前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin9型的结合蛋白及其应用的制作方法

本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明涉及前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin9型(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9，pcsk9)的结合蛋白及其应用。
背景技术：
：心血管疾病是导致人类死亡的头号杀手。低密度脂蛋白胆固醇(low-densitylipoproteincholesterol，ldl-c)已被证实是导致心血管疾病的主要因素之一。ldl-c的这种作用是相对独立且可以有效控制的，在过去20年中，他汀(statins)类降脂药的使用成功地减少了心血管疾病的发病率。但是他汀类药物治疗的方法却不总是有效的，还存在着一种另外的降血脂疗法的需求。一部分病人，尤其是家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolaemiafh)患者，往往对于他汀类的药物很不敏感。即使使用了最高剂量的他汀类药物，这些患者也很难达到一个较低的ldl-c水平。此外，他汀类药物还存在着一些诸如引起肌痛及横纹肌溶解等副作用，导致一些病人不能使用或者只能很小剂量使用他汀药物来控制血脂水平。前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶kexin9型(pcsk9)抑制剂正是一种这样的全新药物类型，提供了一个全新的控制血液中ldl-c浓度的选择。pcsk9是一种丝氨酸蛋白酶，参与调解低密度脂蛋白受体(low-densitylipoproteinreceptor，ldlr)的水平。体外实验证实，在hepg2细胞中加入pcsk9之后，细胞表面的ldlr水平降低。小鼠实验显示，pcsk9蛋白水平的提高能降低肝脏中ldlr的蛋白水平，同时，相对于正常小鼠，在pcsk9敲除小鼠中ldlr水平有所提高。业已显示pcsk9与ldlr直接结合，并与ldlr同时被吞噬，在整个内吞途径中pcsk9与ldlr共发生免疫荧光。目前没有pcsk9降解胞外ldlr的直接证据，其降低胞外ldlr蛋白水平的机制尚不明确。研究已证实pcsk9在调控ldl产生中起作用。pcsk9的表达或上调与增加的ldl胆固醇的血浆水平有关，pcsk9表达的抑制或缺乏与ldl胆固醇血浆水平低有关。因此，制备抑制或拮抗pcsk9活性和pcsk9在各种治疗状况下所发挥的相应作用的、基于治疗的pcsk9拮抗剂尤其是特异性结合pcsk9的单克隆抗体非常重要。目前在研的pcsk9抑制剂大概包括小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)、反义寡核苷酸(antisenseoligonucleotides，asos)、单克隆抗体以及一些应用新技术产生的特异性结合融合蛋白，如adnectin技术产生的融合蛋白。目前正在研究的pcsk9抑制剂主要是sirna类药物rg7652(alnylampharmaceuticals/themedicinescompany)，adnectin技术融合蛋白bms-962476(bms)，aso类药物aln-pcs02(iderapharmaceuticals)，抗体类药物如bococizumab(pfizer/rinat)、lgt-209(novartis)等。但是，动物试验或临床研究中发现，一些pcsk9单克隆抗体类抑制剂，还存在着特异性、亲和力不够理想或存在副作用的问题，因此，本领域需要进一步优化及制备新的抗pcsk9抗体。技术实现要素：本发明的目的在于提供前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin9型(pcsk9)的结合蛋白及其应用。在本发明的第一方面，提供特异性结合pcsk9的结合蛋白，该结合蛋白具有轻链可变区和重链可变区，且，其重链可变区的cdr1的氨基酸序列如seqidno:7或seqidno:13所示的氨基酸序列；其重链可变区的cdr2的氨基酸序列如seqidno:8所示；其重链可变区的cdr3的氨基酸序列如seqidno:9或seqidno:14所示的氨基酸序列；其轻链可变区的cdr1的氨基酸序列如seqidno:10所示；其轻链可变区的cdr2的氨基酸序列如seqidno:11所示；其轻链可变区的cdr3的氨基酸序列如seqidno:12所示。在本发明的一个优选例中，所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白选自：(a)，其重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seqidno:7、seqidno:8、seqidno:9所示；其轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示；或(b)，其重链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seqidno:13、seqidno:8、seqidno:14所示；其轻链可变区的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列如seqidno:10、seqidno:11、seqidno:12所示。