蛋白酶调节的抗体的制作方法

本申请是国际申请日为2013年03月14日、国际申请号为pct/us2013/031363、进入国家阶段的申请号为201380017721.7、发明名称为“蛋白酶调节的抗体”的pct申请的分案申请。

本申请要求2012年3月30日提交的系列号61/617,837的权益，其通过引用以其整体并入本文。

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技术领域是血友病和其它凝血病的治疗。

附图说明

图1.蛋白酶调节的抗体的实施方案的图解说明。vh，重链可变区；vl，轻链可变区；ch，重链恒定区；cl，轻链恒定区。

图2.有和没有凝血酶消化的两个蛋白酶调节的抗tfpifab片段（“fab-1”和“fab-2”）的蛋白印迹。

图3.图形显示通过elisa测定的有和没有凝血酶消化的fab-1和fab-2的组织因子途径抑制剂（tfpi）结合。

图4.图形显示有和没有凝血酶消化的fab-1（fab1）和fab-2（fab2）的tfpi结合的biacore^tm测量。

图5.在hek2936e细胞中表达的纯化的igg抗体的sds-page。

图6.亲本igg（“亲本igg”；顶部）和igg2-接头1（底部）的蛋白印迹。泳道1，用凝血酶（1单位）消化；泳道2，无蛋白酶（对照）；泳道3，用牛纤溶酶消化；泳道4，用肠激酶（0.02µg）消化；泳道5，用牛因子xa（1µg）消化；泳道6，用蛋白裂解酶（matriptase，mtsp）（0.5µg）消化；泳道7，用尿激酶（upa）（0.25µg）消化；泳道8，用人鼻病毒3c蛋白酶（hrv3c）（2单位）消化。

图7.图形显示通过elisa测定的有和没有凝血酶消化的igg的tfpi结合。

图8.图形显示有和没有凝血酶消化的亲本igg和igg-接头1的tfpi结合的biacore^tm测量。

图9.蛋白印迹，显示用人蛋白酶的igg-接头1和wt抗体的蛋白酶消化。

具体实施方式

本公开提供了蛋白酶调节的抗体，其特异性结合组织因子途径抑制剂（tfpi）。所述抗体可用于治疗出血性疾病，例如血友病。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗tfpi抗体可以被凝血酶和/或纤溶酶切割。通过初始抑制tfpi，这些蛋白酶调节的抗tfpi抗体促进凝血酶和/或纤溶酶的生成，其依次切割抗体并去除或显著降低它们对tfpi的结合活性。此负反馈允许所述抗体促进在安全的治疗窗口内的凝血。

1.蛋白酶调节的抗tfpi抗体

本文公开的蛋白酶调节的抗体特异性结合tfpi，即，它们结合tfpi的亲和力高于（例如，至少两倍高于）它们对于不相关抗原（例如bsa，酪蛋白）的结合亲和力。如本文所用术语“组织因子途径抑制剂”或“tfpi”指细胞天然表达的人tfpi的任何变体、同种型和物种同源物。

在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗体结合tfpi，具有至少约10⁵m^-1至约10¹²m^-1的亲和力(例如10⁵m^-1、10^5.5m^-1、10⁶m^-1、10⁶.⁵m^-1、10⁷m^-1、10⁷.⁵m^-1、10⁸m^-1、10⁸.⁵m^-1、10⁹m^-1、10^9.5m^-1、10¹⁰m^-1、10^10.5m^-1、10¹¹m^-1、10^11.5m^-1、10¹²m^-1)。抗体结合抗原的亲和力(kd)可以使用任何本领域已知的方法测定，例如免疫测定诸如酶联免疫特异性测定（elisa）、生物分子相互作用分析（bia）(例如，sjolander&urbaniczky;anal.chem.63:2338-2345,1991;szabo,等,curr.opin.struct.biol.5:699-705,1995)，和用于对表达抗原的细胞上结合的抗体定量的荧光激活细胞分选(facs)。bia是用于实时分析生物特异性相互作用，而不标记任何相互作用物的技术（例如biacore^tm）。光学现象表面等离子体共振（spr）中的变化可以用作生物分子之间的实时反应的指示。

蛋白酶调节的抗tfpi抗体可以使用基本上全长的免疫球蛋白分子（例如igg1、igg2a、igg2b、igg3、igg4、igm、igd、ige、iga），其抗原结合片段，例如fab或f(ab′)2或包含抗原结合位点能够特异性结合tfpi的构建体，例如scfv、fv或二体（diabody）进行构建。术语“抗体”还包括其它蛋白支架，所述其它蛋白支架能够容纳抗体互补决定区（cdr）插入与天然抗体中发现的相同活性结合构象，使得对这些嵌合蛋白观察到的对tfpi的结合相对于所述cdr衍生自的天然抗体的tfpi结合活性得以保留。

如本文所用“分离的抗体”是基本上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体（例如，结合tfpi的分离的抗体基本上不含结合tfpi之外的抗原的抗体）。但是，结合人tfpi的表位、同种型或变体的分离的抗体可以具有对其它相关抗原的的交叉反应性，例如来自其它物种的抗原（例如，tfpi物种同源物）。分离的抗体可以基本上不含其它细胞材料和/或化学品。

本文公开的蛋白酶调节的抗体被工程改造以包含被一种或多种蛋白酶识别的蛋白酶切割位点。如本文所用，“蛋白酶切割位点”指被蛋白酶识别并切割的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述蛋白酶切割位点位于其可变和恒定区之间的位置。在一些实施方案中，所述蛋白酶调节的抗tfpi抗体包括可以被凝血酶、纤溶酶和/或因子xa切割的一个或多个蛋白酶切割位点。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗tfpi抗体的可变和恒定区之间的氨基酸序列除了蛋白酶切割位点之外还包含多肽接头（如例如图1中图解说明）。所述接头可以是单个氨基酸或多肽序列（例如，至多100个氨基酸）。例如所述接头可以是ggggs（seqidno：149）。其它可用的接头包括seqidno：151-176中所示的那些。在其它实施方案中，不存在接头，并且切割位点本身插入在可变和恒定区之间。

已经确定了至少两个最优的凝血酶切割位点：(1)x1-x2-p-r-x3-x4(seqidno:147)，其中x1和x2是疏水氨基酸，并且x3和x4是非酸性氨基酸，和(2)grg。凝血酶特异性在精氨酸残基后切割。纤溶酶也可以切割上述两个切割位点，但是相比凝血酶具有较低的特异性。其它可用的凝血酶切割位点提供为seqidno：1-60。其它可用的纤溶酶切割位点提供为seqidno：12、47、48、53和61-130。在一些实施方案中，所述切割位点是lvprgs(seqidno:137)。

在一些实施方案中，使用因子xa切割位点，例如i-(e或d)-g-r(seqidno:148)。其它可用的因子xa切割位点提供为seqidno：29、59和61-69。其它凝血酶和fxa切割位点或序列可以见于先前的发表，作者为bianchini[bianchiniep等2002jbc]。一种蛋白酶调节的抗体可以包括超过一种蛋白酶切割位点。

除了切割位点，还可以将一个第二蛋白酶结合位点称为外位点（exosite）导入蛋白酶调节的tfpi抗体以使切割更加有效。凝血酶的外位点可以来自蛋白酶底物或抑制剂例如par1、纤维蛋白原和水蛭素的天然外位点。所述外位点还可以是天然外位点的衍生物。

