一种植物乳杆菌E680及其应用的制作方法

本发明涉及一种植物乳杆菌e680及其应用，属于食品微生物技术领域。

背景技术：

乳酸菌(lacticacidbacterialab)是一类能利用碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性菌的通称。是一种兼性厌氧菌，适合在氧含量低或无氧的环境下生长，耐酸，并且对胃中的酸性环境有一定的耐受性，利用同型或异型乳酸进行发酵，对分解蛋白质和脂肪的能力微弱。它在自然界中种类很多，广泛存在于人体和动物肠道、食品、物料及少数临床样品中，不仅是研究分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程的理想材料，在理论上具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等与人类生活密切相关的重要领域应用价值也极高。乳酸菌的特殊生理活性和营养功能正日益引起人们的重视。

植物乳杆菌作为一种益生菌，与人类生活关系密切，是一种常见于蔬果发酵制品、肉类、奶油、青贮饲料中的乳酸菌，能通过胃并定植于肠道发挥益生作用，例如调节肠道菌群、抑制肠道病原菌生长、降低血清胆固醇、增强机体免疫力、提高乳糖消化和抗肿瘤、抗氧化等生理功能，被广泛用于食品发酵、动物饲料、生物防腐剂、医疗保健等领域，具有良好的市场前景。

技术实现要素：

本发明针对以上问题，提供一种植物乳杆菌e680及其应用。

发明目的通过以下方案实现：一种植物乳杆菌e680(lactobacillusplantarume680)于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.14217。

进一步的，菌落形态学特征为：圆形，表面光滑，细密，色白，偶尔呈浅黄；其菌体形态特性为：革兰氏阳性，不生芽孢，圆端直杆菌，单个、成对、短链状。

进一步的，植物乳杆菌e680(lactobacillusplantarume680)的16srdna全序列为序列表所示。

一种植物乳杆菌在制备具有降低胆固醇功能产品中的应用。

进一步的，所述具有降低胆固醇功能的产品为具有降低胆固醇功能的食品、具有降低胆固醇功能的药物、具有降低胆固醇功能的动物饲料、具有降低胆固醇功能的宠物食品、具有降低胆固醇功能的化妆品。

进一步的，所述具有降低胆固醇功能的产品为具有降低胆固醇功能的益生菌产品。

进一步的，所述具有降低胆固醇功能的益生菌产品为具有降低胆固醇功能的药物、具有降低胆固醇功能的食品、具有降低胆固醇功能的保健品、具有降低胆固醇功能的发酵剂、具有降低胆固醇功能的发酵乳、具有降低胆固醇功能的动物饲料、具有降低胆固醇功能的宠物食品、具有降低胆固醇功能的化妆品。

进一步的，所述具有降低胆固醇功能的食品为液体乳、乳粉、奶酪、饮料或糖果；所述具有降低胆固醇功能的保健品为胶囊、压片、固体饮料。

一种植物乳杆菌在制备酸奶发酵剂中的应用。

进一步的，所述酸奶发酵剂由植物乳杆菌e680(lactobacillusplantarume680)、双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和保护剂组成。

进一步的，酸奶发酵剂中植物乳杆菌e680(lactobacillusplantarume680)的活菌数为8.4×10¹²cfu/g~8.6×10¹²cfu/g。

进一步的，发酵剂中保护剂为海藻糖、谷氨酸钠、蔗糖和脱脂乳粉；以重量百分比计，每克发酵剂含有海藻糖4.1%、谷氨酸钠2.8%、蔗糖8%、脱脂乳粉15%。

进一步的，酸奶发酵剂为冻干型直投式发酵剂，用于制备降低胆固醇益生产品的用途。

本发明提供了一株植物乳杆菌e680(lactobacillusplantarume680)，较其他乳酸菌的区别在于此菌生长迅速，能耐受上消化道的强酸和高胆盐环境，产生大量胞外多糖，有效改善胃肠道消化吸收，还能降低血清中胆固醇的含量，为今后益生菌制剂和功能性乳制品开发提供优良菌种。植物乳杆菌e680的发酵上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除自由基。