在另一优选例中，所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白，其特征在于，其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:2和seqidno:4所示；或其重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:6和seqidno:8所示。在另一优选例中，所述的结合蛋白是fab、f(ab’)、f(ab’)2、fv、dab、fd、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体。在另一优选例中，所述的结合蛋白是单克隆抗体。在另一优选例中，所述的结合蛋白的重链可变区和轻链可变区分别具有seqidno:2和seqidno:4所示的氨基酸序列，或分别具有seqidno:6和seqidno:8所示的氨基酸序列，其重链恒定区选择下组中重链类型之一的恒定区：iggl、igg2a、igg2b和igg3，和其轻链恒定区选择下组轻链类型的恒定区之一：κ链和λ链；在本发明的另一方面，提供编码所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白的核酸。在本发明的另一方面，提供一种表达载体，其包含所述的核酸。在本发明的另一方面，提供一种宿主细胞，其包含所述的表达载体或基因组中整合有所述的核酸。在本发明的另一方面，提供所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白在制备用于诊断、治疗和/或预防pcsk9表达或活性失调相关疾病的药物中的用途。在一个优选例中，所述的pcsk9表达或活性失调相关疾病包括但不限于：高血清胆固醇水平相关的病症；较佳地，包括：高胆固醇血症，冠心病，代谢综合征，急性冠状动脉综合症。在本发明的另一方面，提供一种药物组合物，所述药物组合物含有：有效量的所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白；和药学上可接受的载体。在本发明的另一方面，提供一种用于治疗和/或预防pcsk9表达或活性失调相关疾病的药盒，该药盒中包括：所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白；或所述的药物组合物。在本发明的另一方面，提供一种免疫辍合物，所述的免疫辍合物包括：所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白；以及可检测标记物；较佳地，所述可检测标记物包括：荧光标记物、显色标记物。在本发明的另一方面，提供一种用于检测pcsk9水平的检测试剂盒，该检测试剂盒中包括：所述的特异性结合pcsk9的结合蛋白；或所述的免疫辍合物。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1、单克隆抗体b9287、b9288分别对于人pcsk9抗原、小鼠pcsk9抗原、食蟹猕猴pcsk9抗原的动力学分析结果。图2、本发明的抗原结合蛋白降低细胞吸收ldl的能力测定。图3、抗pcsk9优选抗体对高脂血症恒河猴血清ldl水平的反应。每组各有4只年龄>7岁的公及母恒河猴，于第0天经皮下注射以给予所示剂量的pcsk9优选抗体或相等体积的盐水载体。在所示时间点采集血浆样本及测量血浆ldl量与第0天的血清ldl量相比较。具体实施方式本发明人经过广泛而深入的研究，获得一种含有独特的互补决定区(cdr区)的特异性结合前蛋白转化酶枯草溶菌素kexin9型(proproteinconvertasesubtilisinkexintype9，pcsk9)的结合蛋白，其能与pcsk9特异性结合并有效抑制pcsk9的功能、降低血浆中ldl胆固醇水平，可以应用于治疗与pcsk9功能相关或者是受到pcsk9功能影响的疾病。结合蛋白本发明提供了能特异性结合pcsk9的结合蛋白。本发明的结合蛋白可以是完整的免疫球蛋白分子，也可以是抗原结合片段，包括但不限于fab片段，fd片段，fv片段，f(ab’)2片段、互补决定区(cdr)片段、单链抗体(scfv)、结构域抗体，二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体等。cdr区是免疫学感兴趣的蛋白质的序列。在本发明的实施方案中，结合蛋白可包含本文揭示的二、三、四、五或者所有六个cdr区。优选地，本发明的结合蛋白包含本文揭示的至少两个cdr。本发明的另一方面包括本文所述结合蛋白的功能变体。如果变体能与亲代结合蛋白竞争特异性结合pcsk9，则认为该变体分子是本发明结合蛋白的功能变体。换句话说，所述功能变体仍能结合pcsk9或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似、但是含有例如在亲代结合蛋白中未发现的体外或体内化学和/或生物化学修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等。