蛋白酶调节的tfpi抗体可以合成或重组产生。可利用一些技术产生抗体。例如，可使用噬菌体-抗体技术生成抗体(knappik等,j.mol.biol.296:57-86,2000)。另一个获得抗体的方法是筛选来自b细胞的dna文库，例如wo91/17271和wo92/01047中所述。在这些方法中，产生噬菌体文库，其中的成员在它们的外表面展示不同的抗体。抗体通常展示为fv或fab片段。通过亲和力富集选择结合所选蛋白的噬菌体展示的抗体。也可以使用三源杂交瘤技术产生抗体(例如,oestberg等,hybridoma2:361-367,1983;美国专利4,634,664;美国专利4,634,666)。

还可以从任何表达抗体的细胞纯化抗体，包括已用编码抗体的表达构建体转染的宿主细胞。所述宿主细胞可以在抗体从中表达的条件下培养。使用本领域熟知的方法，纯化的抗体可以与其它细胞组分分离，所述其它细胞组分在细胞中可以与抗体关联，例如某些蛋白、碳水化合物或脂质。这些方法包括但不限于，尺寸排阻层析、硫酸铵分级、离子交换层析、亲和层析和制备型凝胶电泳。制备物的纯度可以通过任何本领域已知的手段评估，例如sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳。纯化的抗体的制备物可以包含超过一种类型的抗体。

可替代地，蛋白酶调节的抗tfpi抗体可以使用合成其氨基酸序列的化学方法产生，例如通过使用固相技术直接肽合成（例如，merrifield,j.am.chem.soc.85:2149-2154,1963;roberge等,science269:202-204,1995）。可以使用手工技术或通过自动化进行蛋白合成。任选地，抗体片段可以使用化学方法单独合成和组合以产生全长分子。

蛋白酶调节的抗tfpi抗体还可以构建为“单链fv（scfv）形式”，其中蛋白酶切割位点插入scfv的轻链可变区和重链可变区之间的肽接头中或在其附近。因为肽接头对于将用于抗原结合的scfv的两个可变区保持在一起是必需的，所以肽接头或侧翼区域的切割使得目标蛋白酶失活或下调scfv对其抗原的结合。氨基酸序列seqidno:179（其可以由seqidno:180编码）是以scfv形式的蛋白酶调节的抗tfpi抗体的实例。

在一些实施方案中，蛋白酶调节的tfpi抗体构建成“igg形式”，具有两个结合位点，并可以在重链、轻链或两者上包含一个、两个、三个或四个蛋白酶切割位点。在每种情况下，蛋白酶切割位点可以在任一端或两端侧接接头。此外，在每种情况下，所述切割位点可以是相同的或不同的。“igg-接头1”（实施例5）和“igg-接头2”是以igg形式的蛋白酶调节的抗tfpi抗体的实例：

。

2.负反馈

蛋白酶调节的抗体可以包含作为抗体功能的结果上调或生成的蛋白酶的蛋白酶切割位点。这些蛋白酶可以然后切割蛋白酶调节的抗体，由此提供负反馈环，其可以用于防止蛋白酶调节的抗体的过度活性。

例如，可以被凝血酶和/或纤溶酶切割的蛋白酶调节的抗tfpi抗体可以展示这样的负反馈效果。这样的蛋白酶调节的抗tfpi抗体促进凝血酶和/或纤溶酶的生成。凝血酶和纤溶酶会依次切割蛋白酶调节的抗tfpi抗体并去除或显著降低它们对tfpi的结合活性。此负反馈使得所述抗体促进在安全的治疗窗口内的凝血。

3.多核苷酸

本公开还提供编码蛋白酶调节的抗体的多核苷酸。这些多核苷酸可以用于，例如产生大量用于治疗用途的抗体。

编码抗体的cdna分子可以用标准分子生物学技术使用mrna作为模板制备。此后，可以使用本领域已知的和公开于手册（例如，sambrook，等，molecularcloning:alaboratorymanual,(第二版,coldspringharborlaboratorypress;coldspringharbor,n.y.;1989)第1-3卷）的分子生物学技术复制cdna分子。可以使用扩增技术，例如pcr，获得所述多核苷酸的额外拷贝。可替代地，可以使用合成化学技术合成编码蛋白酶调节的抗tfpi抗体的多核苷酸。

为了表达编码抗体的多核苷酸，可以将所述多核苷酸插入表达载体，所述表达载体包含对于插入的编码序列的转录和翻译的必需元件。可以使用本领域技术人员熟知的方法构建包含编码抗体的序列和适当的转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术，合成技术和体内遗传重组。这些技术描述于，例如sambrook,等(1989)和ausubel,等,(currentprotocolsinmolecularbiology,johnwiley&sons,newyork,n.y.,1995)。

可以利用多种表达载体/宿主系统来包含和表达编码抗体的序列。这些包括但不限于，微生物，例如用重组细菌噬菌体、质粒或粘粒dna表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体（例如，杆状病毒）转染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体（例如，花椰菜花叶病毒、camv、烟草花叶病毒、tmv）转化的植物细胞系统；或细菌表达载体（例如ti或pbr22质粒），或动物细胞系统。

控制元件或调节序列是那些载体的非翻译区——增强子、启动子、5'和3'非翻译区——其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和反应。这些元件的强度和特异性可以变化。取决于载体系统和宿主，可以使用任何数目的合适的转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当在细菌系统中克隆时，可以使用诱导型启动子。在昆虫细胞中可以使用杆状病毒多角体启动子。可以将衍生自植物细胞的基因组（例如，热休克，rubisco和贮藏蛋白基因）的启动子或增强子或衍生自植物病毒的启动子或增强子（例如，病毒启动子或前导序列）克隆到载体中。在哺乳动物细胞系统中，可以使用来自哺乳动物基因或来自哺乳动物病毒的启动子。如果有必要生成包含编码抗体的核苷酸序列的多个拷贝的细胞系，可以使用具有适当的可选择标志物的基于sv40或ebv的载体。

描述另外的有用的分子生物学技术（包括抗体的制备）的一般文件是berger和kimmel(guidetomolecularcloningtechniques,methodsinenzymology,vol.152,academicpress,inc.);sambrook,等,(molecularcloning:alaboratorymanual,(secondedition,coldspringharborlaboratorypress;coldspringharbor,n.y.;1989)vol.1-3);currentprotocolsinmolecularbiology,(f.m.ausabeletal.[eds.],currentprotocols,ajointventurebetweengreenpublishingassociates,inc.andjohnwiley&sons,inc.(supplementedthrough2000));harlow等,(monoclonalantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1988),paul[ed.]);fundamentalimmunology,(lippincottwilliams&wilkins(1998));以及harlow,等(usingantibodies:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress(1998))。

4.药物组合物

蛋白酶调节的抗tfpi抗体可以在包含药学可接受的载体的药物组合物中提供。所述药学可接受的载体优选是非热原的。包含蛋白酶调节的抗tfpi抗体的药物组合物可以单独施用或组合至少一种其它试剂（例如稳定化组合物）施用，其可以在任何无菌、生物相容的药物载体中使用，所述载体包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。可以采用各种水性载体，例如0.4%盐水、0.3%甘氨酸等。这些溶液是无菌的并且通常无微粒物质。这些溶液可以通过常规、熟知的灭菌技术（例如，过滤）灭菌。根据需要所述组合物可以包含药学可接受的辅助物质以接近生理条件，如ph调节剂和缓冲剂等。根据所选特定施用方式，药物组合物中蛋白酶调节的抗tfpi抗体的浓度可以广泛地变化，即从少于约0.5％，通常在或至少约1％至高达15％或20％（重量），并且将主要基于流体体积，粘度等进行选择。参见美国专利号5,851,525。如果需要，在药物组合物中可以包括超过一种不同的蛋白酶调节的抗tfpi抗体。

