一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌的制作方法

本发明涉及一种发酵小分子透明质酸的重组兽疫链球菌，属于生物工程技术领域。

背景技术：

透明质酸是一类高分子黏性聚多糖，当前主要以动物组织提取或微生物发酵法生产，它的生物学功能与其分子量大小密切相关，大分子透明质酸已广泛应用于医学领域和化妆品行业，小分子透明质酸寡糖具有独特的生物学功能在保健和医学领域具有重要的应用前景。

当前制备小分子透明质酸的方法主要集中于物理法和化学法。物理法包括加热、超声波和射线辐射等促使透明质酸随机断裂，虽过程简单，但效率较低，产品稳定性较差。化学法主要为水解和氧化降解两类，易引入化学试剂污染，反应条件复杂，不仅对透明质酸的性质产生影响，对纯化造成困难，也会产生大量工业废水。此外，也有报道采用从头合成透明质酸寡糖，但该方法存在底物昂贵、步骤繁琐、合成效率很低等诸多问题，难以实现寡糖的大量制备。

相比于以上方法，酶法催化降解是一种最具前途的方法，近几年，微生物来源的透明质酸裂解酶实现了异源重组表达并用于体外酶法水解制备小分子透明质酸实验，然而对其水解机制和产物分析发现，细菌裂解酶催化水解过程中采取连续的外切裂解模式，从还原端向非还原端逐一释放出不饱和的双糖单位直至一条链被完全降解，这种水解机制导致水解产物的分子量分布范围广，难以有效获得分子量较集中的寡糖产物，特别是透明质酸的结构还发生了变化。此外，对商品化的牛睾丸透明质酸酶(bth)在体外进行透明质酸降解过程分析发现，终产物的分布范围广(从4-52个双糖单位)，并且bth存在转糖苷活性以至于难以获得分子量比较单一的终产物，事实上，bth酶活较低、价格昂贵，而其它来源的透明质酸酶的重组表达水平均较低，都不适合于大量发酵生成，导致透明质酸寡糖的制备方法一直存在技术短板。

技术实现要素：

未解决现有技术存在的上述缺陷，本发明以兽疫链球菌为宿主，引入水蛭来源的透明质酸酶基因并进行分泌表达，由于宿主本身基因组上含有合成透明质酸的基因簇，并能产生大分子透明质酸，表达异源基因的重组菌在合成透明质酸并运输至体外的同时不断切割糖链形成小分子透明质酸寡糖，实现微生物发酵直接合成寡糖的效果。

本发明的第一个目的在于提供一种产透明质酸酶的重组兽疫链球菌，以peu308为表达载体，在兽疫链球菌中导入编码来源于水蛭的透明质酸酶基因，诱导表达透明质酸酶。

在本发明的一种实施方式中，所述编码透明质酸酶的基因为hyal，其序列为seqidno.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体上引入信号肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal中的任一种。

在本发明的一种实施方式中，以诱导型启动子pspac启动编码透明质酸酶的基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述兽疫链球菌为s.zooepidemicusatcc39920。

本发明的第二个目的是提供所述重组兽疫链球菌的构建方法，是以peu308为表达载体，在兽疫链球菌中导入编码来源于水蛭的透明质酸酶基因，并将信号肽融合于透明质酸酶的n端，插入到表达载体的pspac启动子和链球菌rbs序列之后。

在本发明的一种实施方式中，以诱导型启动子pspac启动编码透明质酸酶的基因的表达。

在本发明的一种实施方式中，所述兽疫链球菌为s.zooepidemicusatcc39920。

本发明的第三个目的在于提供一种提高重组兽疫链球菌透明质酸酶活的方法，所述方法是在重组兽疫链球菌的表达载体上引入信号肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal中的任一种。

本发明的第四个目的是提供一种应用所述重组兽疫链球菌发酵生产小分子透明质酸的方法，所述方法是将重组兽疫链球菌接种至发酵培养基，在37℃发酵16-20h。

在本发明的一种实施方式中，碳源采用蔗糖，氮源采用酵母粉。

在本发明的一种实施方式中，发酵培养基配方为：蔗糖70g/l，酵母粉20g/l，磷酸氢二钠6.2g/l，硫酸镁2g/l，硫酸钾1.3g/l，硫酸铁5mg/l，微量元素液2.5ml/l；其中微量元素液含氯化钙2g/l，硫酸锰24mg/l，氯化锌46mg/l，硫酸铜19mg/l。种子培养基配方为：蔗糖20g/l，酵母粉10g/l，牛肉膏10g/l，硫酸镁2g/l，硫酸锰0.1g/l，磷酸二氢钾2g/l。

