藏猪IL‑12重组质粒增强PCV2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体属于分子免疫学，涉及藏猪il-12及其重组质粒在制备pcv2疫苗免疫佐剂中的应用。
背景技术：
：猪肉产品是城乡居民肉类消费的主要来源，与人们生活息息相关。21世纪以来，我国生猪的年存栏数和出栏数一直保持占世界总量的50％左右，居世界首位。我国养猪业取得举世瞩目成就的同时，还存在着许多制约我国养猪业健康发展的因素，其中疾病是最为主要的因素。目前，我国猪病诊断和防治水平与世界发达国家相比还存在着较大的差距，猪传染性疾病仍然十分严重，圆环病毒2型(porcinecircovirustype2，pcv2)感染是较为常见的一类传染病。pcv2是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，pmws)的主要病原，临床上常与猪高致病性繁殖与呼吸综合征、猪口蹄疫以及猪细小病毒病等混合感染、继发感染，给全世界养猪业造成了重大的经济损失。pcv2不仅是引起pmws的病原体，而且还与猪皮炎与肾病综合征、肉芽肿性肠炎、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍、坏死性淋巴结炎及仔猪先天性震颤等疾病密切相关，这些与pcv2相关的疾病统称为猪圆环病毒病(porcinecircovirusdisease，pcvd)。目前，防控pcvd的主要手段是接种疫苗，国内外学者在pcv2疫苗研究方便取得了显著成就，成功研制了包括pcv2灭活疫苗、pcv2弱毒疫苗、pcv2基因工程疫苗、pcv1-2嵌合疫苗以及pcv2标记疫苗等。但疫苗的使用存在一定的局限性，在我国pcv2全病毒灭活疫苗使用较为广泛，而其他疫苗使用较少。而pcv2灭活苗疫苗免疫猪群后，会出现猪采食量明显减少，偶有个别猪死亡等情况，为此，选择毒性小，免疫效果好的免疫佐剂是解决这一问题的不二途径。常用免疫佐剂有脂质体，壳聚糖等，但对细胞因子佐剂的研究较少。细胞因子是一类由生物体自身的造血系统、免疫系统产生的活性多功能蛋白。目前发现的细胞因子有十几种，其中白细胞介素(il)、肿瘤坏死因子(tnf-α)和干扰素(ifn-γ)这几种对动物极为重要。il-12是il-12细胞因子家族中的重要一员，是由p40和p35两个亚基组成的异致二聚体，能增强nk细胞的活性，诱导th1细胞的分化，在许多炎症反应和免疫调解中都起着重要的作用。细胞因子由于其天然存在于生物体内，对免疫具有调节作用，近年来越来越受到关注，然而细胞因子在体内的半衰期短，时效短而成本高，因此，将细胞因子基因克隆进入质粒并转染至生物体内表达为解决这一问题提供了思路。技术实现要素：本发明一个目的是提供藏猪il-12。本发明提供的一种蛋白质(命名为il-12’)，由il-12蛋白p40亚基、2a(自剪切连接肽)、tpa(信号肽，作用分泌信号)和il-12蛋白p35亚基组成；所述2a的氨基酸序列为序列2第324-344位；所述tpa的氨基酸序列为序列2第345-369位。上述蛋白质中，所述il-12蛋白来源于藏猪；或，所述蛋白质为如下(1)或(2)：(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。编码上述的蛋白质的dna分子也是本发明保护的范围。上述dna分子是如下1)至3)中任一所述的dna分子：1)序列表中序列1所示的dna分子；2)在严格条件下与1)所限定的dna分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子；3)与1)所限定的dna分子至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的dna分子。上述严格条件可为在6×ssc、0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc、0.1％sds和1×ssc、0.1％sds各洗膜一次。含有上述的蛋白质的dna分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或含有所述重组载体的转染试剂也是本发明保护的范围。上述重组载体为为将编码上述的蛋白质的dna分子插入真核表达载体中得到的载体；或，所述重组载体为将编码上述的蛋白质的dna分子插入真核表达载体中得到的载体；所述真核表达载体为vr1020质粒。上述含有重组载体的转染试剂为用壳聚糖包裹上述的重组载体得到的转染试剂；具体制备方法如下：1、将vril-12溶液(溶剂为水)与适量的tpp溶液混合均匀，并在55℃下恒温孵育20min，得到质粒与tpp的预混液；vril-12和tpp的质量比为1：3；10mg/ml的tpp溶液：将tpp溶解在ddh2o中，使tpp浓度为10mg/ml，得到10mg/ml的tpp溶液；2、在55℃水浴磁力搅拌情况下将上述质粒与tpp的预混液缓慢滴加至壳聚糖溶液中，混合均匀，使得壳聚糖与质粒的质量比为30:1，然后恒温孵育10min备用，得到包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒；2.4mg/ml的壳聚糖溶液：将壳聚糖溶解在1％(ph5.5)的冰醋酸水溶液中，，使壳聚糖浓度为2.4mg/ml，得到2.4mg/ml的壳聚糖溶液。或所述含有重组载体的转染试剂为用脂质体包裹所述重组载体得到的转染试剂。上述的转染试剂中，所述壳聚糖和所述重组载体的质量比为10:1；或所述脂质体为dmrie，所述dmrie和质粒的质量比为2.5：1。上述的蛋白质或上述的dna分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或含有所述重组载体的转染试剂在制备如下1)-7)中任一中应用；1)pcv2疫苗佐剂；2)提高pcv2疫苗免疫效果产品；3)促进动物生长的产品；4)增加动物体重的产品；5)提高淋巴细胞、嗜碱性粒细胞、cd3+t细胞、cd4+t或cd8+t细胞的数量的产品；6)提高血红蛋白、igg、igg1、igg2a或pcv抗体含量的产品；7)提高il-12、il7、il23、il-4、il15、il6、il10、tlr3、tlr9、tlr1、tlr6、tlr2、tlr7、cd62l、ifn-γ、tnf-α、tgfβ-1、stat1、stat1，stat2，stat3，stat4、cd45、bcl-2或myd88表达量的产品。