除了活性成分之外，药物组合物可以包含合适的药学可接受的载体，所述载体包含促进组合物加工成可以作为药物使用的制剂的赋形剂和助剂。药物组合物可通过任何数量的途径施用，包括但不限于，口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、经皮、皮下、腹膜内、鼻内、肠胃外、局部、舌下或直肠方式。

已制备药物组合物后，它们可以被放置在适当的容器中，并​​标记用于指示状况的治疗。这样的标记将包括施用的量、频率和方法。

5.方法

包含一种或多种蛋白酶调节的抗tfpi抗体的药物组合物可以单独施用给患者，或组合其它试剂、药物或凝血因子施用给患者以治疗血友病或其它凝血障碍。蛋白酶调节的抗tfpi抗体的“治疗有效剂量”指会促进凝血或减少出血时间的蛋白酶调节的抗tfpi抗体的量。治疗有效剂量的确定完全在本领域技术人员能力范围内。

最初可以在细胞培养测定中或动物模型（通常是大鼠、小鼠、兔、犬或猪）中评价治疗有效剂量。可以使用动物模型确定适当的浓度范围和施用途径。然后可以使用这些信息确定用于在人中施用的有用的剂量和途径。

可以通过标准药学程序在细胞培养或实验动物中确定蛋白酶调节的抗tfpi抗体的治疗效力和毒性，例如ed50（50%的群体中治疗有效的剂量）和ld50（对50%的群体致命的剂量）。毒性对治疗效果的剂量比例是治疗指数，并且其可以表示为比例ld50/ed50。

优选展示大治疗指数的药物组合物。在配制用于人使用的剂量范围中使用获得自细胞培养测定和动物研究的数据。在这些组合物中包含的剂量优选在循环浓度范围内，其包括具有很少或无毒性的ed50。剂量取决于所采用的剂型、患者敏感度和施用途径在此范围内变化。

确切的剂量将由医生根据需要治疗的患者相关的因素来确定。调节剂量和施用以提供足够水平的蛋白酶调节的tfpi抗体或保持所希望的效果。可考虑的因素包括疾病状态的严重性，对象的一般健康状况，对象的年龄、体重和性别，饮食，施用时间和频率，一种或多种药物组合，反应敏感性和对治疗的耐受性/反应。长效药物组合物可以每3至4天，每周，或每两周一次施用，取决于特定制剂的半衰期和清除率。

在一些实施方案中，治疗有效的蛋白酶调节的抗tfpi抗体的体内剂量范围在约5μg至约100mg/kg，约1mg至约50mg/kg，约10mg至约50mg/kg患者体重。

包含蛋白酶调节的抗tfpi抗体的药物组合物的施用模式可以是任何合适的途径，其将抗体递送至宿主（例如，皮下、肌内、静脉内或鼻内施用）。

在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗tfpi抗体不与其它治疗剂一起施用。在一些实施方案中，蛋白酶调节的抗tfpi抗体与其它试剂（例如药物或凝血因子）组合施用，以增强凝血酶的初始产生，同时保证凝血酶水平保持低于在一些具有凝血功能障碍的人中可能导致血栓的范围。蛋白酶调节的抗tfpi抗体的施用可以在其它试剂的施用之前、之后或基本上同时。

本说明书中任何内容都不应被认为限制本公开的范围。提出的所有实施例都是代表性和非限制性的。由本领域技术人员根据所述教导的理解，可以对上述实施方案进行修改或变化。因此，应当理解，在权利要求和它们的等价物的范围内，本文公开的实施方案可以以具体描述的之外的其它方式实施。

实施例1

蛋白酶调节的抗tfpifab片段的构建

两种蛋白酶调节的抗tfpifab，“fab-1”和“fab-2”基于seqidno:177（重链）和seqidno:178（轻链）中所示的抗tfpi抗体序列。两种fab都具有插入到两个可变结构域的c端的凝血酶/纤溶酶蛋白酶切割位点lvprgs(seqidno:137)。fab-1中的切割位点侧接(gly)4ser接头。fab-2仅包含六氨基酸切割位点，不存在接头。凝血酶和纤溶酶将切割相对lvprgs(seqidno:137)的arg（r）残基的c端。编码fab的dna由genscript合成，具有优化的密码子，用于细菌表达。下表中鉴定了用于fab的氨基酸和dna序列。

用限制性酶bsai和hindiii(newenglandbiolabs)消化fab编码区。使用琼脂糖凝胶纯化dna片段并亚克隆到pbadmychisa(invitrogen)中。使用标准技术连接和转化克隆的dna。通过dna测序证实阳性克隆并用于bl21大肠杆菌表达。

实施例2

凝血酶切割的fab的蛋白印迹

约2.5µg粗纯化的fab-1和fab-2用0、2或10个单位的凝血酶(novagen)在37℃消化1小时。消化物在4-15%critereon^tmtgx^tm凝胶(bio-rad)上运行。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人fab抗体(southernbiotech)探测。

fab-1和fab-2切割的蛋白印迹显示于图2。所有样品是还原的。当用凝血酶处理时，对于两种fab均观察到约12kda的条带。在无凝血酶消化的样品中不存在这些条带，表明凝血酶切割的产物是小尺寸蛋白。

实施例3

凝血酶消化的fab-1和fab-2的tfpielisa。

约2.5µg部分纯化的fab-1和fab-2用2个单位的生物素化的凝血酶（novagen）在23℃消化过夜。将链霉亲和素琼脂糖小珠（100µl）添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的fab样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的fab。

maxisorp^®96-孔板(nunc)用1µg/ml的tfpi在pbs中在4℃包被过夜。板在室温下在5%脱脂干乳pbs/0.5%tween-20^®(pbs-t)中封闭1小时。将未消化和消化的fab-1和fab-2的系列两倍稀释添加到孔中（100µl/孔）并在rt孵育1小时。板用pbs-t洗涤5次。添加二级hrp缀合的抗fab抗体（100µl，1:10,000稀释）以用amplex^®red(invitrogen)溶液检测。如图3所示，凝血酶消化显著减少了tfpi结合的信号。

实施例4

凝血酶消化的fab-1和fab-2的biacore^tm测量

约2.5µg粗纯化的fab-1和fab-2用2个单位的生物素化的凝血酶（novagen）在23℃消化过夜。将链霉亲和素琼脂糖小珠（100µl）添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的fab样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的fab。

对于biacore^tm分析，使用胺偶联以100相对单位（ru）的目标水平将人tfpi(americandiagnostica)固定化，并且在流动相中注射抗体。使用hbs-p作为运行缓冲液。使用其中使表面活化并然后失活的不具有任何固定化的蛋白的空白固定化制备参考通道。进行手动运行以测量fab和缓冲液对照的升高的ru。

如图4所示，相比未消化的fab-1（25.6ru）和fab2（27.9ru），不含可切割的接头的亲本fab生成24.6ru。凝血酶切割后，fab-1和fab-2的结合信号减少超过50%，表明切割的fab-1和fab-2不仅丧失恒定结构域还丧失对tfpi的结合活性。

