一种反义长链非编码RNA在制备基因治疗剂方面的应用的制作方法

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种反义长链非编码rna在制备基因治疗剂方面的应用。

背景技术：

天然反义rna(naturalantisensetranscripts,nats)是在多个物种中表达的rna分子，可与正义rna进行互补配对形成天然双链rna，通过不同的机制调控正义基因的表达。天然反义rna在细胞增殖、分化等过程中起重要调控作用，与肿瘤、心血管等疾病密切相关。目前为止，人们对反义rna及其功能的研究还只是一隅之见，但已为科研者对于基因表达和肿瘤的发生机制开拓了新的视野。

肌细胞增强因子2(myocyteenhancerfactor2,mef2)是一种转录因子，调节骨骼肌细胞、免疫细胞中多个基因的转录。mef2d为mef2家族中的一员，它在细胞的存活与分化方面有非常重要的作用。有研究表明，mef2d不仅能促进vegf信号通路的活化，对细胞的增殖能力也有一定的提高，对肝细胞癌(hcc)的发生发展有着重要作用。

由于人们对肝癌与反义rna关系的高度关注，越来越多与肝癌相关的反义rna被发现并深入研究；与此同时，它们在肝癌中的作用机制将逐渐被丰富，有望帮助人们对肝癌的发生、发展做进一步的了解，并期待在肝癌的预测、诊断、预后和治疗中有新的突破。

本发明通过对hepg2肝癌细胞双链rna文库进行研究，得到一种mef2d反义rna，其对mef2d基因的表达有明显的抑制作用，命名为mef2d-as。

技术实现要素：

本发明提供一种反义长链非编码rna(命名为mef2d-as)，其特征在于mef2d-as的cdna序列具有seqidno：1所示的核苷酸序列。

本发明提供一种试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括mef2d基因的正、反义特异性引物：5′-ttaccagttgaccagtgcag-3′和5′-ttgccaggcagtgacatt-3′。

本发明的另一实施方案提供上述mef2d基因的正、反义特异性引物在制备检测肝癌细胞hepg2中mef2d-as表达量试剂盒中的应用。

本发明提供2条特异性引物：

3’gsp：5′-tgagagatacagggaccaggtggga-3′

5’gsp：5′-tcctccttaccagcctttagttcacct-3′。

本发明的另一技术方案提供上述特异性引物3’gsp和5’gsp在测定mef2d-as全长序列中的应用。

本发明提供一种测定mef2d-as全长序列的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)总rna的提取；

(2)以3'cdsprimer为特异性逆转录引物对总rna进行特异性逆转录，合成第一链cdna后，以特异性引物和试剂盒引物进行pcr扩增以获得mef2d-ascdna3'端，即3'-race(3'-端扩增产物)；

(3)以5'cdsprimer为特异性逆转录引物对总rna进行特异性逆转录，以特异性引物和试剂盒引物进行pcr扩增以获得mef2d-ascdna5'端，即5'-race(5'-端扩增产物)；

(4)将步骤(3)、(4)所有获得的3'-race和5'-race片段均克隆到pgem-teasy载体中，进行序列测定，经测序确定3'-race片段长度为800bp，5'-race片段长度为662bp；

(5)用dnamanv6软件拼接得到长度为1265bp的rna，通过blast发现mef2d-as基因转录起始于mef2d的第8个内含子第100位碱基的反义链配对碱基，完全与mef2d第8个外显子重叠(241bp)。

其中步骤(1)中总rna的提取可按照trizol^tm试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总rna的提取方法进行提取；步骤(2)所述的特异性引物为3’gsp(5′-tgagagatacagggaccaggtggga-3′)，试剂盒引物为upmlongprimer(5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′)和upmshortprimer(5′-ctaatacgactcactatagggc-3′)；步骤(3)所述的特异性引物为5’gsp(5′-tcctccttaccagcctttagttcacct-3′)和smarteriiaoligonucleotide(5′-aagcagtggtatcaacgcagagtacatggg-3′)，试剂盒引物为upmlongprimer(5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′)和upmshortprimer(5′-ctaatacgactcactatagggc-3′)。

