactgctctgcgtgg3’；

反向引物：5’aagctttcactgaacccaggaggcctttgc3’；

4)将步骤3)制得的mpcsk9dna片段经内切酶ecori和内切酶hindiii双酶切，制得mpcsk9酶切产物；

5)将mpcsk9酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含2000bp大小的dna片段，纯化，得到纯化后的mpcsk9酶切产物；

6)将步骤2)纯化后的paav-mcs酶切产物和步骤5)纯化后的mpcsk9酶切产物进行连接，制得连接产物；

7)将步骤6)制得的连接产物转化大肠杆菌，经抗性筛选和测序验证后，制得提取质粒paav/mpcsk9，然后将mpcsk9的377位点天冬氨酸突变为酪氨酸，经dpn1内切酶酶切，抗性筛选和测序验证后，制得提取质粒paav/d377y-mpcsk9；

第二步，制备表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒：

将提取质粒paav/d377y-mpcsk9和辅助质粒paav-rc8、辅助质粒phelper，在ultra-pei试剂条件下，共转入aav293细胞，提取质粒paav/d377y-mpcsk9：辅助质粒paav-rc8：辅助质粒phelper的质量比为2:1:1，转染后收集病毒，经超离心纯化，同时测定病毒滴度，制得表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒；

第三步，病毒感染获得腹主动脉瘤疾病动物模型：

将8周龄的c57bl/6小鼠经尾静脉注射1.0×10¹¹拷贝数的表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒，同时背部皮下植入1.44mg/kg/day的微渗透压泵，同时给予高脂饮食三周，即得。

根据本发明优选的，所述第一步1)中的双酶切反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积30μl；

双酶切反应条件：37℃水浴2小时。

根据本发明优选的，所述第一步2)、3)、5)中的纯化采用axyprepdna凝胶回收试剂盒。

根据本发明优选的，所述第一步3)中，pcr反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积50μl；

反应条件：98℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸2min，34cycles。

制得的mpcsk9dna片段长度为2000bp。

根据本发明优选的，所述第一步3)中，小鼠肝脏cdna采用如下方法制备：

a、取新鲜小鼠肝组织置于ep管中，加入200μltrizol充分研磨后，补加800μltrizol，混匀；

b、加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，4℃12000rpm离心15min；

c、将上层水相移至洁净ep管中，加入500μl异丙醇颠倒混匀；

d、4℃、12000rpm离心10min；

e、弃水相，ep管开盖干燥，溶于50μldepc水中；

f、进行反转录反应，制得小鼠肝脏cdna；反转录反应体系如下，总体积10μl：

反转录反应条件：37℃15min，85℃5sec。

根据本发明优选的，所述第一步4)中，双酶切反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积30μl；

双酶切反应条件：37℃水浴2小时。

根据本发明优选的，所述第一步6)中，连接采用t4dna连接酶和快速连接试剂盒。

根据本发明优选的，所述第一步7)中，mpcsk9的377位点天冬氨酸突变为酪氨酸的反应特异引物核苷酸序列如下：

正向引物：5'-gaagcatgtgctgcaataactggacgctccgatgatgtc-3'；

反向引物:5'-gacatcatcggagcgtccagttattgcagcacatgcttc-3'；

反应体系如下，体系总体积50μl：

反应条件：95℃30sec，55℃1min，68℃7min，16个循环。

根据本发明优选的，所述第一步7)中，dpn1内切酶酶切条件为：1μldpn1内切酶，37℃水浴1小时。

根据本发明优选的，所述第一步制得的paav/d377y-mpcsk9载体的核苷酸序列如seqidno.1所示。

根据本发明优选的，所述第二步中制备d377y-mpcsk9的腺相关病毒的具体步骤如下：

①接种aav293细胞至含有dmem培养基的10cm培养皿中，培养至汇合度为70～90％；

②使用250μl无血清培养基稀释48μlultra-pei试剂；

③使用250μl无血清培养基稀释8μgpaav/d377y-mpcsk9质粒、4μgpaav-rc8质粒和4μgphelper质粒，得到质粒预混液；

④在已稀释的ultra-pei试剂中加入③制得的质粒预混液，室温孵育14～16min，得到dna-脂质体复合物；

⑤将dna-脂质体复合物加入①制得的细胞培养液中；

⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含腺相关病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，制得表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒。