实施例5

igg表达和纯化

基于seqidno:177（重链）和seqidno:178（轻链）中所示的亲本抗tfpi抗体序列构建蛋白酶调节的抗tfpi免疫球蛋白分子“igg-接头1”。为了促进分子克隆，将blpi位点导入到重链编码序列中。相比fab-1中蛋白酶可切割的接头的位置，blpi位点的导入使igg-接头1的接头位置向恒定区迁移两个氨基酸。

hek2936e细胞用构建的igg表达载体转染，并且收获包含igg抗体的培养物上清液。使用mabselectsure^tm亲和柱然后通过superdex^tm200层析纯化抗体。在sds-page上纯化的igg-接头1显示在图5。

实施例6

亲本igg和igg-接头1的蛋白印迹

用凝血酶、牛纤溶酶、牛因子xa、蛋白裂解酶（mtsp）、尿激酶（upa）或人鼻病毒3c蛋白酶（hrv3c）消化纯化的亲本igg和igg-接头1（0.5µg）。抗体与蛋白酶一起在37℃孵育1小时。在4-20%critereon^tmtgx^tm凝胶(bio-rad)上运行消化物。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人igg重链和轻链抗体（pierce）探测。igg2和igg2-接头1的蛋白印迹显示在图6中。所有样品是还原的。

完整的igg在还原条件下产生两个条带。所述两个条带对应重链（50kd）和轻链（25kd）。消化的抗体igg-接头1显示相对未消化的抗体的分子量迁移。使用下列蛋白酶消化抗体：凝血酶、纤溶酶、牛因子xa、mtsp和upa。消化的igg-接头1抗体显示从50kd至37kd的重链的分子量迁移。此大小迁移与vh结构域从重链的丧失有关。还存在25kd轻链向约16kda的模糊条带的分子量迁移，这表明vl结构域从轻链上切割下来。蛋白酶不切割亲本igg，表明分子量丧失是由于工程改造进抗体的切割位点的蛋白酶消化的结果。

实施例7

凝血酶消化的亲本igg和igg-接头1的tfpi-结合elisa

一微克全长抗体、亲本igg和igg-接头1用1单位的生物素化的凝血酶（novagen）在37℃消化1小时。然后将50µl链霉亲和素琼脂糖小珠添加到消化物中以耗尽凝血酶。将消化的igg样品施加到捕获琼脂糖小珠/凝血酶复合物的柱上。洗脱物包含消化的igg。

maxisorp^®96-孔板(nunc)用1µg/ml的tfpi在pbs中在4℃包被过夜。板在室温（rt）下在5%脱脂干乳pbs/0.5%tween-20^®(pbs-t)中封闭1小时。将未消化和消化的亲本igg和igg1-接头1的系列两倍稀释添加到孔中（100µl/孔）并在rt孵育1小时。板在pbs-t中洗涤5次。添加二级hrp缀合的抗fab抗体（100µl，1:10,000稀释）用于用amplex^®red(invitrogen)溶液检测。

tfpi结合elisa的结果显示于图7。显示了凝血酶消化的igg接头-1的tfpi结合的丧失。未消化的igg-接头1的tfpi结合与未消化的和凝血酶消化的亲本igg的tfpi结合类似。

实施例8

亲本igg和igg-接头1的biacore^tm分析

使用胺偶联试剂盒(gehealthcare)用低密度人tfpi固定化cm4传感器芯片。使用不同浓度的抗体进行亲本igg和igg-接头1的动力学测定，随后用ph1.5的甘氨酸缓冲液再生。浓度1µg的亲本igg和igg-接头1抗体用1个单位的生物素化的凝血酶（novagen）在37℃消化1小时。将消化或未消化的抗体注射到biacore^tm系统用于tfpi结合分析。下图显示从注射45µl6.25µg/ml抗体或对照样品生成的信号。

在动力学测定中，亲本igg和igg2-接头1分别具有1.536x10⁶/ms和1.902x10⁶/ms的结合速率（ka）。所述两种抗体在30分钟内不具有可测量的解离。这表明接头1的插入不显著改变所述抗体的结合活性。

凝血酶切割对抗体的效果显示于图8。凝血酶消化略减少亲本igg在tfpi上的结合，而凝血酶消化将igg2-接头1在tfpi上的结合从20ru减少到5ru，75%的减少。

实施例9

蛋白酶/凝血因子处理的igg-接头1和亲本igg的蛋白印迹

使用下列人蛋白酶/凝血因子消化80nm的igg-接头1和wt抗体：凝血酶(0.1μm)、纤溶酶(0.1μm)、因子viia(0.01μm)、因子ixa(0.089μm)、因子xa(13μm)、因子xia(0.031μm)、因子xiiia(0.03μm)。在4-15%critereon^tmtgx凝胶(bio-rad)上运行处理的材料。将蛋白转移到硝酸纤维素膜上并用抗人igg抗体(pierce)探测。

人凝血酶、纤溶酶和因子xa消化的igg-接头1、凝血酶消化最有效（图9），如通过37kda条带的外观所示。蛋白酶不切割亲本igg，表明分子量丧失是由于工程改造进抗体的切割位点的蛋白酶消化的结果。