上述步骤(5)后，可通过设计特异性逆转录引物，合成cdna后，进行pcr扩增，pcr产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定和dna序列测定，测序结果如seqidno：1所示的核苷酸序列。所述特异性逆转录引物序列如下：

gsp：5′-ggtggtttttaaaaatagtgttgaac-3′

反向引物：5′-ctcttggtcggatgcggt-3′

正向引物：5′-cagagggggtgagtgacagaa-3′。

本发明提供一种检测肝癌细胞hepg2中mef2d-as表达量的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)设计mef2d基因的正、反义特异性引物：5′-ttaccagttgaccagtgcag-3′和5′-ttgccaggcagtgacatt-3′；

(2)总rna的提取；

(3)以步骤(1)设计的特异性引物对步骤(2)得到的rna进行特异性逆转录，而后进行pcr，pcr条件为94℃5min变性；94℃30s，60℃30s，72℃40s(40个循环)；72℃5min延伸；

(4)步骤(3)的pcr结果采用graphpadprism5软件进行分析得到肝癌细胞hepg2中mef2d-as表达量。

其中步骤(2)中总rna的提取可按照trizol^tm试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总rna的提取方法进行提取。

本发明的另一实施方案提供一种基因治疗剂，其特征在于该基因治疗剂通过增加上述反义长链非编码rna(mef2d-as)的表达来发挥作用。进一步该基因治疗剂通过增加反义rna(mef2d-as)的表达，降低相应正义rna(mef2d-s)的表达来发挥作用。

本发明的另一实施方案提供所述反义长链非编码rna(mef2d-as)在制备以mef2d-as为靶点的药物中的用途。

本发明的另一实施方案提供所述反义长链非编码rna(mef2d-as)在制备药物中的用途，其特征在于所述药物的作用靶点为mef2d-as，具体是通过提高mef2d-as的表达，下调mef2d的表达，来发挥作用的。

本发明提供一种dna甲基化酶抑制剂在制备治疗肝癌药物中的应用，其特征在于所述dna甲基化酶抑制剂是通过提高反义rna(mef2d-as)的表达，从而下调癌相关基因mef2d，进而抑制肝癌细胞增殖，来发挥作用的。

本发明中涉及引物的设计合成，均是根据genebank或其他分析结果中基因序列的特点，借助primerprimer5.0软件进行设计，送公司进行合成。

附图说明

图1pcr产物(mef2d-as)的琼脂糖凝胶电泳图(m.2000bpdnamarker；rt.特异性逆转录；+.加反转录酶；-.不加反转录酶)

图2mef2d-asrace的琼脂糖凝胶电泳图(m.4500bpdnamarker；5’race.5’端扩增产物；3’race.3’端扩增产物)

图3ucscgenomebrowser比对结果图

图4mef2d-as基因开放阅读框预测图

图5hepg2肝癌细胞经5-aza-dc处理后mef2d基因正反义rna表达的改变图

具体实施方式

本发明使用的实验材料与设备如下：

实验细胞

人肝癌细胞系hepg2，来自扬州大学表观遗传学实验室细胞库。用dmem高糖培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)培养37℃培养箱内中。

细胞处理

用dmem完全培养基(含10％胎牛血清、1％双抗)，在5％co2、37℃培养箱内常规培养hepg2。5-aza-dc的干粉储存于-70℃冰箱内，现配现用。配制：用二甲基亚砜(dimethylsulfoxide，dmso)溶解5-aza-dc干粉，配成浓度为1mm的工作液。取对数生长期的hepg2细胞，按20-30％的细胞量接种于培养皿，培养24h。实验组细胞(5-aza-dc处理的hepg2细胞)，10ml培养基加5-aza-dc至终浓度5μm，培养48h，24h换液一次。对照组细胞加同体积dmso(替代实验组中的5-aza-dc)，培养48h，同样24h换液一次。

主要试剂

主要设备

实施例1mef2d-as全长序列的测定

(1)总rna提取

总rna的提取可按照trizol^tm试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总rna的提取方法进行提取癌细胞hepg2的总rna。

