一株乳酸片球菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株乳酸片球菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术：

乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)是益生菌中重要成员之一,大多数为动物的体表和内部黏膜表面的益生菌之一。另外，乳酸片球菌还产酸，可以调节胃肠道菌群，维持肠道微生态平衡。在动物体内对病原微生物有拮抗作用，可竞争性地抑制病原微生物，增强动物机体的免疫功能，产生有益的代谢产物，激活酸性蛋白酶的活性，参与机体的新陈代谢，防止有害物质产生。

目前饲料和畜牧养殖中滥用抗生素、化学合成药物、激素造成了很严重的后果。包括家禽畜产品中激素含量超标，药物残留严重，人在摄入后会损害人体健康，也导致畜禽产品质量下降，导致消费者的不信任和被市场淘汰。另外长期使用抗生素会使细菌耐药性增强、耐药菌株增多，导致难以去除，严重威胁到人类的安全等。世界卫生组织专家认为，畜禽产生的各种抗药性病菌，通过摄入可以传给人，并能产生很难治愈的疾病，危害人类健康。同时，抗生素和合成抗菌药物的大量使用，会让药物残留量增加，菌株耐药性增强，动物的免疫力受到影响，容易被感染。而乳酸片球菌作为益生菌具有较好的抗逆性和抑菌特性，可以抑制病原微生物。对人体无害，可作为动物饲料的添加剂，被称为是一种绿色新型饲料添加剂。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是提供一株乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)dy5，已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为pediococcusacidilacticidy5，保藏编号为cctccm2017280，保藏地址为中国，武汉，武汉大学。

本发明的第二个目的是提供一种菌剂，所述菌剂含有所述乳酸片球菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂是将乳酸片球菌菌体的活细胞，冷冻干燥后得到活菌数≥10⁹cfu/g的乳酸片球菌干菌体。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂还含有按质量计3～6％脱脂乳，2～4％海藻糖，和2～5％谷氨酸钠。

在本发明的一种实施方式中，所述菌剂还含有按质量计5％脱脂乳，3％海藻糖，3％谷氨酸钠。

本发明的第三个目的是提供一种动物饲料，所述饲料包括所述乳酸片球菌和饲料载体。

在本发明的一种实施方式中，所述动物饲料中乳酸片球菌的含量为2.3×10⁸cfu/g饲料。

在本发明的一种实施方式中，所述饲料的制备方法为：(1)将饲料载体粉碎；(2)将乳酸片球菌菌剂和乳酸片球菌菌液同时添加到饲料载体中，搅拌均匀；(3)控制饲料中的含水量为60％～70％；(4)将上述原料密封，20～25℃发酵2～3周。

在本发明的一种实施方式中，以1～5g菌粉/kg饲料载体的比例加入乳酸片球菌菌剂，以1～5ml/kg的比例加入乳酸片球菌菌液。

在本发明的一种实施方式中，所述菌液在mrs培养基中于35～37℃培养20～28h制得。

本发明的第四个目的是提供一种产多种有机酸的方法，所述方法是将所述乳酸片球菌接种至发酵培养基中，在30～37℃条件下培养16～36小时。

本发明还提供所述乳酸片球菌在食品、医药、生物领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备饲料或保健食品。

有益效果：1、本发明的乳酸片球菌抗菌谱广，抑菌活性高，对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均具有良好的抑菌活性；2、本发明的乳酸片球菌在50g/l的盐浓度下培养24h仍然能够保持近4.5×10⁹cfu/ml数量；3、本发明的乳酸片球菌产苹果酸和柠檬酸的产量高出现有技术至少一倍；4、应用本发明的乳酸片球菌制备的微生物菌剂活菌数高于市面上其他产品，且生产工艺比较简单，成本比较低。通过有益菌代替抗生素等对动物饲养有利，也更加绿色健康。

生物材料保藏

本发明的乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)dy5，已于2017年5月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，分类学命名为乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)dy5，保藏编号为cctccm2017280，保藏地址为中国武汉大学。

附图说明

图1是乳酸片球菌生长曲线；

图2是乳酸片球菌生长过程中ph变化曲线。

具体实施方式

实施例1：菌株的筛选

1培养基：mrs培养基(g/l)：蛋白胨10.0，牛肉膏8.0，酵母粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，柠檬酸三铵2.0，乙酸钠5.0，七水硫酸镁0.58，四水硫酸锰0.25，吐温801ml，蒸馏水1l，115℃灭菌20分钟