换句话说，亲代结合蛋白的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合蛋白的结合特性，即所述结合蛋白仍能识别并结合其靶位。所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机pcr介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族己经在本领域中限定。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除了上述家族之外的其它氨基酸残基家族分类方式。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性的指导。功能变体可包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合蛋白相比可具有相同或不同的、更高或更低的结合亲和性，但是仍能结合pcsk9或其片段。例如，本发明的功能变体与亲代结合蛋白相比对于pcsk9或其片段可具有增加或降低(优选增加)的结合亲和性。优选地，可变区包括但不限于构架区、高变区或cdr区的氨基酸序列被修饰。通常，轻链和重链可变区包含三个高变区，包括三个cdr，以及更保守的区域，即所谓的构架区((fr)。高变区包含来自cdr的氨基酸残基和来自高变环的氨基酸残基。在本发明范围内的功能变体与本文所述亲代结合蛋白具有至少大约50％至大约99％、优选至少大约60％至大约99％、更优选至少大约70％至大约99％、甚至更优选至少大约80％至大约99％、最优选至少大约90％至大约99％、特别是至少大约95％至大约99％，以及特别是至少大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如gap或者bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合蛋白或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错pcr、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。作为本发明的优选方式，所述的结合蛋白是单克隆抗体。抗体的抗原结合特性可由位于重链和轻链可变区的3个特定的区域来描述，称为互补决定区(cdr)，所述的cdr区将可变区间隔成4个框架区域(fr)，4个fr的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些cdr形成环状结构，通过其间的fr形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的cdr和相应轻链上的cdr构成了抗体的抗原结合位点。本发明的抗pcsk9单克隆抗体的cdr区是全新的，不同于现有的抗pcsk9抗体。本发明的单克隆抗体是全人源的，具有免疫原性低、安全性高的特点。本发明另一方面提供了编码本发明的至少一种结合蛋白、其功能变体或者免疫缀合物的核酸分子。这种核酸分子可以用作中间物以进行克隆，例如用于如上述的亲和力成熟方法中。在一个优选的实施方案中，所述核酸分子是分离或纯化的。dna分子的序列可以用常规技术，或利用杂交瘤技术获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明的结合蛋白(或其片段，或其衍生物)的dna序列。然后可将该dna序列引入本领域中已知的各种现有的dna分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明的结合蛋白的序列中。本发明还涉及包含上述的适当dna序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。优选的，本发明的载体是例如含病毒启动子的质粒表达载体，且在所述表达载体中分别插入了抗pcsk9单克隆抗体重链可变区(vh)与恒定区的igg2(来自人源igg2的恒定区)融合序列和轻链可变区vl与人体iglambda(来自人源iglambda的恒定区)融合序列。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：细菌细胞如大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇s2或sf9；动物细胞如cho、cos7、nso或bowes黑素瘤细胞等。特别适用于本发明的宿主细胞是真核宿主细胞，尤其是哺乳动物细胞，如cho细胞、293细胞。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的结合蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。药物组合物本发明的结合分子可用于制备诊断、治疗和/或预防pcsk9表达或活性失调相关疾病的药物组合物。所述的“pcsk9表达或活性失调相关疾病”包括高血清胆固醇水平相关的病症。