根据本发明优选的，所述第三步中，背部皮下植入采用angii微渗透压泵。

根据本发明优选的，所述第三步中，高脂饮食中含有不低于如下百分含量的营养成分：脂肪16％、胆固醇1.25％、胆酸盐0.5％。

有益效果

本发明利用前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)为分泌型丝氨酸蛋白酶，可与低密度脂蛋白胆固醇受体(ldlr)结合并将其内化引导至溶酶体降解，抑制其再循环到肝细胞表面，从而减弱肝脏代谢血浆的低密度脂蛋白胆固醇(ldl)能力，通过pcsk9基因的增义突变(mpcsk9的377位点天冬氨酸(d)突变为酪氨酸(y))可以减少肝细胞表面可循环使用的ldlr数量，上调ldl水平导致高胆固醇血症，最终导致严重的心血管疾病，成功建立了腹主动脉瘤动物模型，极大降低了动物模型的制备成本，缩短了制备时间。

附图说明

图1为解剖拍照检测不同组的腹主动脉瘤的成瘤结果照片；

图2为统计不同组的成瘤率和最大腹主动脉直径的柱状图。

具体实施方式

下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

以下实施例中所使用的paav-mcs质粒购自cellbiolabs公司，酶切反应采用thermo限制性内切酶。

axyprepdna凝胶回收试剂盒购自axygen公司。

pcr反应采用takara公司的primerstarhsdnapolymerase。

axypreppcr清洁试剂盒购自axygen公司。

t4dna连接酶和快速连接试剂盒购自neb公司。

突变试剂盒iisite-directedmutagenesiskit购自stratagene公司。

感受态大肠杆菌细胞购自tiangen公司。

质粒小量dna提取试剂盒购自axygen公司。

paav-rc8质粒和phelper质粒购自addgene公司。

ultra-pei转染试剂盒购自好芝生物公司。

aav293细胞购自上海极威生物科技有限公司。

dmem培养基购自invitrogen公司。

实施例1

一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法，步骤如下：

第一步，paav/d377y-mpcsk9载体的构建：

1)将paav-mcs质粒经内切酶ecori和内切酶hindiii双酶切，制得paav-mcs酶切产物；

所述双酶切反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积30μl；

双酶切反应条件：37℃水浴2小时。

2)将paav-mcs酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收4700bp的dna片段，采用axyprepdna凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后的paav-mcs酶切产物；

3)以小鼠肝脏cdna为模板，经pcr扩增，采用axyprepdna凝胶回收试剂盒纯化，制得mpcsk9dna片段；

pcr扩增的特异引物核苷酸序列如下：

正向引物：5’gaattcatgggcacccactgctctgcgtgg3’；

反向引物：5’aagctttcactgaacccaggaggcctttgc3’；

pcr反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积50μl；

反应条件：98℃变性15sec，56℃退火15sec，72℃延伸2min，34cycles。

制得的mpcsk9dna片段长度为2000bp。

所述小鼠肝脏cdna采用如下方法制备：

a、取新鲜小鼠肝组织置于ep管中，加入200μltrizol充分研磨后，补加800μltrizol，混匀；

b、加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，4℃12000rpm离心15min；

c、将上层水相移至洁净ep管中，加入500μl异丙醇颠倒混匀；

d、4℃、12000rpm离心10min；

e、弃水相，ep管开盖干燥，溶于50μldepc水中；

f、进行反转录反应，制得小鼠肝脏cdna；反转录反应体系如下，总体积10μl：

反转录反应条件：37℃15min，85℃5sec。

4)将步骤3)制得的mpcsk9dna片段经内切酶ecori和内切酶hindiii双酶切，制得mpcsk9酶切产物；

所述双酶切反应体系如下：

加灭菌超纯水至体积30μl；

双酶切反应条件：37℃水浴2小时。

5)将mpcsk9酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收含2000bp大小的dna片段，采用axyprepdna凝胶回收试剂盒纯化，得到纯化后的mpcsk9酶切产物；