本发明还提供所述重组兽疫链球菌在食品、生物、化工、医药领域制备含小分子透明质酸的产品中的应用。

有益效果：本发明在兽疫链球菌中异源表达来源于水蛭的透明质酸酶，降解兽疫链球菌自身所产透明质酸，获得小分子透明质酸，具有较大的应用优势。首先，本发明选用兽疫链球菌作为表达宿主，其自身基因组上具有编码透明质酸合酶的基因，适合发酵生产透明质酸；其次，利用多种信号肽分泌表达透明质酸酶，并通过比较其酶活，可获得一株产酶最佳的重组菌，从而降解产生具有生物医学活性的小分子透明质酸。本发明能够使摇瓶上透明质酸酶的分泌表达酶活高达21334u/ml，产小分子透明质酸量达到10.6g/l，与对照相比提高了92.7％，分子量为8.34kda，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。

附图说明

图1为表达透明质酸酶的重组质粒的构建示意图；

图2所示为9株重组兽疫链球菌发酵第20h摇瓶上的胞外粗酶活；1.s.zooepidemicushyala；2.s.zooepidemicushyalc；3.s.zooepidemicushyale；4.s.zooepidemicushyalf；5.s.zooepidemicushyalg；6.s.zooepidemicushyalh；7.s.zooepidemicushyall；8.s.zooepidemicushyaln；9.s.zooepidemicushyalo。

具体实施方式

实施例涉及的核苷酸序列信息：

(1)seqidno.1序列信息为来源于水蛭的透明质酸酶编码基因hyal编码序列；

(2)seqidno.2序列信息为信号肽amyx的基因序列；

(3)seqidno.3序列信息为信号肽bpr的基因序列；

(4)seqidno.4序列信息为信号肽npre的基因序列；

(5)seqidno.5序列信息为信号肽oppa的基因序列；

(6)seqidno.6序列信息为信号肽vpr的基因序列；

(7)seqidno.7序列信息为信号肽wapa的基因序列；

(8)seqidno.8序列信息为信号肽yvgo的基因序列；

(9)seqidno.9序列信息为信号肽ywea的基因序列；

(10)seqidno.10序列信息为信号肽yxal的基因序列；

酶活测定方法：以透明质酸为底物，浓度为2mg/ml，用50mmpbs缓冲液(ph7.0)溶解底物。酶活测定的反应体系为1ml，加入经适当倍数稀释的酶液100μl，38℃反应10min后，100℃煮沸1min终止反应。在比色管中加入2mldns试剂和1ml上述反应液，再煮沸10min，通过分光光度计测定在540nm处的吸光值。上述其它条件不变，反应液变为1ml透明质酸溶液，作为测定对照。酶活单位定义为：1ml酶液1h内生成的还原糖量(μg)。

实施例1分泌表达透明质酸酶重组质粒的构建

设计引物hyal-f和hyal-r，采用标准的pcr扩增体系和程序，扩增获取序列如seqidno.1所示透明质酸酶基因hyal。

设计引物amyx-f/amyx-r，bpr-f/bpr-r，npre-f/npre-r，oppa-f/oppa-r，vpr-f/vpr-r，wapa-f/wapa-r，yvgo-f/yvgo-r，ywea-f/ywea-r，yxal-f/yxal-r，分别以质粒pma0911-amyx，pma0911-bpr，pma0911-npre，pma0911-oppa，pma0911-vpr，pma0911-wapa，pma0911-yvgo，pma0911-ywea，pma0911-yxal为模板，采用标准的pcr体系和程序，扩增得到信号肽amyx，bpr，npre，oppa，vpr，wapa，yvgo，ywea，yxal(seqidno.2-10所示)，其中上述信号肽上游引物均引入链球菌rbs序列aaggaggatgt，下游引物均引入与透明质酸酶hyal的n端20bp序列作为重叠区域，并分别与hyal融合形成片段amyx-hyal，bpr-hyal，npre-hyal，oppa-hyal，vpr-hyal，wapa-hyal，yvgo-hyal，ywea-hyal，yxal-hyal。

引物信息如下：5’-3’方向

hyal-f：atgaaagagatcgcggtgac

hyal-r：attagatctttactttttgcacgcttcaa

amyx-f：gcgaagcttaaggaggatgtatggtcagcatccgccgcag

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oppa-r：gtcaccgcgatctctttcatcgcgctcagcacgagagtga