较佳地，所述的“pcsk9表达或活性失调相关疾病”包括但不限于高胆固醇血症、冠心病、代谢综合征、急性冠状动脉综合症以及相关病症。所述pcsk9功能指需要pcsk9参与或者被pcsk9加剧或增强的任何活性及功能。所述pcsk9单抗还可在检测和定量pcsk9，以用于各种诊断目的。基于本发明的新发现，还提供了一种可诊断、治疗和/或预防pcsk9表达或活性失调相关疾病的药物组合物，其包含：有效量的本发明所述的结合分子；以及药学上可接受的载体。本文所用的术语“药学上可接受的”是指当分子本体和组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。本发明的药物组合物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式例如可以采用注射或其它治疗方式。本发明的结合分子可以以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独应用或者于包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中应用。换句话说，所述结合分子可以组合应用，例如作为包含两或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用，但是或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、治疗或诊断作用。本发明的结合分子或药物组合在用于人体之前可以在合适的动物模型系统中检测。这种动物模型系统包括但不限于小鼠、猴。本发明的结合分子的合适的剂量范围可例如是0.001-100mg/kg体重，优选0.01-15mg/kg体重。此外，例如可以给予一次推注、随时间给予多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。用于诊断、预防和/或治疗的其它分子可以以与本发明的结合分子相似的给药方案给予。如果单独给予其它分子，则可以在给予本发明的一或多种结合分子或药物组合物之前、同时或者之后给予患者。对于人患者的精确给药方案通常在临床实验期间挑选出。本发明所述的结合分子可被置于适当的包装中，制成药盒，以便于临床医师使用。较佳地，所述的药盒中也可包含说明如何给药的使用说明书。本发明还包括降低血清胆固醇水平、治疗或预防患者中与高血清胆固醇水平相关的疾病的方法，所述方法包括给予患者有效量的本发明的至少一种单克隆抗体。较佳地，可以将本发明的单克隆抗体与提高ldlr蛋白的利用率的药剂联合给药。所述的提高ldlr蛋白的利用率的药剂包括：阿托伐他汀，西立伐他汀，氟伐他汀，洛伐他汀，美伐他汀，匹伐他汀，罗苏伐他汀，辛伐他汀，也可以选用两种以上所述的提高ldlr蛋白的利用率的药剂。免疫缀合物另一方面，本发明包括免疫缀合物，即包含本文所述至少一个结合蛋白以及进一步包含至少一个功能性分子(如可检测的部分/物质的分子)。所述抗体与所述功能性分子可以通过共价连接、偶联、附着、交联等方式构成辍合物。本发明的免疫缀合物可包含一个以上的标记。所述标记也可以通过共价键与本发明的结合蛋白直接结合/缀合。或者，所述标记可以通过一或多种连接化合物与所述结合蛋白结合/缀合。标记与结合蛋白的缀合技术为本领域技术人员所熟知。本发明的免疫缀合物的标记也可以是治疗剂。所述免疫缀合物可包含：本发明的抗体以及可检测标记物。所述的可检测标记物包括但不限于：荧光标记物、显色标记物；如：酶、辅基、荧光材料、发光材料，生物发光材料、放射性材料、正电子发射金属以及非放射性顺磁性金属离子。也可包含一个以上的标记物。为了检测和/或分析和/或诊断目的用于标记抗体的标记依赖于使用的特定检测/分析/诊断技术和/或方法例如免疫组织化学染色(组织)样品、流式细胞计量术等。对于本领域已知的检测/分析/诊断技术和/或方法合适的标记为本领域技术人员所熟知。此外，本发明的人结合蛋白或者免疫缀合物也可以附着于固体支持物上，其特别用于pcsk9蛋白或其片段的体外免疫测定或者纯化。这种固体支持物可以是多孔或者无孔的、平面或非平面的。本发明的结合蛋白可以与标记序列融合以便于纯化。所述标记序列的例子包括但不限于六组氨酸标记、血凝素(ha)标记、myc标记或者flag标记。或者，一种抗体可以与另一种抗体缀合形成抗体异源缀合物(heteroconjugate)。检测试剂和试剂盒以本发明所述的结合分子为基础，可制备方便、快速且准确地检测待测样品中pcsk9水平的试剂或试剂盒。如本文所用，术语“待测样品”涵盖了多种样品类型，包括生物学来源的血液及其它体液样品，实体组织样品如活检组织样品或者组织培养物，或者衍生自其中的细胞或者其后代。该术语还包括在获得后已经通过任何方式处理的样品，例如用试剂处理、溶解、或者富集某些成分如蛋白质或者多核苷酸。因此，本发明提供了一种用于检测待测样品中pcsk9水平的检测试剂盒，该试剂盒中含有本发明的pcsk9结合分子，或pcsk9结合分子与可检测标记物构成的免疫缀合物。在获得了本发明提供的pcsk9结合分子后，可以方便地制备出用于特异性检测pcsk9水平的检测试剂盒。为了在检测时更方便，所述试剂盒中除了含有本发明的结合分子或含有pcsk9结合分子与可检测标记物构成的免疫缀合物以外，还可以包含其它检测试剂或辅助试剂，所述的辅助试剂例如是elisa试剂盒中常规使用的一些试剂，这些试剂的特性以及它们的配制方法均是本领域技术人员所熟知的，如显色剂、标记物、二抗、抗抗体、增敏剂等。