本发明的另一个目的是提供一种pcv2疫苗佐剂。本发明提供的pcv2疫苗佐剂，包括上述的蛋白质或上述的dna分子或上述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌或含有所述重组载体的转染试剂。本实验首次利用基因克隆技术得到了藏猪il-12基因的p40和p35的基因片段，并用2a自剪切表达技术连接p40和p35基因从而得到了完整的il-12基因序列，再用in-fusion克隆方法将完整的il-12构建到真核分泌型表达载体vr1020中，用壳聚糖包裹il-12质粒制备壳聚糖纳米颗粒并与pcv疫苗同时接种实验动物，分别采用小鼠和猪作为实验动物，结果表明il-12真核转染质粒能有效增强pcv疫苗的免疫应答，为开发新型高效的pcv免疫佐剂提供了思路。附图说明图1为p40和p35基因的电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)，m：trans2k，2：p35，3：p40。图2为p40、p35、2a-tpa片段电泳图谱(1.0％琼脂糖凝胶)，m:trans5k，1-2：p40，3-5：2a-tpa，6-7：p35。图3为gfp在hke293细胞中表达情况，a：转染前hek293生长情况，b：转染24小时后gfp在hek293细胞中表达情况，c：转染48小时后gfp在hek293细胞中表达情况，d：转染72小时后gfp在hek293细胞中表达情况。图4为pcr产物电泳检测图谱(1.0％琼脂糖凝胶)，m：trans5k，1：细胞对照，2：vr1020空载体对照，3：vril-12。图5为淋巴母细胞增殖情况。图6为壳聚糖包裹il-12质粒的粒径分布。图7为藏猪pbmcs细胞il-12基因的表达量变化。图8为藏猪pbmcs细胞toll-like受体基因的表达量变化。图9为藏猪pbmcs细胞il-7、il-15和il-23的表达量变化。图10为藏猪pbmcs细胞th1型细胞因子的表达量变化。图11为藏猪pbmcs细胞th2型细胞因子的表达量变化。图12为藏猪pbmcs细胞tgfβ-1的表达量变化。图13为藏猪pbmcs细胞myd88的表达量变化。图14为小鼠体重变化。图15为小鼠外周血中血细胞的数量变化。图16为小鼠血清中igg、igg1和igg2a的含量变化。图17为小鼠血清中pcv-2抗体含量的变化。图18为小鼠外周血中th和tc细胞亚群的数量变化。图19为小鼠外周血中il-12基因的表达量变化。图20为小鼠外周血中toll-like受体基因的表达量变化。图21为小鼠外周血中免疫记忆相关基因的表达量变化。图22为小鼠外周血中th1型细胞因子的表达量变化。图23为小鼠外周血中th2型细胞因子的表达量变化。图24为小鼠外周血中tgfβ-1的表达量变化。图25为小鼠外周血中stat1的表达量变化。图26为实验猪血细胞数量变化。图27为实验猪外周血中t细胞变化。图28为实验猪血清中igg的变化。图29为实验猪血清中抗pcv-2抗体变化。图30为实验猪tlr2和tlr7基因表达量变化。图31为实验猪细胞因子基因表达量变化。图32为实验猪免疫信号转导分子基因的表达量变化。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、真核重组质粒vril-12的构建一、提取外周血淋巴细胞的rna1、藏猪外周血淋巴细胞的分离与培养(1)采藏猪前腔静脉血40ml，加1640培养基等量稀释；(2)在15ml离心管中加入5ml淋巴细胞分离液，再缓慢加入等量稀释后的血液，在水平离心机上室温1500r离心30min；(3)离心后可见清晰的4层分层(从上至下：血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层)，小心吸取淋巴细胞层，共2ml；(4)加10ml的1640培养基洗涤，室温1500r离心10min；(5)弃上清，再加10ml1640培养基，吹打混匀，室温1500r离心10min；(6)弃上清，加入20ml含10％胎牛血清和双抗的1640完全培养基吹打混匀，调节细胞浓度至2×107ml-1，再加入浓度为1mg/ml的lps20ul，使lps的终浓度为1ug/ml，37℃，5％co2培养箱中培养4h。2、藏猪外周血淋巴细胞的总rna的提取(1)贴壁细胞收集上清后，剩余的细胞加入1mltrizol，用枪头把细胞从板上吹下，然后转移至1.5mlep管中；(3)加入200ul氯仿，剧烈震荡15sec，室温静置5min，12000g4℃离心15min；(4)小心吸取400ul上清，再加入400ul异丙醇，混匀，室温静置10min，12000g4℃离心10min；(5)弃上清，加入1ml75％乙醇，12000g4℃离心5min；(6)弃上清，待rna沉淀自然风干后，加入20ulrnase-freewater溶解；(7)rna的纯度及浓度通过紫外分光光度计检测，rna的完整性用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。二、pcr扩增p35基因pcr产物1和p40基因pcr产物1将上述一得到的rna用takaraprimescriptrtreagentkit合成cdna。根据genbank上公布的猪il-12的p40和p35的基因序列，用primer5.0软件设计特异性引物(见表1)。表1藏猪pcr引物以cdna为模板，分别用p40和p35对应的特异性引物pcr扩增目的基因，体系为20ul(见表2)，得到972bp的p40基因pcr产物1(序列1第1-969位)和771bp的p35基因pcr产物1(序列1第1108-1878位)(图1)。表2目的基因pcr扩增体系pcr循环条件将上述扩增得到的p40基因pcr产物1和p35基因pcr产物1分别连接到t载体(pblue-tvector，北京博奥龙免疫技术有限公司，bd-m10015)上，得到p40-t载体和p35-t载体。三、il-12基因的真核重组质粒vril-12构建1、2a-tpa的合成vril-12根据文献的方法设计并合成三个引物，分别命名为2a-tpa-1，2a-tpa-2，2a-tpa-3，用这三个引物进行pcr扩增出2a-tpa的融合基因。