6)将步骤2)纯化后的paav-mcs酶切产物和步骤5)纯化后的mpcsk9酶切产物进行连接，连接采用t4dna连接酶和快速连接试剂盒，制得连接产物；

7)将步骤6)制得的连接产物转化大肠杆菌，经抗性筛选和测序验证后，制得提取质粒paav/mpcsk9，然后利用stratagene的iisite-directedmutagenesiskit将mpcsk9的377位点天冬氨酸突变为酪氨酸，经dpn1内切酶酶切，抗性筛选和测序验证后，制得提取质粒paav/d377y-mpcsk9；

所述mpcsk9的377位点天冬氨酸突变为酪氨酸的反应特异引物核苷酸序列如下：

正向引物：5'-gaagcatgtgctgcaataactggacgctccgatgatgtc-3'；

反向引物:5'-gacatcatcggagcgtccagttattgcagcacatgcttc-3'；

反应体系如下，体系总体积50μl：

反应条件：95℃30sec，55℃1min，68℃7min，16个循环。

所述dpn1内切酶酶切条件为：1μldpn1内切酶，37℃水浴1小时。

第二步，制备表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒：

将提取质粒paav/d377y-mpcsk9和辅助质粒paav-rc8、辅助质粒phelper，在ultra-pei试剂条件下，共转入aav293细胞，提取质粒paav/d377y-mpcsk9：辅助质粒paav-rc8：辅助质粒phelper的质量比为2:1:1，转染后收集病毒，经超离心纯化，同时测定病毒滴度，制得表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒；具体步骤如下：

①接种aav293细胞至含有dmem培养基的10cm培养皿中，培养至汇合度为70～90％；

②使用250μl无血清培养基稀释48μlultra-pei试剂；

③使用250μl无血清培养基稀释8μgpaav/d377y-mpcsk9质粒、4μgpaav-rc8质粒和4μgphelper质粒，得到质粒预混液；

④在已稀释的ultra-pei试剂中加入③制得的质粒预混液，室温孵育14～16min，得到dna-脂质体复合物；

⑤将dna-脂质体复合物加入①制得的细胞培养液中；

⑥转染后培养24、48、72h，分别收集富含腺相关病毒颗粒的上清液，上清液通过超离心浓缩病毒，制得表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒。

⑦第三步，病毒感染获得腹主动脉瘤疾病动物模型：

将8周龄的c57bl/6小鼠经尾静脉注射1.0×10¹¹拷贝数的表达d377y-mpcsk9的腺相关病毒，同时背部皮下植入1.44mg/kg/day的angii微渗透压泵，同时给予高脂饮食三周，即得；

高脂饮食中含有不低于如下百分含量的营养成分：

脂肪16％、胆固醇1.25％、胆酸盐0.5％。

对比例1

直接在c57bl/6小鼠的背部皮下植入angii微渗透压泵(1.44mg/kg/day)三周，没有经尾静脉注射d377y-mpcsk9腺相关病毒。

对比例2

采用传统的制备腹主动脉瘤的方法，即在apoe-^/-小鼠的背部皮下植入angii微渗透压泵(1.44mg/kg/day)四周。

实验例

将实施例1中的经尾静脉注射d377y-mpcsk9腺相关病毒的c57bl/6小鼠命名为pcsk9组，对比例1中进行实验的没有经尾静脉注射d377y-mpcsk9腺相关病毒的c57bl/6小鼠命名为c57组，对比例2中进行实验的apoe-^/-小鼠命名为apoe-^/-组。c57组、apoe-^/-组和pcsk9组进行实验的小鼠各为30只。

采用解剖方法检测各组小鼠腹主动脉瘤的成瘤情况，得到的结果如图1和图2所示。c57组小鼠没有形成腹主动脉瘤，apoe-^/-组小鼠的成瘤率约60％，而pcsk9组小鼠的成瘤率约90％。此外，pcsk9组小鼠形成的腹主动脉瘤直径大于apoe-^/-组小鼠(*p<0.05，表示有统计学差异)。

上述结果表明：经尾静脉注射d377y-mpcsk9腺相关病毒的c57bl/6小鼠在angii作用下可以形成明显的腹主动脉瘤，效果要比传统的利用apoe-^/-小鼠制备的腹主动脉瘤更好。

sequencelisting

<110>山东大学

<120>一种腹主动脉瘤疾病动物模型的制备方法

<160>1

<170>patentinversion3.5

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<212>dna

<213>人工合成

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