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yxal-r：gtcaccgcgatctctttcatcgcataagcagctgtcggct

将上述片段与载体peu308进行hindiii和bglii双酶切，体系50μl：45μl片段或质粒，5μl10×greenbuffer，2.5μlhindiii酶，2.5μlclai酶。37℃酶切30min后将片段柱纯化。酶切后的质粒经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带。回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μlsolutioni连接酶，16℃连接过夜，转化jm109感受态细胞，挑取单菌落pcr验证，阳性重组子进行测序，比对正确，分别得到重组质粒peua，peuc，peue，peuf，peug，peuh，peul，peun，peuo。

上述构建的9个重组质粒分别电转宿主s.zooepidemicus，方法是在200μl感受态细胞中加入500-1000ng质粒，冰浴10min，将混合体系转移至2mm电激杯中电激，电压设为2.5kv，用1ml冰冷的thyb将混合体系转移至10mlthyb中，冰浴30-60min，在37℃静置培养1h，14℃，6000r/min离心10min，菌体用1mlthyb重悬并涂布于含0.1g/l壮观霉素的抗性平板，筛选获得9个重组兽疫链球菌：s.zooepidemicushyala，hyalc，s.zooepidemicushyale，s.zooepidemicushyalf，s.zooepidemicushyalg，s.zooepidemicushyalh，s.zooepidemicushyall，s.zooepidemicushyaln，s.zooepidemicushyalo。

实施例29株重组兽疫链球菌的摇瓶培养及酶活测定

分别挑取上述构建的9个重组兽疫链球菌菌株及对照菌(转化peu308空质粒)，单克隆接种于5ml种子培养基，置于200rpm37℃培养过夜，然后按10％的接种量转接于250ml三角摇瓶，培养基为发酵培养基，装液量为25ml，置于200rpm37℃培养20h，并加入0.1mmiptg进行诱导。

各取9株菌摇瓶中第20h发酵液样品在5000r/min，4℃离心5min，保留上清，测定上清中的粗酶活。从附图2看出，在诱导型启动子pspac介导作用下，9株重组菌s.zooepidemicushyala，hyalc，s.zooepidemicushyale，s.zooepidemicushyalf，s.zooepidemicushyalg，s.zooepidemicushyalh，s.zooepidemicushyall，s.zooepidemicushyaln，s.zooepidemicushyalo第20h所产透明质酸酶的胞外粗酶活分别为17283u/ml，15485u/ml，10554u/ml，9872u/ml，14397u/ml，3475u/ml，1223u/ml，21334u/ml和684u/ml，而对照菌发酵液上清中几乎未检测到酶活。从该结果可看出，信号肽ywea对透明质酸酶的分泌效果最佳，证明通过筛选可获得透明质酸酶分泌表达良好的信号肽。

实施例3重组兽疫链球菌的透明质酸产量和分子量测定

分别取融合信号肽后的重组菌和对照菌发酵至第20h的发酵液样品，在5000r/min，4℃离心5min，保留上清，并加入3倍体积100％乙醇进行沉淀，混匀后放置30min，再5000r/min离心10min，加入等体积的蒸馏水，于4℃重新溶解沉淀，该纯化步骤重复三次。透明质酸的含量采用bitter-muir咔唑比色法测定，在比色管中加入1ml硼砂硫酸试剂和200μl经一定倍数稀释后的透明质酸样品，混匀并在沸水中煮15min，冷却至室温，再加入50μl咔唑试剂，混匀并再在沸水中煮15min，冷却后测定530nm处的吸光值，根据标准曲线计算产量。测得s.zooepidemicushyaln、s.zooepidemicushyala、s.zooepidemicushyalc、s.zooepidemicushyalg摇瓶发酵透明质酸的产量分别为10.6g/l、9.1g/l、7.9g/l、7.2g/l，而对照菌的产量为5.5g/l，另外，通过hpsec-malls法测定s.zooepidemicushyaln、s.zooepidemicushyala、s.zooepidemicushyalc、s.zooepidemicushyalg发酵第20h时透明质酸的分子量mw分别为8.34kda、11.53kda、23.79kda和36.67kda，而对照菌所产透明质酸分子量为1.01mda，证明兽疫链球菌本身可产大分子透明质酸，经异源表达透明质酸酶后，可在发酵过程中通过糖苷键切割降解大分子透明质酸，大大降低其分子量，形成具有生物医学作用的小分子活性透明质酸。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

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