引物序列(见表3)：表32a-tpapcr引物pcr反应体系为50ul(见表4)：表42a-tpa反应体系pcr反应条件：2％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收，得到2a-tpa(其核苷酸序列为序列1第970-1107位)。2、p40基因pcr产物2和p35基因pcr产物2的扩增1)引物的设计和合成用in-fusion方法，设计重叠引物，将p40和35两个基因之间连接2a短肽基因后一起插入载体vr1020中，p40基因5’端与载体有16bp重叠，命名为40-f，3’端有10bp与2a-tpa重叠，命名为40-r；2a-tpa5’端与p40有10bp重叠，命名为2a-f，2a-tpa3’端设计一个引物，与p35基因有10bp重叠，命名为2a-r；p35基因5’端与2a-tpa有10bp重叠，命名为35-f，3’端与vr1020有16bp重叠，命名为35-r。引物序列(见表5)：表5引物序列2)目的片段的扩增以上述二得到的p40-t载体为模板，以40-f和40-r为引物扩增，得到995bpp40扩增产物2(图2)。以上述二得到的p35t载体为模板，以35-f和35-r为引物扩增，得到797bpp35扩增产物2(图2)。以上述1得到的2a-tpa为模板，以2a-f和2a-r为引物扩增，得到158bp2a-tpa扩增产物2(图2)。3)载体骨架获得将vr1020质粒(vr1020由美国vical公司提供)用bamhi单酶切，得到vr1020线性载体骨架。4)片段与载体的连接将上述2)得到的p40扩增产物2、p35扩增产物2、2a-tpa扩增产物2和vr1020线性载体骨架连接，得到真核重组质粒vril-12。上述连接体系为10ul(见表6)：表6片段与载体连接体系连接条件：50℃，15min。测序真核重组质粒vril-12，该质粒为将序列1所示的dna片段插入vr1020质粒的bamhi酶切位点间得到的质粒。序列1所示的dna片段命名为融合片段il-12’，该融合片段编码的蛋白命名为il-12’蛋白。其中p40为序列1第1-969位，2a为序列1第970-1032位，tpa为序列1第1033-1107位，p35为序列1第1108-1878位；融合片段编码的蛋白命名为il-12’蛋白，该蛋白的氨基酸序列为序列表中序列2(p40为序列2第1-323位，2a为序列2第324-344位，tpa为序列2第345-369位，p35为序列2第370-625位)。四、真核重组质粒vril-12的活性检测1、真核重组质粒vril-12在hek293细胞中的表达活性将上述三制备的真核重组质粒vril-12和pegfp-n3-gfp表达质粒(clontech，6080-1，作为阳性转染对照)同时加入，按脂质体转染试剂盒(阳离子脂质体dmrie：购自美国invitrogen公司，sgmb01-gmb-gcr4118)说明书操作转染hek293细胞(人胚肾细胞，上海拜力生物胎牛血清公司，hek-293)。1)荧光显微镜检测转染前观察细胞生长良好，死亡细胞较少，用荧光显微镜分别观察转染24h、48h和72h后的细胞。结果如图3所示，显示转染后24h后gfp就开始表达，说明质粒在细胞中能成功表达。2)、目的基因在hek293中的检测分别于上述1转染后24h、48h、72h收集上清，并收集转染48h后的细胞。提取转染48h后的细胞的总rna，反转录得到cdna作为模板，用il-12特异性引物(35-f和35-r)进行pcr扩增。以空载体vr1020为对照。结果如图4所示，可以看出，所构建的vril-12重组质粒能在hek293细胞中成功表达。2、淋巴母细胞刺激实验vril-12组：(1)按照前面的方法收集藏猪外周血淋巴细胞；(2)按照排版分别向96孔板实验孔中加入50μl藏猪外周血淋巴细胞和50μl上述1收集的转染后24h、48h、72h收集上清。每个样品设3个重复孔，并设有对照孔，置于细胞培养箱中培养48h；(3)48h后，取出96孔板，每孔加入10μlcck8轻轻吹匀继续培养2h；(4)取出96孔板，用bio-reader3550检测每孔od450。vr1020组：与vril-12组不同的是，将转染上清液替换为对照转染上清液。上述对照转染上清液为将质粒vr1020转染hek29324、48和72小时后收集的上清液。cell为hek293细胞，control为vr1020空白质粒。通过cck8检测细胞存活，结果如图5所示，vril-12组较对照组vr1020增殖明显，这说明实验质粒转染hek293细胞的上清能显著刺激猪淋巴细胞增殖(p<0.05)。证明vril-12能正确表达出il-12，具有免疫刺激活性；是后面重组质粒在体内细胞表达可作为免疫佐剂的基础证据。五、内毒素的检测用“凝胶法”检测vril-12质粒的内毒素含量，方法参考《鲎试剂说明书》，具体方法如下：(1)阳性对照样品制备：取内毒素标准品(上海哈灵生物科技有限公司，150600)，以检查用水配制浓度为2倍灵敏度λ＝0.25eu/ml的溶液备用；(2)阴性对照：检查用水；(3)检测样品：根据检测样品内毒素限值得要求计算器有效稀释倍数(mvd＝cl/λ)，将样品稀释备用；(4)取鲎试剂，折断安瓿颈并标记，其中1支作阳性对照管，1支作阴性对照管，2支作检品管，1支作检品阳性对照管，共5支；(5)按照要求分别在阴性对照管、阳性对照管和检品管中加入0.2ml检查用水、0.1ml检查用水+0.1ml浓度为2倍λ的内毒素溶液、以及0.1ml检查用水+0.1ml检测样品(vril-12质粒)，轻轻摇匀待检；(6)将上一步待检样垂直放入恒温器中，37℃孵育60分钟，读取结果。结果未见样品管有凝胶形成，表明真核重组质粒vril-12没有含内毒素。