生物材料保藏

本发明所提供的植物乳杆菌e680（lactobacillusplantarum）于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14217，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1胆固醇含量的标准曲线。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1植物乳杆菌的分离与鉴定

一．菌株的分离

本发明从温州泰顺山区传统发酵泡菜食品的微生物群落中筛选菌株。

分离培养基（bcp培养基）：酵母膏2.5g/l、蛋白胨5g/l、葡萄糖5g/l、溴甲酚紫0.04g/l、琼脂15g/l、ph7.0，121℃灭菌15min。

纯化培养基（mrs培养基）：酵母膏5g/l、蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、kh2po42g/l、乙酸钠5g/l、柠檬酸钠5g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、mnso4·4h2o0.05g/l、吐温801ml、葡萄糖20g/l、琼脂15g/l、ph6.6，121℃灭菌15min。

具体的分离步骤如下：

将采集的泡菜样品置于灭菌的生理盐水试管中，充分震荡后，取1ml，加到9ml灭菌生理盐水中，振荡均匀，依次进行梯度稀释10^-2、10^-3、10^-4，各取0.1ml涂布于bcp固体培养基的平板上，37℃培养48h；挑取产黄圈的单菌落接种于mrs固体培养基上进行培养，反复划线，直至获得纯培养物。将纯化的目标菌株加入20%甘油，-45℃冻存备用。

二．菌株的鉴定

纯培养菌种革兰氏染色阳性，镜检为杆状，过氧化氢酶试验、淀粉水解、吲哚反应、产硫化氢试验均为阴性，采用api50ch（法国梅里埃公司）生理生化试纸鉴定，结果表明该菌株为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum），为极好的鉴定（如表1）。

表1植物乳杆菌e680的生理生化特征

将纯化的目标菌株进行16srdna基因测序鉴定，具体操作如下：用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取目标菌株基因组dna，采用细菌通用引物对27f：5’-agtttgatcmtggctcag-3’，1492r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’)进行16srdna的pcr实验，pcr反应扩增结束后，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳，并凝胶成像，将扩增出单一、清晰条带的菌株用基因测序仪进行测序，结果如seqidno.1所示，在ncbi网站上进行blast序列比对，结果显示该序列与植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）的16srdna序列同源性超过99%。

综合上述结果，确定筛选的e680菌株为植物乳杆菌（lactobacillusplantarum）。

申请人将该菌株命名为植物乳杆菌e680（lactobacillusplantarume680），并已于2017年6月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为cgmccno.14217。

实施例2植物乳杆菌e680的细胞脂肪酸成分

采用美国midi（microbialidentification）公司sherolock全自动细菌鉴定系统对植物乳杆菌e680（lactobacillusplantarume680）进行菌体脂肪酸成分分析。

1.试剂的配制

溶液ⅰ：45g氢氧化钠溶于150ml甲醇及150ml蒸馏水

溶液ⅱ：190ml浓盐酸，275ml甲醇溶于135ml蒸馏水

溶液ⅲ：200ml正己烷与200ml甲基叔丁醚混合均匀

溶液ⅳ：10.8g氢氧化钠溶于900ml蒸馏水

溶液ⅴ：饱和氯化钠溶液

2.提取方法

用接种环挑取适量细菌培养物置于8ml螺口玻璃管中，加入1ml溶液ⅰ，沸水浴5min，取出振荡5-10s，继续沸水浴25min。

待样品冷却后，加入2ml溶液ⅱ，盖严振荡，80℃水浴10min，冰浴冷却。

在冷却的样品管中加入1.25ml溶液ⅲ，快速振荡10min，弃下层水相。在剩余有机相中加入3ml溶液ⅳ和几滴溶液ⅴ，振荡5min，取2/3上层有机相置气相色谱样品瓶中备用。