序列表

<110>tbd

<120>蛋白酶调节的抗体

<130>012973.01274

<160>180

<170>fastseq用于windowsversion4.0

<210>1

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>1

alahisproargileileserala

15

<210>2

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>2

alaargthrargalaargargpro

15

<210>3

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>3

alaseralaargthrthrglyser

15

<210>4

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>4

alathrproargglyalaalapro

15

<210>5

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>5

alavalvalargthrproprolys

15

<210>6

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>6

gluargthrargserpheglnleu

15

<210>7

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>7

pheglyleuargphetyralatyr

15

<210>8

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>8

pheasnproargthrpheglyser

15

<210>9

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>9

pheargprolyshisthrargile

15

<210>10

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>10

pheseralaargglyhisargpro

15

<210>11

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>11

glyaspileargglyproargile

15

<210>12

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>12

glyglyvalargglyproargval

15

<210>13

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>13

glyserpheargalaglyleuphe

15

<210>14

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>14

hislysglyargseralaleuval

15

<210>15

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>15

ilealaglyargserleuasnpro

15

<210>16

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>16

ileaspglyargilevalglugly

15

<210>17

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>17

ilegluproargserphesergln

15

<210>18

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>18

ilelysproargilevalglygly

15

<210>19

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>19

ileglnileargservalalalys

15

<210>20

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>20

ileglnileargservalalalys

15

<210>21

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>21

lysasnvallysserlysilegly

15

<210>22

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>22

lysprolysaspserservalasp

15

<210>23

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>23

leuaspproargserpheleuleu

15

<210>24

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>24

leuglyileargserpheargasn

15

<210>25

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>25

leuproilelysthrphearggly

15

<210>26

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>26

leuargproargphelysileile

15

<210>27

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>27

leuargproargileileglygly

15

<210>28

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>28

leuserproargglyvalhisile

15

<210>29

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>29

leuserproargthrphehispro

15

<210>30

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>30

metthrproargsergluglyser

15

<210>31

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>31

metthrproargserglyglyser

15

<210>32

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>32

metthrproargserargglyser

15

<210>33

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>33

metvalproargalavaltyrleu

15

<210>34

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>34

asnvalproargileleuserpro

15

<210>35

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>35

proalaproargglytyrprogly

15

<210>36

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>36

proaspleuargsercysvalasn

15

<210>37

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>37

proglyproargglypropropro

15

<210>38

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>38

proglyserargserargthrpro

15

<210>39

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>39

proglnglyargilevalglygly

15

<210>40

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>40

proglnglyargthrthralahis

15

<210>41

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>41

proargserpheleuleuargasn

15

<210>42

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>42

glnserproargserpheglnlys

15

<210>43

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>43

glnserproargserpheglnlys

15

<210>44

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>44

glntyrleuargvalproleuval

15

<210>45

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>45

serglupheargcysleuthrpro

15

<210>46

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>46

serileglyargalaserleuhis

15

<210>47

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>47

serlysglyargserleuilegly

15

<210>48

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>48

serargleuargalatyrleuleu

15

<210>49

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>49

thrcysleuargserthrlysphe

15

<210>50

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>50

valcysleuargserpheglnthr

15

<210>51

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>51

valaspproargleuileaspgly

15

<210>52

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>52

valgluvallysserglulysleu

15

<210>53

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>53

valileprolysargileserpro

15

<210>54

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>54

valileproargserglyglyser

15

<210>55

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>55

valasnproargglyilevalthr

15

<210>56

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>56

valglnproargalaglnlysile

15

<210>57

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>57

valserproargalaseralaser

15

<210>58

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>58

valvalproargglyvalasnleu

15

<210>59

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>59

trptyrleuargserasnasngly

15

<210>60

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>60

trptyrleuargserasnthrgly

15

<210>61

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>61

alaphetrplysthraspalaser

15

<210>62

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>62

ilegluglyargthralathrser

15

<210>63

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>63

thralaalaargglnserthrasn

15

<210>64

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>64

ileaspglyargilevalglugly

15

<210>65

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>65

pheasnproargthrpheglyser

15

<210>66

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>66

argvalprolysserpheprophe

15

<210>67

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>67

proglnleuargmetlysasnasn

15

<210>68

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>68

sersertrpargleuthrserser

15

<210>69

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>69

leuglyileargserpheargasn

15

<210>70

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>70

alametserargmetserleuser

15

<210>71

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>71

alaasnasnargaspasnthrtyr

15

<210>72

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>72

alaasnvalargarglysargtyr

15

<210>73

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>73

alaargglyargalapheprogln

15

<210>74

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>74

alathrleulysserarglysmet

15

<210>75

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>75

alathrglnlyslysvalgluarg

15

<210>76

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>76

alathrtrplysthrargtrptyr

15

<210>77

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>77

aspvalglyglutyrasnvalphe

15

<210>78

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>78

glualaargglyservalileleu

15

<210>79

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>79

glualatyrargargphetyrgly

15

<210>80

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>80

gluaspasnargaspsersermet

15

<210>81

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>81

gluthrleulysvalileaspglu

15

<210>82

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>82

pheargalaargalatyrglyphe

15

<210>83

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>83

glyglualaargglyservalile

15

<210>84

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>84

glyglytyrargalaargproala

15

<210>85

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>85

glyileleulysgluasnalaala

15

<210>86

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>86

glyprolysargglythrglupro

15

<210>87

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>87

ileileargargserileglnile

15

<210>88

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>88

ilethrpheargmetasnvalala

15

<210>89

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>89

lyshisserlysarghisilehis

15

<210>90

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>90

lyslysaspargalaargglnglu

15

<210>91

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>91

lyslysproargcysglyvalpro

15

<210>92

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>92

lysglnvallysaspasngluasn

15

<210>93

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>93

leuaspproargserpheleuleu

15

<210>94

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>94

leuproprolysserglnpropro

15

<210>95

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>95

leuserpheargalaargalatyr

15

<210>96

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>96

metsermetargvalargarghis

15

<210>97

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>97

asnserglyargalavalthrtyr

15

<210>98

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>98

proalaproargglytyrprogly

15

<210>99

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>99

proglualalysalasercystyr

15

<210>100

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>100

progluserlysalathrasnala

15

<210>101

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>101

proglyprolysargglythrglu

15

<210>102

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>102

prolysalalysserhisalapro

15

<210>103

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>103

proleuasplyslysarggluglu

15

<210>104

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>104

proleuglnlysglnleuproala

15

<210>105

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>105

proglnpheargilelysglygly

15

<210>106

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>106

proglnleuargleuprohisthr

15

<210>107

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>107

proglnleuargargglytrparg

15

<210>108

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>108

proglnserargservalpropro

15

<210>109

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>109

proargphelysileileglygly

15

<210>110

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>110

protyrleulysvalpheasnpro

15

<210>111

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>111

glnlysserargasnglyleuarg

15

<210>112

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>112

glnleuilelysalaileglnleu

15

<210>113

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>113

glnargtyrlysvalasptyrglu

15

<210>114

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>114

argalaglnargseralaglyala

15

<210>115

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>115

argglyproargvalvalgluarg

15

<210>116

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>116

argproalalysalaalaalathr

15

<210>117

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>117

argarglysargtyralailegln

15

<210>118

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>118

argserserlysglyargserleu

15

<210>119

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>119

argserthrargphealaalathr

15

<210>120

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>120

sercysasplysthrhisthrcys

15

<210>121

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>121

serileasnlysserserproleu

15

<210>122

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>122

serglnproproglulysthrglu

15

<210>123

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>123

serglnarglyshisserlysarg

15

<210>124

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>124

sersermetlysleuserphearg

15

<210>125

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>125

thrgluprolysvallysleupro

15

<210>126

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>126

thrglutyrargleuvalserile

15

<210>127

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>127

thrhisglulysglyargglnser

15

<210>128

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>128

thrtyrserlysalaserthrpro

15

<210>129

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>129

thrtyrserargserargtyrleu

15

<210>130

<211>8

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>130

valserasnlysvalsermetser

15

<210>131

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-1轻链

<400>131

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglyglyglyserleu

100105110

valproargglyserglyglyglyglyserglyglnprolysalaala

115120125

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

130135140

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

145150155160

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

165170175

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

180185190

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

195200205

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

210215220

thrglucysser

225

<210>132

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点和接头

<400>132

glyglyglyglyserleuvalproargglyserglyglyglyglyser

151015

<210>133

<211>245

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-1重链

<400>133

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserglyglyglyglyserleuvalproargglyser

115120125

glyglyglyglyseralaserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

195200205

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

210215220

thrlysvalasplysthrvalasptyrlysaspaspaspasplyshis

225230235240

hishishishishis

245

<210>134

<211>1590

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>编码fab-1的序列

<400>134

ggtctcacatgaaaaaaaccgctatcgctatcgccgtcgcactggctggcttcgcaaccg60

tggcacaggcatcctatgaactgacccaaccgccgagtgtctccgtgtcaccgggtcaga120

cggcacgtattacctgcagcggtgataacctgccgaaatattacgcgcattggtatcagc180

aaaaaccgggccaagccccggtggttgtcatcttttatgacgttaatcgtccgtccggta240

tcccggaacgcttctcgggcagcaactctggtaatacggcaaccctgacgatcagcggca300

cccaggcaatggatgaagctgactattactgtcaagcatggtggagctctacgccggtgt360

ttggcggtggcacgaaactgaccgtgctgggtggcggtggctctctggttccgcgtggct420

ccggtggcggtggctcaggccagccgaaagcagcaccgagtgttaccctgtttccgccga480

gttccgaagaactgcaagcaaacaaagctaccctggtgtgcctgattagcgatttctatc540

cgggcgcagttacggtcgcgtggaaagccgactcatcgccggtgaaagctggtgttgaaa600

ccacgaccccgtcaaaacagtcgaacaataaatatgcagctagctcttacctgtctctga660

ccccggaacagtggaaaagtcatcgcagttactcctgtcaagttacgcacgaaggctcca720

cggtcgaaaaaaccgtggcaccgacggaatgctcatgataagcatgcgtaggagaaaata780

aaatgaaacagtctaccatcgcactggcactgctgccgctgctgtttacgccggtgacca840

aagcagaagttcagctggtcgaaagtggtggcggtctggttcaaccgggcggttcactgc900

gtctgtcgtgcgcagcaagcggttttaccttcagttcctatggtatggattgggtccgtc960

aggcaccgggtaaaggtctggaatgggtgtcatcgattcgtggcagccgcggttctacct1020

attacgccgattcagttaaaggccgttttaccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgc1080

tgtatctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgccgtgtattactgtgcccgtc1140

tgtatcgctactggttcgactactggggccagggtacgctggtgaccgttagctctggcg1200

gtggcggttcgctggtcccgcgtggcagcggcggtggcggttcagcgagcaccaaaggtc1260

cgagcgtgtttccgctggcaccgtgcagccgctctaccagtgaatccacggcagctctgg1320

gttgtctggtgaaagattattttccggaaccggtcaccgtgagttggaactccggcgcac1380

tgacctcgggtgttcatacgttcccggctgtcctgcagagttccggcctgtatagcctgt1440

catcggtggttaccgttccgagctctaatttcggcacccaaacgtacacctgcaacgtcg1500

atcacaaaccgtctaataccaaagttgacaaaacggttgattacaaagacgacgacgaca1560

aacaccaccaccaccaccattgataagctt1590

<210>135

<211>218

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2轻链

<400>135

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuleuvalproargglyser

100105110

glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserser

115120125

glugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileserasp

130135140

phetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserpro

145150155160

vallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasn

165170175

lystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplys

180185190

serhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrval

195200205

glulysthrvalalaprothrglucysser

210215

<210>136

<211>235

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2重链

<400>136

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserleuvalproargglyseralaserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaprocysserargserthrsergluser

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnval

195200205

asphislysproserasnthrlysvalasplysthrvalasptyrlys

210215220

aspaspaspasplyshishishishishishis

225230235

<210>137

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶切位点

<400>137

leuvalproargglyser

15

<210>138

<211>1530

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>fab-2编码序列

<400>138

ggtctcacatgaaaaaaacggctatcgcaatcgctgtggcactggcaggcttcgcaacgg60

tcgcgcaggcatcctatgaactgacgcaaccgccgagtgtctccgtgtcaccgggtcaga120

cggcacgtattacctgctctggtgataacctgccgaaatattacgcgcattggtatcagc180

aaaaaccgggccaagccccggtggttgtcatcttttatgacgttaatcgtccgtcgggta240

tcccggaacgcttctcgggcagcaactctggtaatacggccaccctgacgatctcaggca300

cccaggcaatggatgaagctgactattactgccaagcatggtggagctctacgccggtgt360

ttggcggtggcacgaaactgaccgttctgctggtcccgcgtggctccggtcagccgaaag420

cagccccgtcagttaccctgtttccgccgagttccgaagaactgcaagcaaacaaagcta480

ccctggtgtgtctgattagcgatttctatccgggcgcagttacggtcgcgtggaaagccg540

actcatcgccggtcaaagctggtgtggaaaccaccaccccgtcaaaacagtcgaacaata600

aatatgcagctagctcttacctgtcgctgaccccggaacagtggaaaagccatcgcagtt660

actcctgccaagttacgcacgaaggctctacggttgaaaaaaccgtcgcaccgacggaat720

gcagttgataagcatgcgtaggagaaaataaaatgaaacagagcaccatcgcactggcac780

tgctgccgctgctgtttacgccggtcaccaaagcagaagtgcagctggttgaatctggtg840

gcggtctggtgcaaccgggcggttcactgcgtctgtcgtgtgcggccagcggctttacct900

tcagttcctatggtatggattgggtccgtcaggcaccgggtaaaggtctggaatgggtgt960

catcgattcgtggcagccgcggttctacctattacgccgattccgttaaaggccgtttca1020

ccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgctgtatctgcagatgaacagtctgcgcgcgg1080

aagataccgccgtgtattactgcgcccgtctgtatcgctactggtttgactactggggcc1140

agggtacgctggtgaccgttagctctctggttccgcgtggctcagcgagcaccaaaggtc1200

cgagtgtcttcccgctggcaccgtgcagccgctctaccagtgaatccacggcagctctgg1260

gttgtctggtgaaagattattttccggaaccggtcaccgtgagttggaactccggcgcac1320

tgacctccggtgtgcatacgttcccggctgttctgcagagttccggcctgtattcactgt1380

catcggtggttaccgtgccgagctctaattttggcacccaaacgtacacctgtaacgttg1440

atcacaaaccgagcaataccaaagttgacaaaaccgttgactacaaagacgacgacgaca1500

aacaccaccaccaccaccactgataagctt1530

<210>139

<211>228

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头1,轻链氨基酸序列

<400>139

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglyglyglyserleu

100105110

valproargglyserglyglyglyglyserglyglnprolysalaala

115120125

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

130135140

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

145150155160

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

165170175

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

180185190

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

195200205

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

210215220

thrglucysser

225

<210>140

<211>458

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头1,重链氨基酸序列

<400>140

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserglyglyglyglyserleuvalproarg

115120125

glyserglyglyglyglyserthrlysglyproservalpheproleu

130135140

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

145150155160

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

165170175

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

180185190

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

195200205

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

210215220

thrlysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucyspro

225230235240

procysproalaproprovalalaglyproservalpheleuphepro

245250255

prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr

260265270

cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasn

275280285

trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg

290295300

glugluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrval

305310315320

valhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser

325330335

asnlysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlys

340345350

glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargglu

355360365

glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe

370375380

tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu

385390395400

asnasntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphe

405410415

pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly

420425430

asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

435440445

thrglnlysserleuserleuserprogly

450455

<210>141

<211>684

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头1，轻链dna序列

<400>141

tcctacgagctgacccagcccccttccgtgtccgtgtctcctggccagaccgcccggatc60

acctgttccggcgacaacctgcccaagtactacgcccactggtatcagcagaagcccggc120

caggcccccgtggtggtcatcttctacgacgtgaaccggccctccggcatccccgagaga180

ttctccggctccaactccggcaacaccgccaccctgaccatctccggcacccaggccatg240

gacgaggccgactactactgccaggcttggtggtcctccacccccgtgtttggcggcgga300

acaaagttaaccgtgctgggcggtggaggatcactggttccgcgtggctctggcggtgga360

ggatcaggccagcccaaggccgctccttccgtgaccctgttccccccatcctccgaggaa420

ctgcaggccaacaaggccaccctggtctgcctgatctccgacttctaccctggcgccgtg480

accgtggcctggaaggccgacagctctcctgtgaaggccggcgtggaaaccaccaccccc540

tccaagcagtccaacaacaaatacgccgcctcctcctacctgtccctgacccccgagcag600

tggaagtcccaccggtcctacagctgccaggtcacacacgagggctccaccgtggaaaag660

acagtggcccccaccgagtgctct684

<210>142

<211>1374

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头1,重链dna序列

<400>142

gaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatctctgagactg60

tcctgcgccgcctccggcttcaccttctccagctacggcatggactgggtccgacaggcc120

cctggcaagggcctggaatgggtgtcctccatccggggctctcggggctccacctactac180

gccgactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtac240

ctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagactgtac300

cggtattggttcgactactggggccagggcaccctggtcaccgtcagctcagcttctggc360

ggaggcggctctctggtgcctagaggatctggcggcggaggctccaccaagggcccttcc420

gtgttccctctggccccttgctcccggtccacctccgagtctaccgccgctctgggctgc480

ctggtcaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgtcctggaactctggcgccctgacc540

agcggcgtgcacaccttccctgccgtgctgcagtcctccggcctgtactccctgtcctcc600

gtcgtgacagtgccctcctccaacttcggcacccagacctacacctgtaacgtggaccac660

aagccctccaacaccaaggtggacaagaccgtggaacggaagtgctgcgtggaatgcccc720

ccctgtcctgcacctcctgtggctggacctagcgtgttcctgttccccccaaagcccaag780

gacaccctgatgatctcccggacccccgaagtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccac840

gaggaccccgaggtgcagttcaattggtacgtggacggcgtggaagtgcacaacgccaag900

accaagcccagagaggaacagttcaactccaccttccgggtggtgtccgtgctgaccgtg960

gtgcaccaggactggctgaacggcaaagagtacaagtgcaaggtctccaacaagggcctg1020

cctgcccccatcgaaaagaccatcagcaagaccaagggccagccccgcgagccccaggtg1080

tacacactgccacctagccgggaagagatgaccaagaaccaggtgtccctgacctgtctg1140

gtcaagggcttctacccatccgacattgccgtggaatgggagtccaacggccagcccgag1200

aacaactacaagaccaccccccccatgctggactccgacggctcattcttcctgtactcc1260

aagctgacagtggacaagtcccggtggcagcagggcaacgtgttctcctgctccgtgatg1320

cacgaggccctgcacaaccactacacccagaagtccctgtccctgagccccggc1374

<210>143

<211>218

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头2,轻链氨基酸序列

<400>143

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuleuvalproargglyser

100105110

glyglnprolysalaalaproservalthrleupheproproserser

115120125

glugluleuglnalaasnlysalathrleuvalcysleuileserasp

130135140

phetyrproglyalavalthrvalalatrplysalaaspserserpro

145150155160

vallysalaglyvalgluthrthrthrproserlysglnserasnasn

165170175

lystyralaalasersertyrleuserleuthrprogluglntrplys

180185190

serhisargsertyrsercysglnvalthrhisgluglyserthrval

195200205

glulysthrvalalaprothrglucysser

210215

<210>144

<211>448

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头2,重链氨基酸序列

<400>144

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserleuvalproargglyserthrlysgly

115120125

proservalpheproleualaprocysserargserthrsergluser

130135140

thralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluproval

145150155160

thrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhisthrphe

165170175

proalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalval

180185190

thrvalproserserasnpheglythrglnthrtyrthrcysasnval

195200205

asphislysproserasnthrlysvalasplysthrvalgluarglys

210215220

cyscysvalglucysproprocysproalaproprovalalaglypro

225230235240

servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileser

245250255

argthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasp

260265270

progluvalglnpheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasn

275280285

alalysthrlysproargglugluglnpheasnserthrpheargval

290295300

valservalleuthrvalvalhisglnasptrpleuasnglylysglu

305310315320

tyrlyscyslysvalserasnlysglyleuproalaproileglulys

325330335

thrileserlysthrlysglyglnproarggluproglnvaltyrthr

340345350

leuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthr

355360365

cysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpglu

370375380

serasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprometleu

385390395400

aspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplys

405410415

serargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglu

420425430

alaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserprogly

435440445

<210>145

<211>654

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头2，轻链dna序列

<400>145

tcctacgagctgacccagcccccttccgtgtccgtgtctcctggccagaccgcccggatc60

acctgttccggcgacaacctgcccaagtactacgcccactggtatcagcagaagcccggc120

caggcccccgtggtggtcatcttctacgacgtgaaccggccctccggcatccccgagaga180

ttctccggctccaactccggcaacaccgccaccctgaccatctccggcacccaggccatg240

gacgaggccgactactactgccaggcttggtggtcctccacccccgtgtttggcggcgga300

acaaagttaaccgtgctgctggttccgcgtggctctggccagcccaaggccgctccttcc360

gtgaccctgttccccccatcctccgaggaactgcaggccaacaaggccaccctggtctgc420

ctgatctccgacttctaccctggcgccgtgaccgtggcctggaaggccgacagctctcct480

gtgaaggccggcgtggaaaccaccaccccctccaagcagtccaacaacaaatacgccgcc540

tcctcctacctgtccctgacccccgagcagtggaagtcccaccggtcctacagctgccag600

gtcacacacgagggctccaccgtggaaaagacagtggcccccaccgagtgctct654

<210>146

<211>1344

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>igg2-接头2,重链dna序列

<400>146

gaggtgcagctggtggaatccggcggaggcctggtccagcctggcggatctctgagactg60

tcctgcgccgcctccggcttcaccttctccagctacggcatggactgggtccgacaggcc120

cctggcaagggcctggaatgggtgtcctccatccggggctctcggggctccacctactac180

gccgactccgtgaagggccggttcaccatctcccgggacaactccaagaacaccctgtac240

ctgcagatgaactccctgcgggccgaggacaccgccgtgtactactgcgccagactgtac300

cggtattggttcgactactggggccagggcaccctggtcaccgtcagctcagcttctctg360

gtgcctagaggatctaccaagggcccttccgtgttccctctggccccttgctcccggtcc420

acctccgagtctaccgccgctctgggctgcctggtcaaggattacttccccgagcccgtg480

accgtgtcctggaactctggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttccctgccgtgctg540

cagtcctccggcctgtactccctgtcctccgtcgtgacagtgccctcctccaacttcggc600

acccagacctacacctgtaacgtggaccacaagccctccaacaccaaggtggacaagacc660

gtggaacggaagtgctgcgtggaatgccccccctgtcctgcacctcctgtggctggacct720

agcgtgttcctgttccccccaaagcccaaggacaccctgatgatctcccggacccccgaa780

gtgacctgcgtggtggtggacgtgtcccacgaggaccccgaggtgcagttcaattggtac840

gtggacggcgtggaagtgcacaacgccaagaccaagcccagagaggaacagttcaactcc900

accttccgggtggtgtccgtgctgaccgtggtgcaccaggactggctgaacggcaaagag960

tacaagtgcaaggtctccaacaagggcctgcctgcccccatcgaaaagaccatcagcaag1020

accaagggccagccccgcgagccccaggtgtacacactgccacctagccgggaagagatg1080

accaagaaccaggtgtccctgacctgtctggtcaagggcttctacccatccgacattgcc1140

gtggaatgggagtccaacggccagcccgagaacaactacaagaccaccccccccatgctg1200

gactccgacggctcattcttcctgtactccaagctgacagtggacaagtcccggtggcag1260

cagggcaacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaaccactacacccag1320

aagtccctgtccctgagccccggc1344

<210>147

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>凝血酶切割位点

<221>变体

<222>(1)...(2)