实施例2、真核重组质粒vril-12在作为疫苗佐剂中的应用一、疫苗佐剂的制备1、包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒(cs-il-12)的制备采用离子交联法包裹vril-12质粒，制备纳米颗粒作为疫苗佐剂，具体方法是：(1)溶液的配制：10mg/ml的tpp溶液：将tpp溶解在ddh2o中，使tpp浓度为10mg/ml，得到10mg/ml的tpp溶液；2.4mg/ml的壳聚糖溶液：将壳聚糖溶解在1％(ph5.5)的冰醋酸水溶液中，，使壳聚糖浓度为2.4mg/ml，得到2.4mg/ml的壳聚糖溶液；用0.22m微孔滤膜过滤所配溶液以除菌；(2)质粒与tpp溶液预混：将vril-12溶液(溶剂为水)与适量的tpp溶液混合均匀，并在55℃下恒温孵育20min，得到质粒与tpp的预混液；vril-12和tpp的质量比为1：3；壳聚糖包裹质粒：在55℃水浴磁力搅拌情况下将上述质粒与tpp的预混液缓慢滴加至壳聚糖溶液中，混合均匀，使得壳聚糖与质粒的质量比为30:1，然后恒温孵育10min备用，得到包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒；(4)取样检测：取适量包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒用马尔文粒度仪检测纳米颗粒zeta电位和粒径大小。结果如图6所示，包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒的粒径大小为107.78±14.92nm，zeta电位为+26.4±2.41mv，分散度为0.217±0.011，表明其符合转染细胞的要求，该颗粒命名为cs-il-12。2、dmrie质粒复合物(dmrie-il-12)的制备将vril-12重组质粒4μg用到500μlrpmi1640减血清培养基中进行稀释。对应地，10μldmrie(阳离子脂质体dmrie：购自美国invitrogen公司，sgmb01-gmb-gcr4118)分别稀释到500μlrpmi1640减血清培养基中。分别混合均匀后静置于室温5min，将稀释后的质粒加入对应的稀释的dmrie中，轻轻混合均匀后，静置于室温30min备用，得到dmrie质粒复合物(dmrie和质粒的质量比为2.5：1)，作为转染细胞试剂。二、包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒和dmrie质粒复合物在藏猪pbmcs细胞中表达的生物学效应1、转染藏猪pbmcs细胞按照前面的方法收集藏猪外周血pbmcs，分为如下组：实验组(cs-il-12+pcv2)：将上述一制备的包裹vril-12的壳聚糖纳米颗粒转染藏猪pbmcs培养12h后的细胞，培养4.5h，加入10μl稀释104倍的pcv2。实验组(dmrie-il-12+pcv)：将上述1制备的dmrie质粒复合物(dmrie-il-12)转染藏猪pbmcs培养12h后的细胞，培养4.5h，加入10μl稀释104倍的pcv2。pcv2对照组(pcv2，control)：将10μl的rpmi1640完全培养基和藏猪pbmcs培养12h后的细胞，培养4.5h，加入10μl稀释104倍的pcv2。空白对照组：空白pbmcs。将上述实验组和对照组分别于加入病毒时间后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h离心(10000g,30sec)收集细胞，以1mltrizol裂解细胞，冻存于-80℃备用。排版情况见表7。表7藏猪pbmcs转染排版示意cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白对照cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白对照cs-il-12+pcv2dmrie-il-12+pcv2pcv2空白对照上述各组转染方法具体如下：壳聚糖纳米颗粒转染pbmcs：将制备好的壳聚糖纳米粒溶液用naoh溶液调ph为6.0左右，转染前将细胞培养基换成相应的无血清培养基，然后加入含2ug质粒的壳聚糖纳米粒溶液转染，3h后换成完全培养基继续培养；脂质体转染试剂dmrie转染pbmcs：(1)pbmcs细胞的准备：离心(250g,15min)pbmcs，细胞经rpmi1640无血清培养基清洗一遍后以rpmi1640无血清培养基重悬，计数，稀释至细胞密度为1.5x107个/ml；(2)转染：将0.2ml细胞悬液添加到6孔细胞培养板中，加入dmrie质粒复合物(含2ug质粒)，细胞在37℃，5％co2条件下培养4.5h后，加入2ml预热的含15％热灭活fbs和1.5％青链霉素的rpmi1640培养基，混匀后继续培养。2、检测免疫相关基因的表达分别提取上述2不同组转染后细胞培养不同时间段的rna，反转录得到第一链cdna。根据genbank中报道的猪基因序列，设计合成荧光定量pcr特异性引物，见表8表8荧光定量引物以稀释后的cdna为模板，分别用表8中特异性引物扩增目的基因，荧光定量pcr反应体系15μl(见表9)：表9目的基因扩增体系反应条件：反应结束后，以β-action作为内参基因，由2-δδct计算基因的相对表达量。荧光定量标准曲线结果表明各个基因pcr的相关系数在0.99以上，且扩增效率均在95％至105％之间，符合荧光定量要求。通过基于tukey多重比较的单因素方差分析和双因素方差分析方法，分析比较不同组别之间基因的表达量差异。当p<0.05时，认为不同组之间基因的相对表达量有显著性差异。由图7(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组il-12基因的表达量显著性高于对照组(p<0.05)；且实验组之间有显著性差异，dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(前者高效但价格高不实用贵重，后者cs-il-12经济安全有效)(p<0.05)。由图8(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组toll-like受体基因tlr3和tlr9的表达量显著性对照组tlr3和tlr9的表达量(p<0.05)；且实验组之间有显著性差异，dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)。