3.色谱分析

采用hp6890气相色谱仪，配备分流/不分流进样口，氢火焰离子化检测器（fid）及hp气相色谱化学工作站（hpchemstationvera5.05）；色谱柱为ultra-2柱，长25m，内径0.2mm，液膜厚度0.33um；炉温为二阶程序升温：起始温度170℃，5℃/min升至260℃，随后以40℃/min升至310℃，维持1.5min；进样口温度250℃，载气为氢气，流速0.5ml/min，分流进样模式，分流比100:1，进样量2ul；检测器温度300℃，氢气流速30ml/min，空气流速216ml/min，氮气流速30ml/min。

表2植物乳杆菌e680的细胞脂肪酸成分

实施例3植物乳杆菌e680的耐酸和耐胆盐测定

一．耐酸试验

取活化后的植物乳杆菌e680菌悬液5000r/min离心5min，收集菌体，用pbs缓冲液洗涤2次后按2%接种于ph为3.0的mrs液体培养基中，37℃静置培养，每隔30min摇匀一次，分别于0h和3h无菌取样进行活菌计数，以0h样品为对照，计算3h样品菌株的存活率，存活率=（3h时的活菌数/0h的活菌数）×100%。

二．耐胆盐试验

取活化后的植物乳杆菌e680菌悬液5000r/min离心5min，收集菌体，用pbs缓冲液洗涤2次后按2%接种于胆盐浓度为0.3%的mrs液体培养基中，37℃静置培养，每隔30min摇匀一次，分别于0h和3h无菌取样进行活菌计数，以0h样品为对照，计算3h样品菌株的存活率，存活率=（3h时的活菌数/0h的活菌数）×100%。

同时以嗜酸乳杆菌（lactobacillusacidophilus）atcc43121作为对照，进行上述耐酸、耐胆盐性能测定，具体结果见表3。

表3耐酸、耐胆盐性能检测结果

结果如表3所示，与嗜酸乳杆菌atcc43121相比，本发明筛得的植物乳杆菌e680具有很强的耐酸和耐胆盐能力，尤其在ph=3的mrs培养基中的存活率高达120.56%，明显高于对照菌株。实验证明，植物乳杆菌e680具备较高的胃肠道生存能力，在ph=3的强酸环境中不但能存活，还有一定增殖能力。

实施例4植物乳杆菌e680的胆固醇降低能力测定

1.试剂与溶液

甲醇，异丙醇，正己烷，10%氢氧化钾甲醇溶液，胆固醇（浓度为53mg/g的水溶性胆固醇标品），所用有机试剂均为hplc级。

胆固醇贮存液（0.2mg/ml）：准确称取0.1887g胆固醇，异丙醇定容至50ml，超声5-10min，4℃冰箱密封保存。

2.标准曲线绘制

分别吸取胆固醇标准储备液0、1、2、3、4、5ml于10ml容量瓶中，用异丙醇定容。此标准系列工作液浓度为0、20、40、60、80、100μg/ml。将胆固醇的标准工作液注入气相色谱仪中，得到峰面积。以峰面积为纵坐标，以标准系列工作液浓度为横坐标，绘制成标准曲线。

3.样品的准备

取活化后的植物乳杆菌e680菌悬液5000r/min离心5min，收集菌体，用pbs缓冲液洗涤2次，然后将此菌液按2%添加量接种于0.1mg/mlmrs-chol（即mrs-胆固醇，胆固醇含量为0.1mg/ml）培养基中，37℃恒温培养24h。

4.胆固醇提取

将上述发酵液5000r/min离心5min，取上清1ml于螺口试管，加10%入氢氧化钾甲醇溶液2ml（w/v），旋紧试管，于75℃水浴皂化50min，其间每隔10min振荡一次，皂化完成后，冷却，加入2ml水，4ml正己烷（重复萃取一次），漩涡振荡2min，静置10min，分层，取上层正己烷层于新试管中，合并两次萃取的正己烷层共8ml，氮气吹干，1ml异丙醇溶解，过0.45μm滤膜后用于gc检测。

gc仪器分析条件为：色谱柱（hp-5：30m×0.32mm×0.25μm）；柱温为100℃→300℃（以20℃/min升温12min）；进样口温度为250℃，检测口温度为300℃，恒流1.5ml/min，分流比5:1。