2筛选：该菌株分离自无锡欧尚超市购得酸菜，将酸菜先置于mrs培养基37℃培养24小时，用无菌水将培养液分别进行100,1000倍稀释，取100μl涂布于mrs固体培养基,37℃培养24小时,通过划线分离获得的一株乳酸菌株。其微生物学特征是革兰氏染色典型阳性，菌体为中等大小，培养基上菌落为乳白色，表面光滑湿润，隆起。有一种奇特的酸香的味道。

3：菌株的鉴定：将筛选出来的菌种涂布于mrs平板上，挑取单菌落利用通用引物1492r和27f进行扩增，将扩增产物交由生工生物工程(上海)有限公司进行16srrna测序，序列所得结果通过ncbi的nucleotideblast与genbank中的模式菌株进行同源性比对。比对结果显示与genbank中相关模式菌株的16srna有99％的相似性(其序列如seqidno.1所示)，确定该菌株为乳酸片球菌(pediococcusacidilactici)。

实施例2

乳酸片球菌dy5生理生化特征的鉴定：

(1)石蕊牛奶实验：牛奶中主要含有乳糖和酪蛋白,在其中加入石蕊作指示剂和氧化还原指示剂,石蕊在中性时呈淡紫色酸性时呈粉红色碱性时呈蓝色还原时,则自上而下使牛奶褪色还原为白色。乳酸细菌发酵乳糖产酸,石蕊变红,当酸度很高时,可使牛奶凝固。观察接种和培养后的石蕊牛奶实验结果,37℃培养一天即可观测石蕊牛奶产酸和凝固反应。

(2)过氧化氢酶测定：将实验菌接种于pyg培养基斜面上，37℃培养24h，取培养物，涂在干净的载玻片上，然后在其上滴加5％的过氧化氢，有气泡的则为阳性反应，无气泡为阴性反应。

(3)淀粉水解实验：将菌种接种于含有可溶性淀粉的基础培养基中，37℃培养24h，取少许培养液于比色盘内，同时取未接种的培养液作对照，分别在其中加入卢哥氏碘液。不显色表示淀粉水解，显蓝黑色或蓝紫色时，表示淀粉未水解或水解不完全。

(4)明胶液化实验：将实验菌株接种于含有明胶的基础培养基中，置37℃培养24h，以一支未接种的试管作为对照。将接种的和未接种的对照管置于4℃冰箱中，等待对照管凝固后记录实验结果，反复观察对比多次。如对照管凝固时，接种管液化为阳性反应，凝固为阴性反应。

(5)v-p实验：将实验菌接种于pyg培养基中，37℃培养24h，取培养液在其中加入茶酚和氢氧化钾，置于不加盖的试管中混合，并陆续振荡30分钟，显示红色为阳性反应。

(6)葡聚糖实验：将新鲜的培养物接种于含有蔗糖的培养基斜面上，37℃培养24h。斜面上培养物形成粘稠的菌苔，表明产生葡聚糖，为阳性反应,否则为阴性反应。

(7)硫化氢实验：将新鲜的培养物接种于含有半胱氨酸或胱氨酸的培养基中,用无菌的镊子夹取一乙酸铅滤纸条悬挂于接种试管内，下端接近培养基表面而不接触液面，上端用棉塞塞紧，实验中设空白对照，在没接种的试管培养基上悬挂乙酸铅纸条，置于37℃培养24h，进行观察比较，纸条变黑色为阳性反应。

(8)葡萄糖产气：在1升py基础培养基内加入20g葡萄糖和0.5％的吐温80，再添加6g琼脂和的溴甲酚紫作指示剂,分装试管。把菌液滴加入上述融化的培养基中,充分混匀,再在上面加一层7mm厚的的琼脂,置37℃培养24h。软琼脂柱内有气泡或出现将的琼脂层向上顶的现象，表示产气。

(9)精氨酸产氨：接种新鲜的实验菌种于含精氨酸的培养基中,并同时接种不含精氨酸的培养基作对照，置37℃培养一天，取少许培养液于比色盘中，加奈氏试剂数滴,当产氨时会出现橙黄或黄褐的沉淀。含精氨酸培养液与试剂的反应强于对照液才能是阳性反应。