由图9(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组免疫记忆相关基因il7、il15和il23的表达量显著性对照组(p<0.05)；且各实验组之间il7、il15和il23的表达量有显著性差异，cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)；il7在96h时dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；il15在72h时dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；il23在48h和96h时dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)。由图10(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组th1型细胞因子il2和tnf-α的表达量显著性对照组il2和tnf-α的表达量(p<0.05)；且各实验组之间il2和tnf-α的表达量有显著性差异，dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；il2在168h时cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)；tnf-α在72h和144h时cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)。由图11(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组th2型细胞因子il4、il6和il10的表达量显著性对照组(p<0.05)；且实验组之间il4和il6的表达量有显著性差异，dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；il6在48h时cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)；il10在72h、120h和144h时cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)，在24h、48h和168h时dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)。由图12(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组反馈调节基因tgfβ-1的表达量显著性对照组(p<0.05)；且实验组之间有显著性差异，dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；tgfβ-1在72h和144h时cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)。由图13(control为空白细胞培养上清液)可见，藏猪pbmcs转染il-12质粒后，实验组免疫信号传导分子myd88的表达量显著性对照组myd88的表达量(p<0.05)；且实验组之间myd88的表达量有显著性差异，cs-il-12组显著高于dmrie-il-12组(p<0.05)；myd88在48h和168h时dmrie-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)。三、疫苗佐剂在小鼠体内表达的生物学效应1、实验小鼠分组免疫50只28日雌性龄昆明小白鼠，体重约25-30g,随机分组5组，每组10只小鼠。实验组编号为a1和a2组，对照组编号分别为c1和c2，小鼠免疫注射安排见表10。注射前记为0周，注射后1-5周每周定时采一次血，每组约采血350μl，免疫动物前后分别每周固定时间称量每只小鼠的体重，并做好记录。表10小鼠分组及免疫接种安排免疫接种前后，每周固定时间称取每只小鼠的体重，每组小鼠的体重计算平均值和方差，小鼠体重变化见图14。结果表明小鼠的体重随饲养时间的延长而增长，实验组小鼠体重与对照组之间无显著差异(p>0.05)。2、实验小鼠血常规分析取50ul新鲜血液，通过血细胞自动分类检测技术，检测实验小鼠血液中淋巴细胞数目、血红细胞数目和血红蛋白含量等血液变化水平的情况，测定各实验小鼠在实验期间的外周血液免疫学变化情况。血常规分析小鼠外周血中血细胞的数目变化(见图15)。结果显示免疫接种后，实验组淋巴细胞数量显著高于对照组(p<0.05)，实验组之间无显著差异(p>0.05)；实验组嗜碱性粒细胞数量显著高于对照组(p<0.05)，实验组之间cs/p-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)；实验组血红蛋白含量和红细胞数量与对照组之间相比无显著差异(p>0.05)。3、流式细胞分析取50μl新鲜抗凝血，以抗小鼠荧光标记的cd4+、cd3+和cd8+单克隆抗体进行细胞染色，流式细胞术区分实验小鼠免疫细胞中的th和tc亚群细胞，通过其动态变化来观察细胞免疫应答的变化情况。流式细胞术具体步骤如下：(1)取50μl新鲜抗凝血，加入预混抗体(含anti-mousecd3e-fitc0.5μl，anti-mousecd8-pe0.625μl，anti-mousecd4-percp-cy5.50.625μl)，震荡混匀避光30min；(2)加入500μl红细胞裂解液，避光静置10min，3500r离心5min，去上清；(3)加入1mlpbs缓冲液，轻轻悬浮细胞，除去残留的红细胞碎片，3500r离心5min，去上清；(4)细胞沉淀加入300μl的pbs混匀，4℃避光保存，24h内上机检测。流式细胞术检测小鼠外周血中cd4+t和cd8+t细胞亚群的数量变化(见图18)。结果表明，免疫接种后，小鼠外周血中的cd4+t和cd8+t细胞亚群数量均呈上升趋势；实验组cd4+t和cd8+t细胞数量均显著高于对照组cd4+t和cd8+t细胞数量(p<0.05)，且实验组之间cs/p-il-12组显著高于cs-il-12组(p<0.05)。4、血清中igg、igg1、igg2a和pcv-ab的测定取100μl新鲜抗凝血，3500r离心10min分离血清，血清保存于-80℃备用。参照elisa试剂盒说明书测定血清中igg、igg1、igg2a和pcv-ab的含量。