(2)以3'–fullracecoreset试剂盒提供的3'cdsprimer(见下表)为特异性逆转录引物对总rna进行特异性逆转录，合成第一链cdna。以特异性引物3’gsp和试剂盒引物upmlongprimer和upmshortprimer进行pcr扩增以获得mef2d-ascdna3'端，即3'-race(3'-端扩增产物)。

(3)以5'cdsprimer(见下表)为特异性逆转录引物对总rna进行特异性逆转录，以特异性引物5’gsp和smarteriiaoligonucleotide和试剂盒引物upmlongprimer和upmshortprimer进行pcr扩增以获得mef2d-ascdna5'端，即5'-race(5'-端扩增产物)。

(4)所有获得的3'-race和5'-race片段均克隆到pgem-teasy载体中，由金唯智公司进行dna序列测定，经测序确定3'-race的片段长度为800bp，5'-race的长度为662bp。

(5)用dnamanv6软件拼接得到长度为1265bp的rna。通过blast发现mef2d-as基因转录起始于mef2d的第8个内含子第100位碱基的反义链配对碱基，完全与mef2d第8个外显子重叠(241bp)。

cdna末端快速扩增技术(rapidamplificationofcdnaends,race)引物序列

具体步骤如下：

(1)3'末端快速扩增技术

通过3’-race实验确定反义rna的转录起始位点和终止位点。使用smartertmracecdnaamplificationkit(clontech)进行该实验，实验步骤如下：

1)用trizol法提取细胞总rna，溶于depc水中，对实验组的rna，用3'cdsprimera特异性引物合成cdna。引物序列见上表。实验中所涉及rna操作过程，使用的器皿均是无rnase的。操作过程中涉及的溶液均是用depc水配置的，操作过程中配戴手套和口罩，以防rna被污染，保证rna完整性。

2)制备race-readycdna

①将以下试剂分别加至不同pcr管，混匀并瞬时离心。反应体系见表3.2

表3.23’race-readycdna反应体系

②将pcr管放入pcr仪进行变性，孵育72℃3min，冷却42℃2min。离心，14,000g×30sec。

③准备2.5份buffermix，混匀以下试剂(表3.3)，室温放置待用：

表3.3试剂混合体系

④在室温条件下，向3’race反应管中加入以下试剂(表3.4)，轻轻混匀，瞬时离心。

表3.4试剂混合体系

⑤在pcr仪上42℃孵育90min，70℃加热10min。

⑥加100μl高压过后的ddh2o稀释所得cdna，分装，用于后续实验，其余的放于-20℃冰箱保存。

3)3’racepcr反应，反应体系见表3.5，pcr仪反应程序见3.6

表3.53’racepcr反应体系

表3.6pcr程序设置

(2)5'末端快速扩增技术

通过5’-race实验确定反义rna的转录起始位点和终止位点。使用smarter^tmracecdnaamplificationkit(clontech)进行该实验，实验步骤如下：

1)用trizol法提取细胞总rna，溶于depc水中，对实验组的rna，用5'cdsprimera特异性引物合成cdna。引物序列见上表。实验中所涉及rna操作过程，使用的器皿均是无rnase的。操作过程中涉及的溶液均是用depc水配置的，操作过程中配戴手套和口罩，以防rna被污染，保证rna完整性。

2)制备race-readycdna

①将以下试剂分别加至不同pcr管，混匀并瞬时离心。反应体系见表3.7

表3.75’race-readycdna反应体系

②将pcr管放入pcr仪进行变性，孵育72℃3min，冷却42℃2min。离心，14,000g×30sec。

③准备2.5份buffermix，混匀以下试剂(见表3.8)，室温放置待用：

表3.8试剂混合体系

④向200μl无酶离心管中加入1μlsmarteriiaoligo，震荡混匀，瞬时离心。

⑤在室温条件下，向3’race无酶离心管中加入以下试剂(表3.9)，轻轻混匀，瞬时离心。

表3.9试剂混合体系

⑥将混合样品放入pcr仪上42℃孵育90min，70℃加热10min。

⑦加100μl高压过后的ddh2o稀释所得cdna，分装，放于-20℃冰箱保存。

3)5’racepcr反应，反应体系见表3.10，pcr仪反应程序见3.11

表3.105’racepcr反应体系

表3.11pcr程序设置

(3)对3'-race和5'-race进行电泳检测

配制1-2％琼脂糖凝胶及电泳缓冲液，取10μlpcr扩增产物跑电泳，4500bpladdermarker为dna分子量标准，80-120v电压，电泳30-60min，当溴酚蓝移动至凝胶2/3时，停止电泳，利用凝胶扫描分析仪拍照(图2)。

实施例2mef2d-as的全长序列测定

mef2d-as的全长序列测定分析：已知mef2d位于x号染色体(chrx(p11.3))，但由于高通量测序时，测序样品为cdna片段，所以mef2d-as的转录起始位点和终止位点并不明确，于是我们进行了5’race和3’race实验以确认mef2d-as的转录起始位点和终止位点。首先设计了特异性针对mef2d-as5’端和3’端的扩增引物，分别以5-aza-dc处理过的肝癌细胞5’racecdna和3’racecdna为模板，用mef2d-as的特异性引物进行pcr扩增。dna电泳结果显示，3’race得到一条800bp左右的条带；5’race得到一条662bp左右。对得到的条带进行dna测序后，我们获得了mef2d-as的5’和3’末端的准确序列，并确认了其转录起始位点和终止位点(图2)。将上述dna测序结果与ucscgenomebrowser数据库中公布的mef2d的序列(其5’和3’末端的序列并不准确)相结合，我们得到了1种剪切形式的mef2d-as的全长序列(图3)。为确认拼接得到的mef2d-as全长序列的准确性，我们根据获得的全长序列设计了特异性扩增引物，进行pcr验证，测序结果与我们的拼接结果一致，全长序列见seqidno：1。我们用orffinder软件对mef2d-as开放阅读框进行预测(图4)，发现此转录子没有明显开放阅读框。由此我们推断其可能是一个长链非编码rna(longnon-codingrna,lncrna)。

实施例3定量rt-pcr检测肝癌细胞hepg2中mef2d-as表达量

(1)设计合成mef2d基因的正、反义特异性引物：5′-ttaccagttgaccagtgcag-3′和5′-ttgccaggcagtgacatt-3′；

(2)分别对实验组和对照组进行总rna的提取；

(3)以步骤(1)设计的特异性引物分别对步骤(2)得到的rna进行特异性逆转录，而后进行pcr，pcr条件为94℃5min变性；94℃30s，60℃30s，72℃40s(40个循环)；72℃5min延伸；同时以β-actin和gapdh作为内参。所有引物列于下表：

(4)采用2-δδct方法对步骤(3)的pcr结果进行数据分析，计算δct＝目的基因ct-内参基因ct，δδct＝δct(处理组)，-δct(对照组)，所得实验数据用graphpadprism5软件进行分析作图，计算p值进行数据分析。

通过定量rt-pcr来检测5-aza-dc处理前后mef2dmrna与mef2d-asrna在肝癌细胞hepg2中的表达情况。结果发现，经dna甲基化酶抑制剂(5-aza-dc)处理，mef2d-as表达量有显著性提高(p<0.01)，而mef2d基因本身的表达则明显下调(p<0.05)(图5)。

hepg2细胞经5-aza-dc处理后，荧光定量分析结果显示，mef2d-as表达量显著提高，而正义mef2dmrna的表达受到了抑制。dna甲基化酶抑制剂明显激活了mef2d-as的表达，表明mef2d-as基因可能受dna甲基化调控。mef2d-as的高度甲基化导致mef2d-as沉默，致使正义基因mef2d的过表达。

上述结果表明，通过增加mef2d-as的表达，降低mef2d基因的表达，可用于抑制肝癌细胞增殖，mef2d-as可作为抗肝癌治疗的新靶点。

本发明提供的反义长链非编码rna——mef2d-as可用于肝癌诊断与治疗。

本发明涉及的总rna的提取可按照trizol^tm试剂说明书中记载的方法进行提取，或按照其他本领域常规的总rna的提取方法进行提取，例如可按照如下方法进行提取：

1)样品处理

取培养皿细胞，弃掉旧培养基。加1mltrizol试剂，用移液枪反复吹打裂解细胞，接着将裂解液移到离心管中；

2)两相分离

室温静置5min，每1ml的trizol试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿(体积比为5:1)，盖紧管盖。涡旋混匀15sec，室温(15-30℃)条件下孵育2-3min。4℃下12,000xg离心15min。离心后ep管中液体将被分为三层，分别是最下面的红色酚氯仿相，白色中的间层和最上面无色水相。所以rna都溶解在上层水相中。上层水相的体积大约是所加入的trizol试剂体积的十分之六。