<223>xaa=疏水氨基酸

<221>变体

<222>(5)...(6)

<223>xaa=非酸性氨基酸

<400>147

xaaxaaproargxaaxaa

15

<210>148

<211>4

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>因子xa切割位点

<221>变体

<222>(2)...(2)

<223>xaa=glu或asp

<400>148

ilexaaglyarg

1

<210>149

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>149

glyglyglyglyser

15

<210>150

<211>58

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>seqidno:133的氨基酸95-152

<400>150

tyrcysalaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglngly

151015

thrleuvalthrvalserseralaserglyserglyglyglyleuval

202530

proargglyserglyglyglyglyserthrlysglyproservalphe

354045

proleualaprocysserargserthrser

5055

<210>151

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>151

alalysthrthrprolysleuglugluglyglupheserglualaarg

151015

<210>152

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>152

alalysthrthrprolysleuglugluglyglupheserglualaarg

151015

val

<210>153

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>153

alalysthrthrprolysleuglygly

15

<210>154

<211>10

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>154

seralalysthrthrprolysleuglygly

1510

<210>155

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>155

seralalysthrthrpro

15

<210>156

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>156

argalaaspalaalapro

15

<210>157

<211>9

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>157

argalaaspalaalaprothrvalser

15

<210>158

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>158

argalaaspalaalaalaalaglyglyproglyser

1510

<210>159

<211>27

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>159

argalaaspalaalaalaalaglyglyglyglyserglyglyglygly

151015

serglyglyglyglyserglyglyglyglyser

2025

<210>160

<211>18

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>160

seralalysthrthrprolysleuglugluglygluphesergluala

151015

argval

<210>161

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>161

alaaspalaalapro

15

<210>162

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>162

alaaspalaalaprothrvalserilephepropro

1510

<210>163

<211>5

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>163

thrvalalaalapro

15

<210>164

<211>12

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>164

thrvalalaalaproservalpheilephepropro

1510

<210>165

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>165

glnprolysalaalapro

15

<210>166

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>166

glnprolysalaalaproservalthrleuphepropro

1510

<210>167

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>167

alalysthrthrpropro

15

<210>168

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>168

alalysthrthrproproservalthrproleualapro

1510

<210>169

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>169

alalysthrthralapro

15

<210>170

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>170

alalysthrthralaproservaltyrproleualapro

1510

<210>171

<211>6

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>171

alaserthrlysglypro

15

<210>172

<211>13

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>172

alaserthrlysglyproservalpheproleualapro

1510

<210>173

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>173

glyglyglyglyserglyglyglyglyserglyglyglyglyser

151015

<210>174

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>174

glygluasnlysvalglutyralaproalaleumetalaleuser

151015

<210>175

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>175

glyproalalysgluleuthrproleulysglualalysvalser

151015

<210>176

<211>15

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>氨基酸接头

<400>176

glyhisglualaalaalavalmetglnvalglntyrproalaser

151015

<210>177

<211>442

<212>prt

<213>智人

<400>177

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleu

115120125

alaprocysserargserthrsergluserthralaalaleuglycys

130135140

leuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrpasnser

145150155160

glyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnser

165170175

serglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserasn

180185190

pheglythrglnthrtyrthrcysasnvalasphislysproserasn

195200205

thrlysvalasplysthrvalgluarglyscyscysvalglucyspro

210215220

procysproalaproprovalalaglyproservalpheleuphepro

225230235240

prolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthr

245250255

cysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvalglnpheasn

260265270

trptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproarg

275280285

glugluglnpheasnserthrpheargvalvalservalleuthrval

290295300

valhisglnasptrpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalser

305310315320

asnlysglyleuproalaproileglulysthrileserlysthrlys

325330335

glyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserargglu

340345350

glumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphe

355360365

tyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnproglu

370375380

asnasntyrlysthrthrproprometleuaspseraspglyserphe

385390395400

pheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglngly

405410415

asnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyr

420425430

thrglnlysserleuserleuserprogly

435440

<210>178

<211>212

<212>prt

<213>智人

<400>178

sertyrgluleuthrglnproproservalservalserproglygln

151015

thralaargilethrcysserglyaspasnleuprolystyrtyrala

202530

histrptyrglnglnlysproglyglnalaprovalvalvalilephe

354045

tyraspvalasnargproserglyileprogluargpheserglyser

505560

asnserglyasnthralathrleuthrileserglythrglnalamet

65707580

aspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrpserserthrproval

859095

pheglyglyglythrlysleuthrvalleuglyglnprolysalaala

100105110

proservalthrleupheproproserserglugluleuglnalaasn

115120125

lysalathrleuvalcysleuileseraspphetyrproglyalaval

130135140

thrvalalatrplysalaaspserserprovallysalaglyvalglu

145150155160

thrthrthrproserlysglnserasnasnlystyralaalaserser

165170175

tyrleuserleuthrprogluglntrplysserhisargsertyrser

180185190

cysglnvalthrhisgluglyserthrvalglulysthrvalalapro

195200205

thrglucysser

210

<210>179

<211>239

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶可切割的抗tfpiscfv抗体

<400>179

gluvalglnleuvalgluserglyglyglyleuvalglnproglygly

151015

serleuargleusercysalaalaserglyphethrphesersertyr

202530

glymetasptrpvalargglnalaproglylysglyleuglutrpval

354045

serserileargglyserargglyserthrtyrtyralaaspserval

505560

lysglyargphethrileserargaspasnserlysasnthrleutyr

65707580

leuglnmetasnserleuargalagluaspthralavaltyrtyrcys

859095

alaargleutyrargtyrtrppheasptyrtrpglyglnglythrleu

100105110

valthrvalserserglyglyglyglyserleuvalproargglyser

115120125

glyglyglyglysersertyrgluleuthrglnproproservalser

130135140

valserproglyglnthralaargilethrcysserglyaspasnleu

145150155160

prolystyrtyralahistrptyrglnglnlysproglyglnalapro

165170175

valvalvalilephetyraspvalasnargproserglyileproglu

180185190

argpheserglyserasnserglyasnthralathrleuthrileser

195200205

glythrglnalametaspglualaasptyrtyrcysglnalatrptrp

210215220

serserthrprovalpheglyglyglythrlysleuthrvalleu

225230235

<210>180

<211>717

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>蛋白酶可切割的抗tfpiscfv抗体编码序列

<400>180

gaagttcagctggtcgaaagtggtggcggtctggttcaaccgggcggttcactgcgtctg60

tcgtgcgcagcaagcggttttaccttcagttcctatggtatggattgggtccgtcaggca120

ccgggtaaaggtctggaatgggtgtcatcgattcgtggcagccgcggttctacctattac180

gccgattcagttaaaggccgttttaccatctctcgcgacaacagtaaaaatacgctgtat240

ctgcagatgaacagcctgcgcgcggaagataccgccgtgtattactgtgcccgtctgtat300

cgctactggttcgactactggggccagggtacgctggtgaccgttagctctggtggcggt360

ggctctctggttccgcgtggctccggtggcggtggctcatcctatgaactgacccaaccg420

ccgagtgtctccgtgtcaccgggtcagacggcacgtattacctgcagcggtgataacctg480

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ttttatgacgttaatcgtccgtccggtatcccggaacgcttctcgggcagcaactctggt600

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