elisa检测小鼠血清中igg、igg1和igg2a的含量变化(见图16)。结果表明，免疫接种后，对照组小鼠igg、igg1和igg2a含量均无明显的上升和6下降，而实验组含量有明显上升；实验组小鼠血清中igg含量显著高于对照组(p<0.05)，实验组之间cs-il-12组显著高于cs/p-il-12组(p<0.05)；实验组小鼠血清中igg1和igg2a含量显著高于对照组(p<0.05)，实验组之间无显著差异(p>0.05)。elisa检测免疫接种后小鼠血清中的pcv抗体含量(见图17)。结果表明，免疫接种pcv疫苗后，小鼠血清中均检测出有效的pcv抗体；实验组小鼠血清中pcv抗体显著高于对照组pcv抗体含量(p<0.05)，实验组之间cs/p-il-12组显著高于cs-il-12组pcv抗体含量(p<0.05)。5、免疫相关基因表达量检测提取上述1各组免疫后1-5周小鼠血液的rna，反转录得到cdna。r根据genbank中报道的小鼠基因序列，设计合成定量pcr特异性引物，见表11。表11小鼠免疫相关基因引物定量pcr检测相关基因的表达量变化。由图19可见，免疫接种后，实验组小鼠il-12细胞因子的表达量显著性对照组il-12的表达量(p<0.05)；对照组之间il-12的表达量无显著差异(p>0.05)；实验组之间，分别在免疫接种的第7天、第21天和第28天cs/p-il-12组il-12的表达量显著高于cs-il-12组(p<0.05)。由图20可见，免疫接种后，实验组小鼠toll-like受体基因tlr1和tlr6的表达量显著性对照组tlr1和tlr6的表达量(p<0.05)；对照组之间tlr1和tlr6的表达量无显著差异(p>0.05)；在第21天，tlr1和tlr6的表达量达到最大值；实验组之间tlr1和tlr6的表达量无显著差异(p>0.05)。由图21可见，免疫接种后，实验组小鼠免疫记忆相关基因cd62l和il15的表达量显著性对照组(p<0.05)；对照组之间cd62l和il15的表达量无显著差异(p>0.05)；cd62l的表达量在第7天和第14天时，实验组之间cs/p-il-12组的表达量显著高于cs-il-12组cd62l的表达量(p<0.05)；cd62l的表达量在第35天时，实验组与对照组cd62l的表达量无显著差异(p>0.05)；il15的表达量在第14天、第28天和第35天时，实验组之间cs-il-12组的表达量显著高于cs/p-il-12组il15的表达量(p<0.05)。由图22可见，免疫接种后，实验组小鼠th1型细胞因子ifn-γ和tnf-α的表达量显著性对照组ifn-γ和tnf-α的表达量(p<0.05)；对照组之间ifn-γ和tnf-α的表达量无显著差异(p>0.05)；实验组之间，cs-il-12组的ifn-γ的表达量显著高于cs/p-il-12组ifn-γ的表达量(p<0.05)；tnf-α的表达量，实验组之间tnf-α的表达量无显著差异(p>0.05)。由图23可见，免疫接种后，实验组小鼠th2型细胞因子il6和il10的表达量显著性对照组il6和il10的表达量(p<0.05)；对照组之间il6和il10的表达量无显著差异(p>0.05)；il6的表达量，实验组之间il6的表达量无显著差异(p>0.05)；il10的表达量在第7天、第28天和第35天时，实验组之间cs/p-il-12组il10的表达量显著高于cs-il-12组il10的表达量(p<0.05)；il10的表达量在第14天时，实验组之间cs-il-12组il10的表达量显著高于cs/p-il-12组il10的表达量(p<0.05)。由图24可见，免疫接种后，实验组小鼠反馈调节基因tgfβ-1的表达量显著性对照组tgfβ-1的表达量(p<0.05)；对照组之间tgfβ-1的表达量无显著差异(p>0.05)；实验组之间tgfβ-1的表达量无显著差异(p>0.05)。由图25可见，免疫接种后，实验组小鼠信号传导分子stat1的表达量显著性对照组stat1的表达量(p<0.05)；对照组之间stat1的表达量无显著差异(p>0.05)；在第7天时，实验组与对照组stat1的表达量无显著差异(p>0.05)；在第14天和第28天时，实验组之间cs/p-il-12组stat1的表达量显著高于cs-il-12组stat1的表达量(p<0.05)；在第35天时，实验组之间cs-il-12组stat1的表达量显著高于cs/p-il-12组stat1的表达量(p<0.05)。四、疫苗佐剂在猪体内表达的生物学效应1、动物分组选取3周龄未免疫pcv2疫苗的杜大长三元杂交猪(四川省养猪研究所提供)10头,随机分为2组，每组5头，其中a组为实验组，b组为对照组，处理如下(表12):表12实验动物分组及接种制剂接种前记为0周，在第0、1、2、4、8、12周时取前腔静脉血液5ml保存于抗凝管中用于后续分析。免疫前后分别称量每头动物的体重，并做好记录。从表13中可以看出，接种前实验组(a组)与对照组(d组)之间体重差异不显著(p>0.05)，在接种后的84天里，a组体重增长显著高于d(p<0.05)，结果表明接种vril-12-cnp对仔猪生长有促进作用。表13实验动物体重变化表注：同一栏中标记不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。2、血常规分析具体方法同前。由图26可见，a组红细胞数量在接种后的第7天、14天、56天和84天都显著高于d组(p<0.05)。在第7天、14天和35天，a组血红蛋白含量明显增加(p<0.05)。a组和d组之间白细胞数量差异不显著(p>0.05)。3、流式细胞分析具体方法同前。图27显示了cd3+t细胞、cd4+t细胞和cd8+t细胞的数量变化以及cd8+/cd4+比值的变化。三种细胞数量在接种后都显著增长，a组的cd3+t细胞、cd4+t细胞和cd8+t细胞数量在接种后的第28天、56天和84天时都显著高于对照组d组(p<0.05)，a组接种后cd8+/cd4+的比率也明显高于对照组d组，并且在第56天时差异显著(p<0.05)。4、血清中igg和pcv-ab的测定具体方法同前。血清中免疫球蛋白igg的变化情况如图28所示，在试验期间(0天到84天)，a组的igg含量都显著高于d组(p<0.05)。