(10)糖发酵实验：将需要测定的糖或醇类等碳水化合物加入基础培养基中，分别分装到5ml试管。37℃，振荡培养24h。检测时取培养液少许置于比色盘内，同时取未加碳水化合物的培养液作为对照，滴加btb-mr试剂比较颜色的变化，记录产酸的强弱。

dy5菌株的生理生化特性见表1～2，为石蕊牛奶、v-p实验阳性，淀粉水解、过氧化氢酶、硫化氢实验、葡聚糖、葡萄糖产气、精氨酸产氨、明胶液化呈阴性。能发酵利用麦芽糖，鼠李糖，d-半乳糖，甘露糖，阿拉伯糖，蔗糖，可溶性淀粉产酸，产气。

表1乳酸片球菌dy5的生理特性

注：“-”表示阴性，“+”表示阳性。

表2乳酸片球菌dy5糖发酵结果

注：“+”表示强发酵，“d”表示略微发酵。

实施例3

指示菌菌液的制备：将大肠杆菌、沙门氏菌和金黄葡萄球菌三种指示菌接种于lb液体培养基，37℃培养24h。

采用牛津杯法：取直径约90mm的平板，分别倾注加热融化的营养琼脂培养基18-20ml，使其在平板内均匀摊布，放置水平台面上使凝固，作为底层。另取半固体营养琼脂培养基(琼脂含量为1％)适量加热融化后，放冷至48-50℃，每50-100ml培养基加入指示菌菌悬液0.1-0.2ml(菌浓为10⁸cfu/ml)，在每1个平板中分别加入5ml，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。在每1平板中以等距离均匀安置牛津杯4个备用，每个双层平板中的牛津杯中分别滴装200μl乳酸菌上清液，37℃培养18h后，测量各抑菌圈直径(或面积)，结果如表3所示。

表3乳酸片球菌dy5抑菌效果

实施例4乳酸片球菌微生物菌剂的制备

(1)将乳酸片球菌原始菌种按照1％的接种量接种到mrs培养基，37℃活化24h，按照同样的方式活化2-3代，继续于mrs培养基中培养，得到乳酸片球菌的菌液。

(2)冻干保护剂配方：将脱脂乳、海藻糖，谷氨酸钠分别按照5％，3％，3％的质量分数添加，并加蒸馏水溶解，得到溶液115℃灭菌15分钟，并放在4℃保存。

(3)乳酸菌菌液的制备：将原始乳酸片球菌菌株，放入mrs液体培养基37℃活化24h，按照上述步骤活化2次，再在mrs液体培养基37℃培养24h获得发酵液。培养过程的生长曲线和ph变化分别如图1～2所示。

按上述方法，分别配制下述三种冻干保护剂(按质量百分比计)：

(a)10％麦芽糊精，5％阿拉伯树胶；

(b)5％脱脂乳，3％蔗糖，3％甘油；

(c)5％脱脂乳，3％海藻糖，3％谷氨酸钠；

(4)将1g乳酸菌菌液加入至20ml冻干保护剂中，将步骤(2)制备的菌液在温度4℃和转速4000rpm/min离心15分钟，去掉上清液，收集所得菌泥。加入冻干保护剂。计活菌数后(cfu/ml)，匀混后放入冰柜预冻12h，然后转入冻干机冻干，然后放入4℃保存。

菌落计数：取菌粉1g，溶解到100ml蒸馏水中，得到稀释10^-2的混悬菌液，在超净工作台内用灭菌的1.5ml离心管，按10倍比稀释法稀释。用移液器吸取上述混悬液100ul，注入含有900ul蒸馏水的离心管内，并在液体中反复吹打5次，振荡混匀(注意每次稀释时更换枪头及充分震荡混匀)。按上述步骤逐级稀释，取10^-7，10^-8两个梯度菌悬液100μl滴加到种子培养基平板上，进行涂板，计数菌落。经测定冻干菌粉活菌数达到了8×10⁹cfu/g。

表4不同冻干保护剂配方保护效果

实施例5

使用粗杆类粉碎机将原料豆粕、秸秆按质量比1:1的比例粉碎至2cm±0.5cm后待用。

菌剂制备：将乳酸片球菌原始菌种按照1％的接种量接种到mrs培养基，37℃活化24h，按照同样的方式活化2-3代。得到了乳酸片球菌的菌液。接着在温度4℃和转速4000rpm/min离心15分钟，去掉上清液，收集所得菌泥。接下来加入冻干保护剂(3)。匀混后放入冰柜预冻12h，然后转入冻干机冻干，然后放入4℃保存。