同时，以嗜酸乳杆菌atcc43121作为菌株对照，采用上述同样的操作，计算2株菌对胆固醇的降解率。

胆固醇降解率=（初始含量-最终含量）/初始含量×100%。

表4胆固醇降解效果

结果表明：本发明筛得的植物乳杆菌e680对mrs培养基中的胆固醇降解率达到了66.84%，比众多研究报道的对胆固醇降解效果较好的嗜酸乳杆菌atcc43121高8.53%。从而说明植物乳杆菌e680具有优良的胆固醇降解能力。

实施例5植物乳杆菌e680的抗氧化效果

将活化后的植物乳杆菌e680按5%接种量加入mrs液体培养基，37℃恒温培养18h，3000r/min离心15min，分别收集上清液和菌体。

用ph=7.4的pbs缓冲液洗涤2-3次，重悬菌体，然后用超声波冰浴破碎菌体，10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。

采用dpph法测定植物乳杆菌e680的发酵上清液和无细胞提取物的抗氧化活性：各取2ml菌体的发酵上清液和无细胞提取物，分别加入2ml95%的乙醇配制的0.2mmdpph溶液，摇匀后室温黑暗处静置反应30min，用紫外分光光度计测定其在517nm处的吸光度。

dpph清除率(%)=[1−(a1-a2)/a3]×100

a1:样品与dpph混合液的吸光度；

a2:样品与95%乙醇混合液的吸光度；

a3:溶解样品的溶剂与dpph混合液的吸光度。

结果显示：本发明所述植物乳杆菌e680的发酵上清液和无细胞提取物对dpph的清除率分别高达97.42%、62.28%，说明该植物乳杆菌e680的发酵上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除自由基。而发酵上清液的dpph清除效果明显高于无细胞提取物，说明这种由植物乳杆菌e680生长过程中代谢产生的对自由基具有清除作用的多糖类产物主要分布于胞外。

实施例6植物乳杆菌e680在制备酸奶发酵剂中的应用

一．植物乳杆菌e680菌泥的制备

挑取活化的植物乳杆菌e680单菌落接种到100ml无菌的mrs液体培养基中，37℃静置培养18h。将种子液以5%的接种量接种到250ml无菌的mrs液体培养基中，37℃静置培养18h，将菌液移入无菌离心管中，4000r/min离心10min，弃上清，用无菌0.85%生理盐水洗涤菌体，再4000r/min离心10min，弃上清即得植物乳杆菌e680菌泥。

二．冻干菌制剂的制备

分别称取海藻糖4.1g、谷氨酸钠2.8g、蔗糖8g溶于10ml40℃蒸馏水中，采用0.22um微孔滤膜过滤除菌后加入到90ml无菌水中，备用。取脱脂乳粉15g溶于蒸馏水中，得到15%脱脂乳粉溶液100ml，110℃灭菌备用。

将上述制备的菌泥按1:5的比例与保护剂溶液充分混匀，即制得菌悬液。取5ml菌悬液分装入10ml无菌带塞玻璃瓶中，放在-70℃下预冻，2h后取出置于真空冷冻干燥机中冻干，冻干条件为真空度5pa、隔板加热温度20℃、冷阱温度为-55℃，冻干30h后破碎即可。

三．酸奶发酵剂制备

将上述植物乳杆菌e680冻干菌粉与双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌冻干菌粉按1.5:1：1:1进行混料，定量包装即制得酸奶发酵剂产品。

虽然本发明已通过参考优选的实施例进行了描述，但是，本领域普通技术人员应当了解，可以不限于上述实施例的描述，在权利要求书的范围内，可作出形式和细节上的各种变化。

序列表

<110>浙江一鸣食品股份有限公司

<120>一种植物乳杆菌e680及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1430

<212>dna

<213>植物乳杆菌e680（lactobacillusplantarume680）

<400>1

tgcaagtcgaacgaactctggtattgattggtgcttgcatcatgatttacatttgagtga60

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