本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种基于kasp检测β-酪蛋白基因型的方法。
背景技术：
a2β-酪蛋白是现代乳牛β-酪蛋白的天然原型。基于a2β-酪蛋白制成的配方奶粉,可能与母乳更接近，更有利于促进婴幼儿的生长发育。而且，a2奶已经对澳大利亚、英国及美国等国家的奶业产生重大影响，对于奶牛育种者来说，构建a2核心群是最具成本效益的。
β-酪蛋白是人乳和牛奶内的一种主要蛋白，且广泛存在于各钟奶制品中。牛奶中的β-酪蛋白有两个主要的变异型，a1和a2，及一些罕见的亚变异型。由于自然基因突变，出现了a1蛋白质的变体，而且通过广泛牧养,今天全球乳牛均普遍含a1β-酪蛋白。a1和a2β-酪蛋白的蛋白质结构存在差异，a1型β-酪蛋白的第67位为组氨酸，因此其前7个氨基酸残基可以被裂解产生β-酪啡肽-7(bcm-7)。a2型的第67位则为脯氨酸，则不会生成bcm-7。正是这种结构差异,使a2β-酪蛋白比a1更接近天然母乳中的蛋白质。实验证明a2β-酪蛋白有潜力改善宝宝的消化功能，促进宝宝对营养物质的吸收，呵护宝宝稚嫩的消化系统；含有a2β-酪蛋白的配方，从源头上最大程度地避免了(由a1酪蛋白引起的)不良的健康反应。这个观点已得到全球100多项科学论文的支持和认同。
目前检测β-酪蛋白基因型的方法有酶切、测序、荧光定量pcr技术等，然而，上述方法费事、费力且成本高。
因此，现有的β-酪蛋白基因型的检测方法仍有改善的必要。
技术实现要素：
第一代分子标记的代表是rflp，即限制性片段长度多态性，在对研究样品基因组信息不清楚的情况下，使用随机选择性酶切以后进行电泳，利用众多条带的多态性进行区分，目前已基本被淘汰；
第二代分子标记是ssr和str，即简单序列重复数，目前还被广泛应用，但存在等位基因数目过多，人工判别不准确，实验可重复性差，分布密度不足等问题，正在被第三代标记技术替代；
随着进入后基因组时代，第三代分子标记应运而生，就是snp，即单核苷酸多态性。它是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异而引起的一种dna序列多态性。与第一二代不同，snp具有分布密度高、遗传稳定性好、二等位基因型等特点，就如二进位制相对于十进位制，更适合于计算机算法一样，更容易实现高通量和自动化检测。kasp是竞争性等位基因特异性pcr(kompetitiveallelespecificpcr)的缩写，可在广泛的基因组dna样品中(甚至是一些复杂基因组的dna样品)，对snps和特定位点上的indels进行精准的双等位基因判断。
为解决现有技术存在的不足，本发明结合第三代分子标记技术，提供了一种基于kasp检测β-酪蛋白基因型的方法，包括如下步骤：
s1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计至少一种引物；
s2：建立pcr体系，该pcr体系包括dna、kaspmastermix以及由步骤s1中的至少一种引物组成的混合引物；
s3：设置空白对照；
s4：pcr扩增；
s5：扫描数据，得到β-酪蛋白的基因型。
其中，所述步骤s1中，所设计的引物包括如下两种：
mastermix：5’-gatgttttgtgggaggctgttag-3’
5’-ggatgttttgtgggaggctgttat-3’
primermix：5’-tctatcccttccctgggcccat-3’。
其中，所述步骤s2中，所述pcr体系介于4-6ul，其中，dna的含量介于2-3ul，kaspmastermix的含量介于2-3ul，混合引物的含量介于0.03-0.10ul。
其中，所述步骤s2中，所述pcr体系为5.07ul，其中包括2.5uldna、2.5ulkaspmastermix以及0.07ul混合引物；所述混合引物由mastermix、primermix以及ddh2o组成，其中，mastermix、primermix以及ddh2o的体积份数分别介于20-30份、25-35份以及40-55份，且mastermix中，两条末端碱基不同的等位基因正向引物的量相同。
其中，所述步骤s3中，所述空白对照体系为将pcr体系中的dna以等量ddh2o代替所得。
其中，所述步骤s4中，pcr扩增包括：
s41：在90-100摄氏度的温度下激活10-20分钟，90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-65摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行8-12个循环；
s42：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行25-30个循环；
s43：在90-100摄氏度的温度下变性15-25秒，50-60摄氏度的温度下退火和延伸55-65秒，进行2-5个循环。
其中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna选自奶牛血液，其制备方法如下：
s21：取离心管，加入预定体积的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中；
s22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
s23：重复步骤s21-s22，进一步离心弃上清；
s24：加缓冲液gs、proteinasek溶液、涡旋混匀，加入缓冲液gb，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化预定时间；
s25：加入无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
s26：取吸附柱cb3，置于一收集管中，将步骤s25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
s27：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的缓冲液gd、离心、弃废液；
s28：向吸附柱中加入已加入无水乙醇的漂洗液pw、离心、弃废液；
s29：重复步骤s28；
s210：空甩离心、弃废液；