本领域人员应理解，各种变化形式的检测试剂盒均是包含在本发明中的，只要在其中利用了本发明的结合分子作为识别pcsk9的试剂。此外，在所述试剂盒中还可包含使用说明书，用于说明其中装载的试剂的使用方法。在获得了本发明提供的结合分子和/或试剂盒后，可以利用多种免疫学相关方法来检测样品中pcsk9或其含量，从而得知待测样品的供体是否存在pcsk9表达或活性失调相关疾病。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如j.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1、pcsk9单克隆抗体的优化与筛选为了找寻符合要求的pcsk9抗体，本发明人经过大量的研究和筛选，从全人源噬菌体库中获得了两株性能优异的单克隆抗体。它们的可变结构域的核酸序列及氨基酸序列描述如下：1、单克隆抗体重链可变区核苷酸序列如seqidno:1。重链可变区氨基酸序列如seqidno:2。重链的各cdr区氨基酸序列：hcdr1：aftfdsfgmh(seqidno:7)；hcdr2：llwsdgsdeyyadsakg(seqidno:8)；hcdr3：avgaiyqfyamdv(seqidno:9)。重链各cdr区的核苷酸序列：hcdr1：gcctccgccttcaccttcgacagcttcggcatgcac(seqidno:15)；hcdr2：ctgctttggagcgacggctccgacgagtactacgccgactccgctaagggc(seqidno:16)；hcdr3：gcggtgggcgccatctaccagttctacgccatggacgtg(seqidno:17)。轻链核苷酸序列如seqidno:3。轻链氨基酸序列如seqidno:4。轻链的各cdr区氨基酸序列：lcdr1：tgtssnignqfvs(seqidno:10)；lcdr2：eynkrps(seqidno:11)；lcdr3：gswdsslsgyv(seqidno:12)。轻链的各cdr区核苷酸序列：lcdr1：accggcacctcctccaacatcggcaaccaattcgtgtcc(seqidno:18)；lcdr2：gagtacaacaagcggccctcc(seqidno:19)；lcdr3：ggctcctgggactcttccctgtccggctatgtg(seqidno:20)。2、单克隆抗体b9288重链核苷酸序列如seqidno:5。重链氨基酸序列如seqidno:6。重链的各cdr区氨基酸序列：hcdr1：asaftfdsfgmh(seqidno:13)；hcdr2：llwsdgsdeyyadsakg(seqidno:8)；hcdr3：avgsiyyyyamdv(seqidno:14)。重链的各cdr区核苷酸序列：hcdr1：gcctccgccttcaccttcgacagcttcggcatgcac(seqidno:21)；hcdr2：ctgctttggagcgacggctccgacgagtactacgccgactccgctaagggc(seqidno:22)；hcdr3：gcggtgggctccatctactactactacgccatggacgtg(seqidno:23)。单克隆抗体b9288轻链核苷酸和氨基酸序列同b9287的轻链核苷酸和氨基酸序列，其相应的各cdr区也同b9287。实施例2、由转染的细胞制备pcsk9单克隆抗体将前述单克隆抗体b9287的重链核苷酸序列两端加上hindiii/noti位点，插入到pcdna3.1+质粒的相应位点中；将前述单克隆抗体b9287的轻链核苷酸序列两端加上hindiii/noti位点，插入到pcdna3.1+质粒的相应位点中。获得表达所述单克隆抗体b9287的重组质粒。将前述单克隆抗体b9288的重链核苷酸序列两端加上hindiii/noti位点，插入到pcdna3.1+质粒的相应位点中；将前述单克隆抗体b9288的轻链核苷酸序列两端加上hindiii/noti位点，插入到pcdna3.1+质粒的相应位点中。获得表达所述单克隆抗体b9288的重组质粒。将上述重组质粒用脂质体法瞬时转染悬浮hek293细胞。在expi293expression培养基中，37℃，co28％，120rpm转速条件下培养前述获得的转染细胞。经过大量培养的转染细胞，通过二级离心处理(第一级离心条件10min，1000g；第二级离心条件30min，10000g)，去除细胞和细胞碎片，得到上清液。将澄清的上清液装载入proteina亲和层析柱，通过用三步淋洗(淋洗缓冲液依次为pb150mmnaclph6.5；20mmna-citrate1mnaclph5.5；20mmna-citrateph5.5)来去除杂质，然后通过ph线性洗脱方式(起始缓冲液a：20mmna-citrateph5.5；目标缓冲液b：20mmna-citrateph3.0)来分离捕获目标抗体。最后通过超滤浓缩步骤将目标抗体置换至200mmhepe，100mmnacl，50mmnaoacph7.0缓冲液中。实施例3、pcsk9单克隆抗体的生物分析表征1、毛细管电泳(ce-sds)通过labchipgxii系统进行毛细管电泳分析抗体。