菌液制备：将原始乳酸片球菌菌株，放入mrs液体培养基37℃活化24h，活化2次，再在mrs液体培养基37℃培养24h获得发酵液。

微生物的混合：将乳酸片球菌菌剂和乳酸片球菌菌液同时添加到饲料载体中，以1～5g菌粉/kg饲料载体的比例加入乳酸片球菌菌剂，以1～5ml/kg的比例加入乳酸片球菌菌液，搅拌均匀，原料含水量控制在55～65％。

发酵：将原料加入饲料桶，密封，常温发酵2周，制得含有乳酸片球菌的饲料。

国内发酵饲料主要以酵母菌，芽孢杆菌的好氧发酵，好氧发酵容易产生杂菌污染，且发酵过程产生大量的热和气体，饲料能量损失较大。而乳酸菌厌氧发酵，安全损耗少，且能提高饲料营养价值，改善饲料适口性。本实验以乳酸片球菌发酵制备饲料，过程中产生大量有机酸和小肽。益生菌和这些代谢产物同时作用提高了饲料的安全性和营养价值。参照《q/hzs001—2013发酵生物饲料》的标准对相关指标进行检测，结果如表5，本生物发酵饲料参数均符合生物饲料标准。

表5饲料参数情况

实施例6

将活化三代的乳酸片球菌dy5和乳酸片球菌atcc8042接种至mrs培养基，37℃培养24小时后采用hplc测定发酵液中的有机酸含量。结果如表5所示。

表5不同乳酸片球菌的有机酸产量(g/l)

结果表明：本次筛选出的乳酸片球菌dy5，相对于对照菌(atcc8042)，在柠檬酸，苹果酸有机酸产量上有很大的提高。苹果酸是很好的稳定剂，有较好的抗氧化能力，在酸性条件下杀菌性很强，能促进氨基酸的吸收。而柠檬酸具有抗氧化、抑制细菌、护色、改进风味、清除有害金属的作用。有机酸在改善饲料品质外，更重要的是能够获得营养上的效果，能促进蛋白质的吸收。本筛选出的乳酸片球菌有机酸谱广，除上述提到的有机酸外还包括琥珀酸，苯乳酸等。且有机酸产量优于同种菌株，能显著改善饲料品质，降低腹泻。

实施例7

配制含有nacl(10g/l，20g/l，30g/l，40g/l，50g/l)的mrs液体培养基，115℃灭菌20分钟备用。以不含nacl的mrs液体培养基作为参照，乳酸片球菌活化多次，以2％(v/v)的接种量接入上述培养基，37℃培养24小时，取样，测定不同浓度菌落变化。

表6不同乳酸片球菌耐高盐特性(单位cfu/ml)

结果表明：上述两种乳酸片球菌在高盐环境下均能存活，而筛选出的dy5菌株耐高盐特性更优，在50g/l的盐浓度下依然保持了近4.5×10⁹cfu/ml的活菌数。因此，当饲料中的乳酸片球菌dy5进入胃肠道时，其对胃肠环境有极好的耐受性，能够更好维持肠道健康。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种乳酸片球菌及其应用

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>956

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggcttggggggcgtgctatacatgcaagtcgacgaacttccgttaattgattatgacgtg60

cttgcactgaatgagattttaacacgaagtgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggt120

aacctgcccagaagcaggggataacacctggaaacagatgctaataccgtataacagaga180

aaaccgcctggttttcttttaaaagatggctctgctatcacttctggatggacccgcggc240

gcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgatgatgcgtagccgacctgaga300

gggtaatcggccacattgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtag360

ggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtt420

tcggctcgtaaagctctgttgttaaagaagaacgtgggtgagagtaactgttcacccagt480

gacggtatttaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtag540

gtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggtcttttaagtct600

aatgtgaaagccttcggctcaaccgaagaagtgcattggaaactgggagacttgagtgca660

gaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacacc720

agtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcg780

aacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgattactaagtgttggaggg840

tttccgcccttcagtgctgcagctaacgcattaagtaatccgcctggggagtacgaccgc900

aaggttgaaactcaaaagaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggg956