一种1‑氨基环丙烷‑1‑羧酸氧化酶的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明属于单克隆抗体生物
技术领域：
，特别涉及一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体及其应用。
背景技术：
：1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶是由aco基因编码的一种非血红素铁酶(zhangz,schofieldcj,baldwinje,thomasp,johnp.biochem.j.307:77–85)，这种酶属于氧化还原酶家族，广泛存在于植物中，特别是果实。1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶是催化乙烯合成的限速酶，起到调控果实的发育和成熟的作用(pirrungmc,kaiserlm,chenjbiochemistry.32(29):7445–50)。目前市面上并没有专门针对果实成熟研究的1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的靶向抗体，因此，在蛋白组学层面上，对于该研究领域缺乏有效的抗体工具，用于不同植物类型、不同品系或不同发育时期该酶表达能力水平的研究。技术实现要素：本发明提供一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体及其应用，以解决现有技术存在的上述缺陷，本发明通过提供一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同植物类型、不同品系或不同发育时期的蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。本发明的技术方案如下：本发明合成1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶多肽，即四组‘nyppcpnpel’‘gglillfqdd’‘hsivinlgdq’和‘svehrviaqt’，分别以其作为免疫原，免疫小鼠得到淋巴细胞，并利用杂交瘤细胞融合技术制得融合细胞，经免疫印迹法、有限稀释法和elisa法，得到能够产物高亲和性和高特异性的单克隆抗体的细胞株，及由该细胞株分泌的单克隆抗体，并经免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱和抗体芯片检测等验证，确定最有效抗体。一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区序列包含seqidno.2所示的cdr1的氨基酸序列、seqidno.4所示的cdr2的氨基酸序列和seqidno.6所示的cdr3的氨基酸序列；和轻链可变区序列包含seqidno.9所示的cdr1的氨基酸序列、seqidno.11所示的cdr2的氨基酸序列和seqidno.13所示的cdr3的氨基酸序列。优选为，所述的重链可变区序列的框架区依次包含seqidno.1、3、5和7所示的氨基酸序列，和所述的轻链可变区序列的框架区依次包含seqidno.8、10、12和14所示的氨基酸序列。本发明还公开了上述1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体在检测1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶上的应用，包括用于检测果实不同发育阶段1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的含量变化。与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明的一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体，对1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶具有高亲和力和高特异性，能广泛地用于对1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶检测上，特别可用于检测果实不同发育阶段1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的含量变化；此外，本发明的单克隆抗体提供了一个靶向蛋白研究的工具，使得对不同植物类型、不同品系或不同发育时期的蛋白表达变化及蛋白网络图谱的更深层次研究得以实现。附图说明图1为苹果全蛋白裂解液与克隆号1h16anti-aco1抗体的内源蛋白印记wb验证结果示意图；图2为苹果全蛋白裂解液与克隆号1h16anti-aco1抗体和对照抗体的抗体芯片检测结果示意图；图3为本发明克隆号1h16anti-aco1抗体与不同浓度1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶elisa反应制得的标准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。本发明未特别的说明，以下实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段，且所用的原料、试剂也均为市售可购买得到的商品。实施例1一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体杂交瘤细胞的制备和抗1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体的制备和纯化1.1抗原的制备合成四组1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶多肽‘nyppcpnpel’‘gglillfqdd’‘hsivinlgdq’和‘svehrviaqt’，并分别以其作为免疫原，上述多肽也均偶联了vlp以及传统klh系统的免疫原性增强因子。1.2免疫小鼠每组抗原将用来免疫6只balb/c小鼠(8-12周龄)，并监测其血清效价以决定最优的免疫次数。每个6免疫原多肽混合成一组。优化了的佐剂和免疫方法能产生针对大多数抗原多肽的高亲和力的抗体(igg亚型)。初次免疫后会经过3到4次的加强，加强后将取小鼠血清检测滴度(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的重组蛋白作为抗抗原包被)。滴度合格的小鼠将冲击一次并用于融合，不合格的小鼠将继续一到两次加强，至滴度最高后融合。1.3血清检测和筛选免疫小鼠眼眶取血，并用elisa检测血清滴度(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的重组蛋白作为抗原包被)。血清效价需大于10k，否则继续加强免疫。1.4融合及筛选取全脾和1/2的淋巴结，与骨髓瘤sp2/0细胞系融合。工艺为优化过的peg融合。融合细胞铺到4块384孔板上(每孔细胞102到104)，进行培养。收集所有孔的上清，用elisa对多肽检测原进行筛选，镜检有细胞的阳性孔转到96孔板继续培养。生长几天后，收集所有孔的上清用elisa检测与可溶片段检测原的反应。阳性孔进一步检测不同稀释度的可溶片段检测原结合，以进行亲和力排序。每个多肽免疫原亲和力最高的20个亲代克隆进入亚克隆。每个可溶片段免疫原亲和力最高的60个亲代克隆进入亚克隆。1.5亚克隆及筛选通过有限稀释法和elisa筛选进行亚克隆，得到单克隆杂交瘤细胞。细胞铺96孔板，并培养至覆盖约1/6的底部。elisa检测每个孔上清针对可溶片段检测原和相应多肽检测原的反应，取od值高且细胞状态良好的两个孔进入下轮亚克隆。重复上述步骤直到孔中细胞株阳性率100％。此时我们得到单克隆细胞株。经过最后一轮亚克隆后，所有阳性细胞立即扩大培养，一部分冻存供以后使用，另一部分进行上清或腹水制备。1.6抗体上清制备和纯化最终获得8株单克隆细胞株，并通过腹部注射到f1小鼠用于抗体生产。产生的腹水用proteina/g纯化，并用于后续检测。实施例2抗ck18单克隆抗体的验证对获得的8株单克隆抗体细胞株进行免疫酶联，蛋白印记，免疫共沉淀加质谱，抗体芯片等验证，确定最有效抗体。2.1抗体与抗原多肽的elisa(免疫酶联)配对验证取待配对腹水抗体包被96孔elisa板，孵育，洗涤后脱脂牛奶过夜封闭，pbs洗涤，4℃保存待用。抗原多肽孵育，pbs洗涤，同时设置对照。hrp标记检测抗体，加入到孵育有前述的elisa板中。tmb显色反应，酶标仪读数。筛选得到8个细胞株的效价如表一所示：表一2.2抗体的内源蛋白印记(wb)验证使用苹果全蛋白裂解液，抗体稀释浓度1：1000、1：2000及1:5000进行wb验证。实验结果显示，anti-aco1(克隆1h16)在wb验证中，可以特异性的识别36kd条带，与预期大小相符，如图1所示。2.3抗体的免疫共沉淀(ip)加质谱验证提取苹果全蛋白1mg，使用anti-aco1(克隆1h16)进行免疫沉淀，ip产物切取36kd大小条带进行质谱检测。质谱结果如表二所示，aco1在ip样品中大量富集，说明本抗体对aco1识别的特异性高，并且，本抗体可以应用于ip实验。表二2.4抗体芯片检测实验使用芯片点样仪将anti-aco1(克隆1h16)抗体及对照抗体点制于以nc膜为基质的玻璃片，形成直径为100um的抗体点。将苹果全蛋白进行生物素标记，按2ug/ml的浓度孵育在抗体芯片上，室温孵育半小时。pbs轻柔清洗三遍，再用cy3-sa荧光二抗进行孵育，pbs清洗三遍，使用genepix荧光芯片扫描仪523nm扫描芯片。实验结果如图2所示，anti-aco1抗体对目标蛋白有明显富集结合效果，荧光强度较强，而对照抗体没有发生抗原抗体结合反应。实施例3本发明的一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体在果实发育阶段检测的应用由于本发明的抗体对1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶具有独特的特异性，可作为专门检测水果果实发育阶段的检测抗体，或者本领域根据常规技术手段也可将其进一步开发为检测试剂盒。首先，本发明抗体以固定浓度(1mg/ml)与不同浓度1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶重组蛋白的标准品进行elisa实验，得到相应的od值，并绘制出标准曲线，横坐标为1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的浓度坐标，纵坐标为酶标仪测得的光密度值(od值)，如图3所示。该标准曲线用于后续将待测样本检测的od值换算成该酶的浓度；其中标准品为1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的重组蛋白，通过bca蛋白定量以及考染跑胶确认浓度，并按10ug/ml,5ug/ml,2.5ug/ml,1.25ug/ml倍比稀释，如表三所示。表三标准品浓度(ug/ml)1052.51.25标准品od值3.1252.3951.6140.956然后，取不同桃类的组织液体样本进行elisa实验，使用相同的本发明抗体浓度(1mg/ml)进行检测，得到的od值代入标准曲线计算，即得到水果的实际酶含量及对应的成熟度，如表四所示。表四检测od值酶浓度换算(mg/ml)果实成熟度水蜜桃2.6954.30软糯黄桃2.3212.96较软糯油桃1.8741.89较脆樱桃1.2621.03脆实施例4将1h16克隆号anti-aco1抗体的杂交瘤细胞株进行培养并提取总rna，将mrna反转录成第一链cdna；通过pcr扩增重链及轻链基因并将扩增基因克隆至测序载体，进行多个阳性克隆测序得到最终序列结果。以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属
技术领域：
技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。sequencelisting<110>艾比玛特医药科技（上海）有限公司<120>一种1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶的单克隆抗体及其应用<130>2017<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>prt<213>人工序列<220><221>v-region<222>(1)..(24)<223>vhf1<400>1thrglnleuglngluthrglyproserleuvalserproglyglnthr151015leualagluthralaservalpro20<210>2<211>9<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(9)<223>vhcdr1<400>2proalasergluthrleuglualaval15<210>3<211>16<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(16)<223>vhf2<400>3glyasnasnilearglysileprometleulysleuglutyrmetala151015<210>4<211>7<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(7)<223>vhcdr2<400>4ilesertyrleualaasnser15<210>5<211>23<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(23)<223>vhf3<400>5thralaproserleuglythralasermetalaleualaserileala151015serleuthrprocysthrala20<210>6<211>7<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(7)<223>vhcdr3<400>6thralathrserthrleuala15<210>7<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vhf4<400>7glythrglyglythrservalleuserpro1510<210>8<211>22<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(22)<223>vlf1<400>8thralailemetproleuvalglycysleutyrseralathrilemet151015glutyralaleualathr20<210>9<211>5<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(5)<223>vlcdr1<400>9valglythralaser15<210>10<211>16<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(16)<223>vlf2<400>10proleuglyglyileleuvalalaserthrleualaileserproleu151015<210>11<211>4<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(4)<223>vlcdr2<400>11alaserleuthr1<210>12<211>35<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(35)<223>vlf3<400>12asnargpheprovalproaspglnargthrglyproglyserglythr151015valphethrleuthrvalileasnmetglnsergluargleualaasp202530tyrpheala35<210>13<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vlcdr3<400>13argglntyrthriletyrprogluthrala1510<210>14<211>10<212>prt<213>人工序列<220><221>v_region<222>(1)..(10)<223>vlf4<400>14thrglygluglyglulysvalgluileile1510当前第1页12