结果表明，在还原和非还原条件下，本发明的pcsk9单克隆抗体样品的峰纯度百分比和分子量如表1(非还原条件)和表2(还原条件)所示。表1表22、分子筛液相色谱(se-hplc)单克隆抗体通过0.2μm过滤器过滤(thomson，目录号25535-100)，然后加载到mabpacsec-1柱(thermo，目录编号07469620)。流动相缓冲为50mm磷酸钠，300mm氯化钠，ph6.2，流速为0.2ml/min。峰值计算使用chemstation软件进行整合。本发明的pcsk9单克隆抗体的主峰和聚体峰的百分比如表3所示。表3id#主峰纯度％聚体纯度％b9287>99.9％<0.01％b9288>99.9％<0.01％3、差示扫描量热法评价蛋白质的稳定性差示扫描量热法(dsc)是一种在需要增加样本和参考温度的热量差异作为温度的函数的测量技术。差示扫描量热法可用于测量多个蛋白质的特性，包括50％蛋白质变性(tm)时的温度/熔化温度，这是评价蛋白质的稳定性的一种方法。被检测抗体以1mg/ml的浓度被装入nanodsc样品室，从25℃到100℃以1℃/min的速度升温进行。样品检测前预先扫描了15分钟以确保实施之前有个准确的起始温度。样品数据中减去了只有缓冲液的样品数值；使用nanodsc软件来计算tm。结果见表4。表4id#tm(℃)b928763℃，74℃b928861℃，73℃实施例4、抗体与pcsk9结合的表征pcsk9单抗与人、小鼠或食蟹猕猴pcsk9相结合的能力采用octetred96系统(fortebio)来进行表征。抗人iggfc(ahc)的动力学级生物传感器(fortebio，#18-5063)在ph1.7的甘氨酸预处理后浸泡在测定缓冲液中。被检测pcsk9单克隆抗体以10μg/ml的浓度被固定到ahc生物传感器120秒。加载了pcsk9单克隆抗体的ahc生物传感器然后被浸入到不同浓度的人pcsk9抗原(genebankax127530.1)、小鼠pcsk9抗原(ncbinm_153565.2)或食蟹猕猴pcsk9抗原(ncbinm_001112660.1)和缓冲液中。分析物柱的最后稀释点只包含检测缓冲液，以测试缓冲液与负载生物传感器之间的非特异性结合。从80到120秒检测到了抗原与抗体结合，随后120到180秒发生解离。用检测缓冲液确定了60秒的基线。抗pcsk9的单克隆抗体的亲和力曲线是以一个1:1结合的动力学传感单价结合模型拟合的。动力学分析如图1和表5所示。表5上样id样品idkd(m)kon(1/ms)kdis(1/s)fullx^2fullr^2b9287hupcsk9<1.0e-123.09e+05<1.0e-070.04440.9989b9288hupcsk9<1.0e-122.52e+05<1.0e-070.0160.9995b9287cynopcsk92.9e-112.48e+057.21e-060.01020.9995b9288cynopcsk94.1e-102.51e+051.03e-040.01260.999b9287mspcsk99.80e-092.70e+052.70e-030.03080.9994b9288mspcsk96.60e-091.40e+059.20e-040.01230.9994实施例5、细胞ldl吸收测定将人hepg2细胞以每孔5×104个细胞的浓度铺在黑色透明的96-孔板(costar)中的补充有10％fbs的dmem培养基(mediatech，inc)中，并于37℃(5％co2)过夜孵育。为了形成pcsk9和抗体复合体，让20μg/ml的人pcsk9与用吸收缓冲液(含10％fbs的dmem)稀释的各种浓度的抗体或单用缓冲液(对照)在室温下孵育1小时。去除细胞上清后加入pcsk9/抗体混合物，接着加入以8μg/ml最终浓度稀释在吸收缓冲液中的dil-ldl(invitrogen)。在37℃(5％co2)孵育16-18小时后，用pbs彻底洗涤细胞，通过tecanm1000554nm(激发)和571nm(发射)检测细胞荧光信号。细胞吸收测定结果示于图2中。概括地说，测定了pcsk9单克隆抗体的ic50值，具体来说数值为3.94nm(b9287)和1.46nm(b9288)pm(图2)。上述结果说明，本发明的抗原结合蛋白具有优异的降低细胞吸收ldl的能力。实施例6、恒河猴体内pcsk9单抗对于血液中ldl水平的影响在高脂血症恒河猴中测试pcsk9单克隆抗体b9287降低非灵长类动物疾病模型体内血清ldl的效果。4只7岁以上具有高脂血症的恒河猴于第0天经单次皮下注射方式注射载体(pbs+0.01％tween20)或以3mg/kg剂量的pcsk9单克隆抗体b9287。分别于第0、1、3、5、7、9、11、14天隔夜禁食后分析血清ldl含量。结果如图3。单次注射3mg/kgpcsk9单克隆抗体b9287在所有4只动物中产生血清ldl(50％及以上)的大幅降低。同样地，本发明人也在高脂血症恒河猴中测试pcsk9单克隆抗体b9288降低体内血清ldl的效果。结果也证明pcsk9单克隆抗体b9288能够显著降低恒河猴中血清ldl水平。因此，pcsk9抗体降低非人灵长动物疾病模型的血清ldl水平。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。当前第1页12