s211：将吸附柱转入新的ep离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
s212：向吸附柱膜中间位置悬空加入洗脱缓冲液tb，室温放置数分钟，使dna沉淀充分溶解；
s213：离心、弃吸附柱，收集dna溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna提取自奶牛血液，其制备方法如下：
s21：取若干2毫升ep离心管，每支加入700-800ul的细胞裂解液，取溶化后的血块样品置于离心管中，血块样品的体积介于0.3-0.6ml；
s22：匀浆仪磨碎、离心、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
s23：重复步骤s21-s22，每支离心管再加入400-600ul的细胞裂解液，进一步离心弃上清；
s24：加200-300ul缓冲液gs、20-30ulproteinasek溶液、涡旋混匀，加入200-300ul缓冲液gb，再次涡旋混匀，置于分子杂交炉中消化3-5h；
s25：加入150-250ul无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
s26：取吸附柱cb3，置于一收集管中，将步骤s25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，离心、弃废液；
s27：向吸附柱中加入400-600ul已加入无水乙醇的缓冲液gd、离心、弃废液；
s28：向吸附柱中加入600-800ul已加入无水乙醇的漂洗液pw、离心、弃废液；
s29：重复步骤s28；
s210：空甩离心、弃废液；
s211：将吸附柱转入新的ep离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
s212：向吸附柱膜中间位置悬空加入80-100ul洗脱缓冲液tb，室温放置数分钟，使dna沉淀充分溶解；
s213：离心、弃吸附柱，收集dna溶液，通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna提取自奶牛精液，其制备方法如下：
s21：取离心管，加冻精及生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
s22：再次加入生理盐水，离心、弃上清；
s23：向沉淀中加入牛冻精裂解液及sds以溶解沉淀，之后加入proteinasek溶液，混匀；
s24：将步骤s23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
s25：加入饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
s26：在上清液中加入低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
s27：加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
s28：再次加入乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，残余的乙醇彻底挥发；
s29：加入tb溶液，低温下过夜溶解dna沉淀；
s210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
其中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna选择奶牛精液，其制备方法如下：
s21：取2毫升ep离心管，加冻精及400-600ul生理盐水，涡旋混匀，离心、弃上清；
s22：再次加入400-600ul生理盐水，离心、弃上清；
s23：向沉淀中加入300-500ul牛冻精裂解液及80-120ulsds以溶解沉淀，之后加入10-30ulproteinasek溶液，混匀；
s24：将步骤s23所得溶液在分子杂交炉中消化预定时间；
s25：加入200-400ul饱和食盐水，混匀，低温静置后低温离心，收集上清、弃沉淀；
s26：在上清液中加入800-1200ul低温无水乙醇，混匀，离心、弃上清；
s27：加入400-600ul乙醇溶液，混匀，离心、弃上清；
s28：再次加入400-600ul乙醇溶液，混匀，离心、弃上清，之后开盖放置预定时间，使残余的乙醇彻底挥发；
s29：加入150-250ultb溶液，低温下过夜溶解dna沉淀；
s210：通过琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
本发明提供的基于kasp检测β-酪蛋白基因型的方法，dna样本需求低，成本低，检测结果准确，并且可支持低、中或高通量研究以及单个重复实验，灵活性强。
附图说明
图1：根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白的基因型。
具体实施方式
为了对本发明的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合详细说明本发明的技术方案及其产生的有益效果。
本发明提供的基于kasp检测β-酪蛋白基因型的方法，具体实施时，本发明提供了如下的两个优选实施例：
实施例1：
s1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计引物：
mastermix：5’-gatgttttgtgggaggctgttag-3’
5’-ggatgttttgtgggaggctgttat-3’
primermix：5’-tctatcccttccctgggcccat-3’。
s2：建立pcr体系，该pcr体系包括2.5uldna、2.5ulkaspmastermix(lgcgenomics,hoddeston,uk)以及0.07ul混合引物。
s3：将pcr体系中的dna以等量ddh2o代替，以作为空白对照。
s4：进行pcr扩增：
s41：在94摄氏度的温度下激活15分钟，94摄氏度的温度下变性20秒，55-61摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行10个循环；