3)rna沉淀

将上层水相吸入到另一干净1.5ml无酶ep管中。根据每1mltrizol试剂加500μl异丙醇的量加入异丙醇，混合均匀后在室温(15-30℃)条件下孵育10min后，于4℃条件下12,000xg离心20min。离心后，rna将呈白色沉淀位于管底或侧壁。

4)rna清洗

移去上清液，每个1.5ml无酶ep中加入500ul-1000ul的75％无酶乙醇(75％乙醇用depch2o配制)，清洗rna沉淀。混匀后，4℃条件下12,000xg离心5min。rna清洗两次。

5)rna干燥

弃上清乙醇溶液后，4℃离心机瞬时离心，然后用小移液枪将管底部遗留液体吸出，使rna沉淀在室温条件下干燥5-10min。

6)溶解rna沉淀

溶解rna时，加入depc水20μl用移液枪来回吹打几次，使其充分溶解，获得的rna溶液存储于-80℃待用。

7)rna质量检测

使用紫外吸收法检测rna质量。使用depc水调零分光光度计。然后取2μlrna溶液加在测试加样孔进行检测，读取od260nm和280nm处的吸收值，测定rna溶液的浓度以及纯度。

注：本发明中未列出的具体实验方法都属于分子生物学中常规的实验操作，是本领域技术人员应掌握的基本技能，可参见本领域教科书或是发明人在先发表的类似的论文。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种反义长链非编码rna在制备基因治疗剂方面的应用

<130>2017

<160>1

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1265

<212>cdna

<213>人肝癌细胞系hepg2

<400>1

gtacatgggataaaaacagagggggtgagtgacagaacaagtgataggacaccagacaga60

aagtgagagagaacaagaggatgagaatatgggggatggggtgttggggagaggcaattg120

gatggagagtgatcagaagagggtcgaatgaagggaagagaagggaaataagaaatatta180

gttctctttccatcccatgtcatcttctgcaacacagggccccccacctcccacccccta240

ccctggggctggctctcagaaggggttcagggtgagcctcttgggtctgtacaagagagc300

ccaggggtgccactgttgcctaacagactgtgcagtgcacagcctcataggatgtccact360

agaaccctgcagggaacccagctcccaagaggtccctcctcttcccgttcaattctccct420

tcccacacactcacatgcagtctccccaggactcacatgaggttgctgagagatacaggg480

accaggtgggactgttgtgaggtggctgttgcggctgctgaggctgctgtggctgtggct540

gctgtggctgcggtggctgctgctgtggaggctgtggctgctgcggctgctggggctgct600

gtggctgttgccaggcagtgacattgcctagcgacagccccccaggtgaactaaaggctg660

gtaaggaggagagctctgcactggtcaactggtaatctgcatggaggaaaagtgaggatg720

aacctggagttggggagagcacacaggctcctatgagggagctgcctccaggaggactgt780

ggggatgaggggacagggagtgtgtaatgacagatgtaaggaattcaagaagaccacaaa840

aattcagtgaagacggtactcagagttaaagaaacctaagtcataataaccatgaggtgc900

tgtgttttaacaggatgaaaagatgtggtttttgttttgttttgtttttttgagatggag960

tctcactctattgcccaggctggagtgcagtggtgtgatcttggctcactacaacctctg1020

cctcccacgttcaagcaaatctcctgcctcggcctcctaaatggctgggattacaggcac1080

atgccaccacgcccagctaatttttgtatttttagtagagatggggttttgccatgctgg1140

caaggctggtctcaaactcctgacctcaagtgattcgcccacctcggcctcccaaagtgc1200

tgggattacaggcatgagccaccgcatccgaccaagaggtggtttttaaaaatagtgttg1260

aactt1265