igg的含量从接种后的第14天开始增长并在第56天达到最高水平。图29为特异性抗pcv-2抗体水平的变化情况。第0天时，实验组和对照组均为pcv2抗体阴性(s/p值小于0.16)，接种后pcv2抗体水平开始增长，a组在第7天、28天、56天和84天时的特异性pcv2抗体水平均显著高于d组(p<0.05)。5、免疫相关基因表达量检测在免疫第0、1、2、4、8、12周时取前腔静脉血液，提取rna，反转录得到cdna。根据genbank中报道的猪的基因序列，设计合成定量pcr特异性引物，见表14。表14猪免疫相关基因引物以cdna为模板，用上述表14的引物进行定量pcr检测相关基因的表达量变化，以ppia作为内参基因，由2-δδct方法计算得出基因的相对的表达量。图30所示为toll样受体基因tlr2和tlr7的表达量变化。与对照组相比，实验组a组的tlr2和tlr7基因的表达量在接种vril-12-cnp后的第7天到第84天均显著增长(p<0.05)。tlr2基因在第28天和84天时，实验组增长水平显著高于对照组(p<0.05)，在第7天、28天和84天时，实验组的tlr7表达量在vril-12-cnp的刺激下显著高于对照组(p<0.05)。如图31所示为细胞因子基因表达量变化情况，在接种vril-12-cnp后，实验组细胞因子表达量均显著高于对照组。a组的il-2基因表达量在第56天时显著高于d组(p<0.05)；il-4基因在第14天、28天以及56天时都显著高于d组(p<0.05)；而il-6基因表达量从第7天开始增长显著(p<0.05)；il-12基因在第7天、28天、56天和84天时的表达量显著高于对照组d组(p<0.05)。免疫信号转导分子基因stat1，stat2，stat3，stat4，cd45和bcl-2的表达量变化如图32所示。实验组a组的stat1基因表达量在接种vril-12-cnp后的第7天、14天、56天和84天都显著高于d组(p<0.05)，stat2，stat3和stat4基因的表达量在第7天到56天也显著高于d组(p<0.05)；接种后第14天时，a组bcl-2基因表达量显著高于d组(p<0.05)；a组cd45的表达量从第7天到84天均显著高于d组(p<0.05)。序列表<110>四川大学<120>藏猪il-12重组质粒增强pcv2疫苗免疫佐剂的制备方法及应用<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>1878<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atgcaccttcagcagctggttgtctcctggttttccctggtttggctggcatctcccatt60gtggccatatgggaactggagaaaaatgtttatgtcgtagagttggactggtaccccaat120gcccctggagaaatggtggtcctcacctgcaacacccctgaagaagacggcatcacgtgg180acctcagaccagagcagtgaggtcttgggcactggcaaaaccctgaccatccacgtcaaa240gagtttggagatgctggccagtacacctgtcgcaaaggaggcgcagttctgagccagtca300ctcctgctgcttcacaaaaaggaagatggaatttggtccactgatattttaaaagaccag360aaagagcccaaaaacaagagctttctaaaatgtgaggcaaagaattactccggacgtttc420acctgctggtggctgacggcaatcagtactgatttgaaattcagtgtcaaaagcagcaga480ggctccgctgacccccgtggcgtgacatgtggcacggcaatgctctcagaggacctcggg540gagtataagtacagagtggagtgtcaggagggcagtgcctgcccagccgctgaggagagc600ctgcccattgaggtcgtgctggaagctgttcacaagcttaagtatgaaaactacaccagc660agcttcttcatcagggacatcatcaaaccagaccctcccaagaatctgcagctgaaccca720ttaaagaattctcgacacgtggagatcagctgggagtaccctgacacctggagcacccca780cattcctacttttccctgatgtttggtgttcaagttcagggcaagaacaaaagagaaaag840aaagataaactcttcacggaccaaacctcagccaaggttacatgccacaaggatgccaac900atccgcgtgcaagcccgggaccgctactacagctcctcctggagtgaatgggcatctgtg960tcctgcaatggaagcggagagggcaggggaagtcttctaacatgcggggacgtggaggaa1020aatcccgggccaatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtgga1080gcagtcttcgtttcgcccagcggtaccatgtgttcccctgggttcggcctccaaactagc1140gccctcacctgcgacgtccatccatctgcgtccagccgccgactcgctgtcaccgcagcg1200ccgctcagcatgtgcccgctgcgcaacctcctccttgtggccaccctggtcctcctcaac1260cacctggaccatctcagtttgggcaggagcctccctgcaaccacagcaggcccaggaatg1320ttcaaatgcctcaaccactcccaaaatctgctgaaggccgtcagcaacacacttcagaag1380gccaaacaaaccctagaattttactcctgcacttcagaagagatcgatcatgaagatatc1440accaaagataaaaccagcacagtggaggcctgcttaccacttgaactagccacgaatgag1500agttgcctggctgccagagagacctctttaataactaatggaaattgcctgacttctgga1560aagacctcttttatgacaaccctgtgccttagcagtatctacgaggacttgaagatgtac1620catgtggagttccaggccatgaatgcaaagcttctgatggatcctaagaggcagatcttt1680ctggatcagaacatgctgacagctattactgagctgatgcaggctctgaatttcaacagt1740gagactgtgccacagaagccctccctggaagaactggatttttataagactaaaatcaag1800ctctgcatacttcttcatgccttcagaattcgtgcggtgaccatcgacagaatgatgagc1860tatctgaattcttcctaa1878<210>2<211>625<212>prt<213>人工序列<220><223><400>2methisleuglnglnleuvalvalsertrppheserleuvaltrpleu151015alaserproilevalalailetrpgluleuglulysasnvaltyrval202530valgluleuasptrptyrproasnalaproglyglumetvalvalleu354045thrcysasnthrproglugluaspglyilethrtrpthrseraspgln505560sersergluvalleuglythrglylysthrleuthrilehisvallys65707580glupheglyaspalaglyglntyrthrcysarglysglyglyalaval859095leuserglnserleuleuleuleuhislyslysgluaspglyiletrp100105110serthraspileleulysaspglnlysgluprolysasnlysserphe115120125leulyscysglualalysasntyrserglyargphethrcystrptrp130135140leuthralaileserthraspleulyspheservallysserserarg145150155160glyseralaaspproargglyvalthrcysglythralametleuser165170175gluaspleuglyglutyrlystyrargvalglucysglngluglyser180185190alacysproalaalaglugluserleuproilegluvalvalleuglu195200205alavalhislysleulystyrgluasntyrthrserserphepheile210215220argaspileilelysproaspproprolysasnleuglnleuasnpro225230235240leulysasnserarghisvalgluilesertrpglutyrproaspthr245250255trpserthrprohissertyrpheserleumetpheglyvalglnval260265270glnglylysasnlysargglulyslysasplysleuphethraspgln275280285thrseralalysvalthrcyshislysaspalaasnileargvalgln290295300alaargaspargtyrtyrsersersertrpserglutrpalaserval305310315320sercysasnglyserglygluglyargglyserleuleuthrcysgly325330335aspvalglugluasnproglyprometaspalametlysargglyleu340345350cyscysvalleuleuleucysglyalavalphevalserprosergly355360365thrmetcysserproglypheglyleuglnthrseralaleuthrcys370375380aspvalhisproseralaserserargargleualavalthralaala385390395400proleusermetcysproleuargasnleuleuleuvalalathrleu405410415valleuleuasnhisleuasphisleuserleuglyargserleupro420425430alathrthralaglyproglymetphelyscysleuasnhissergln435440445asnleuleulysalavalserasnthrleuglnlysalalysglnthr450455460leugluphetyrsercysthrserglugluileasphisgluaspile465470475480thrlysasplysthrserthrvalglualacysleuproleugluleu485490495alathrasnglusercysleualaalaarggluthrserleuilethr500505510asnglyasncysleuthrserglylysthrserphemetthrthrleu515520525cysleuserseriletyrgluaspleulysmettyrhisvalgluphe530535540glnalametasnalalysleuleumetaspprolysargglnilephe545550555560leuaspglnasnmetleuthralailethrgluleumetglnalaleu565570575asnpheasnsergluthrvalproglnlysproserleuglugluleu580585590aspphetyrlysthrlysilelysleucysileleuleuhisalaphe595600605argileargalavalthrileaspargmetmetsertyrleuasnser610615620ser625当前第1页12