s42：在94摄氏度的温度下变性20秒，55摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行26个循环；
s43：在94摄氏度的温度下变性20秒，57摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行3个循环。
s5：参照《abi7900htfastrealtimepcrsystem实验操作规程》进行数据扫描，得到β-酪蛋白的基因型。
其中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna选自奶牛血液，本实施例中利用天根生化科技有限公司(北京)的血液基因组dna提取试剂盒dp318从血块中提取牛的基因组dna，在获取dna之前，需要先在缓冲液gd和漂洗液pw中加入相应体积的无水乙醇
所述奶牛血液中的dna的具体获取方法如下：
s21：取若干2毫升ep离心管，每支加入750ul的细胞裂解液cl，取牛血块样品，溶化后剪取大约0.5ml置于离心管中；
s22：匀浆仪磨碎、10000r/min离心1min、弃上清，取底部的细胞核沉淀；
s23：重复步骤s21-s22，每支离心管再加入500ul的细胞裂解液cl，使用涡旋仪混匀，进一步离心弃上清；
s24：加250ul缓冲液gs、25ulproteinasek溶液、涡旋混匀，加入250ul缓冲液gb，再次涡旋混匀，置于56℃分子杂交炉中消化4h；
s25：加入150-250ul无水乙醇，充分混匀直至出现絮状沉淀；
s26：取吸附柱cb3，置于一收集管中，将步骤s25得到的带有絮状沉淀的溶液加入到吸附柱中，12000r/min离心1min、弃废液；
s27：向吸附柱中加入500ul已加入无水乙醇的缓冲液gd、12000r/min离心1min、弃废液；
s28：向吸附柱中加入700ul已加入无水乙醇的漂洗液pw、12000r/min离心1min、弃废液；
s29：重复步骤s28；
s210：空甩，12000r/min离心2min、弃废液；
s211：将吸附柱转入新的1.5mlep离心管中，室温下开盖放置数分钟，将残余的漂洗液挥发掉；
s212：向吸附柱膜中间位置悬空加入80-100ul洗脱缓冲液tb(56℃提前预热)，室温放置10min，使dna沉淀充分溶解；
s213：12000r/min离心2min、弃吸附柱，收集dna溶液，通过1％琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
将检测合格的基因组dna置于-20℃长期保存备用。
实施例2：
s1：根据β-酪蛋白的碱基序列，设计引物：
mastermix：5’-gatgttttgtgggaggctgttag-3’
5’-ggatgttttgtgggaggctgttat-3’
primermix：5’-tctatcccttccctgggcccat-3’。
s2：建立pcr体系，该pcr体系包括2.5uldna、2.5ulkaspmastermix(lgcgenomics,hoddeston,uk)以及0.07ul混合引物。
s3：将pcr体系中的dna以等量ddh2o代替，以作为空白对照。
s4：进行pcr扩增：
s41：在94摄氏度的温度下激活15分钟，94摄氏度的温度下变性20秒，55-61摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行10个循环；
s42：在94摄氏度的温度下变性20秒，55摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行26个循环；
s43：在94摄氏度的温度下变性20秒，57摄氏度的温度下退火和延伸60秒，进行3个循环。
s5：参照《abi7900htfastrealtimepcrsystem实验操作规程》进行数据扫描，得到β-酪蛋白的基因型。
本实施例中，所述步骤s2中，pcr体系中的dna选择奶牛精液，其制备方法如下：
s21：取2毫升ep离心管，加冻精一支及500ul生理盐水，涡旋混匀，12000r/min离心1min、弃上清；
s22：再次加入500ul生理盐水，12000r/min离心1min、弃上清；
s23：向沉淀中加入400ul牛冻精裂解液(先加入60ml双蒸水后加0.5mol/l的edta(ph＝8.0)2ml，1mol/l的tris.cl(ph＝8.0)1ml，10％的sds10ml，dtt0.77g，nacl0.29g，定容至80ml)，及100ul20％的sds以溶解沉淀，室温放置1-2分钟，涡旋，使沉淀完全溶于裂解液，之后加入20ulproteinasek溶液，混匀；
s24：将步骤s23所得溶液在56℃分子杂交炉中消化20-22h；
s25：取出已消化好的样品，加入300ul饱和食盐水，混匀，低温下(冰箱)静置10分钟后4℃离心机中12000r/min离心10min，收集上清、弃沉淀；
s26：在上清液中加入1000ul低温无水乙醇，混匀，12000r/min离心1min、弃上清；
s27：加入500ul75％的乙醇溶液，混匀，12000r/min离心2min、弃上清；
s28：再次加入500ul75％的乙醇溶液，混匀，12000r/min离心2min、弃上清，之后开盖放置预定时间，使残余的乙醇彻底挥发；
s29：加入200μl56℃的tb溶液，低温下过夜溶解dna沉淀；
s210：通过1％琼脂糖凝胶电泳和核酸分析仪检测dna溶液的质量和浓度。
将检测合格的基因组dna置于-20℃长期保存备用。
本发明中，所谓的“proteinasek溶液”，是指蛋白酶k溶液；所谓的缓冲液gs、缓冲液gb、缓冲液gd以及漂洗液pw，均选自天根试剂盒自带试剂dp318。
图1为根据本发明的基因型检测得到的β-酪蛋白的基因型图，结合图1可知：本发明利用kasp进行β-酪蛋白的基因型检测，对dna样本的需求低，适于大批量样本检测，独立评价的准确性可达99.8％以上，且可支持低、中或高通量研究以及单个重复实验。
虽然本发明已利用上述较佳实施例进行说明，然其并非用以限定本发明的保护范围，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围之内，相对上述实施例进行各种变动与修改仍属本发明所保护的范围，因此本发明的保护范围以权利要求书所界定的为准。