一种分选胎儿有核红细胞的方法与流程

本发明属于胎儿有核红细胞分选领域，具体涉及一种从孕妇外周血中在优化密度后的percoll溶液中基于抗原抗体特异性识别和细胞密度差异来分选胎儿有核红细胞的方法。

背景技术：

鉴于优生优育，人们对产前诊断的要求越来越迫切。有创伤性的产前诊断技术如羊水穿刺、绒毛穿刺等由于需要从胎儿组织取样从而具有较高的流产风险，对母体和胎儿造成危害尤其是对于高龄产妇而言。所以无创伤性的产前诊断技术成为当今研究热点。胎儿有核红细胞(fetalnucleatedredbloodcells，fnrbc)是一种单核细胞，于孕6周至分娩后几个月内持续存在于母体外周血中，细胞生命周期短；含有胎儿基因的全部遗传信息，便于遗传学和分子生物学分析。因此，被认为是最好的产前诊断材料，从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞为无创伤性产前诊断开辟了新途径。

近年来，许多研究都致力于胎儿有核红细胞的富集。由于胎儿有核红细胞在孕妇外周血中的数量极少，通常孕妇外周血中胎儿有核细胞与孕妇有核细胞的比例约为1：10⁶，高效率和高纯度的分选一直是一个难题。传统的分选方法可以分为两种：(1)利用细胞的物理性质如尺寸、密度和变形性等来进行分选如密度梯度离心法；筛孔过滤法；(2)利用抗原抗体特异性标记如荧光素激活细胞分类法(facs)和免疫磁珠细胞分选(macs)。其中，传统的密度梯度分选方法利用胎儿有核红细胞与外周血细胞(如红细胞、白细胞和血小板等)密度之间微小的差别来进行分层分选，由于它们之间存在着一个重叠的范围，单纯基于细胞密度分选的纯度不高，因此，基于物理性质的分选方法面临着一定程度的细胞损失和纯度不高的问题；facs分选纯度高，但仪器昂贵，技术复杂。而macs纯度较低，存在一定的弊端。

技术实现要素：

为了克服现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种分选过程简单、方便、易操作、特异性强且成本低的分选胎儿有核红细胞的方法。

为了实现以上目的，本发明具体技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种分选及鉴定胎儿有核红细胞的方法，包括如下步骤：

1)优化可进行密度分选的percoll溶液：从美国sigma公司购买的percoll原液的密度是1.13g/ml，使用2.5m(1.316g/ml)的蔗糖溶液以1:9体积比例浓缩percoll原液，得到密度为1.15g/ml的percoll溶液；

2)制备具有明胶表面的二氧化硅微球sio2@gel：

a.称取0.1g粒径为30μm，密度为2.0g/ml的二氧化硅微球分散在50ml无水乙醇中，50-80℃水浴条件下滴加0.5ml3-氨基丙基三乙氧基硅烷磁力搅拌2-4h，然后经过无水乙醇、去离子水洗涤3次后得到氨基修饰的二氧化硅微球nh2-sio2；

b.将nh2-sio2重新分散在50ml去离子水中，加入0.5ml浓度为50％的戊二醛，室温搅拌8-13h，离心收集到的微球经过去离子水离心洗涤3次后得到醛基修饰的二氧化硅微球cho-sio2；

c.将cho-sio2再次分散到浓度为1％的明胶溶液，室温搅拌2-5h后用去离子水离心洗涤3次得到表面均匀包裹上一层10-50nm明胶的二氧化硅微球sio2@gel；

步骤2)个步骤中的离心转速设定为1000转/分钟。

3)制备抗体anti-cd147修饰的sio2@gel微球：

a.用吗啉乙磺酸(mes)溶液洗涤sio2@gel微球三次，然后将sio2@gel微球浸泡在适量mes溶液中；

b.在a中的微球溶液里分别加入edc和nhs，反应20-40min后，用pbs洗涤3遍；

c.将b处理的微球浸入链霉亲和素溶液中，过夜处理，用pbs洗涤；

d.对c处理的微球进行anti-cd147修饰1-3h，抗体anti-cd147的浓度优选为20μg/ml，用pbs洗涤得到抗体修饰的sio2@gel微球；

4)分选胎儿有核红细胞：

将含有胎儿有核红细胞的1毫升样品与10⁵/毫升抗体修饰的sio2@gel微球在细胞混匀仪室温下搅拌30min，转速设定为10rpm，混匀孵育得到混合样品，加入到步骤1)通过优化密度后的percoll溶液，在400g离心15min，，在离心管底部收集到捕获细胞的微球；

5)胎儿有核红细胞的无创伤性释放：

将收集的捕获到胎儿有核红细胞的二氧化硅微球sio2@gel用明胶酶进行降解释放胎儿有核红细胞；

6)释放下来的胎儿有核红细胞的鉴定：

以激发波长不同的荧光染料分别标记的胎儿红细胞血红蛋白抗体和胎儿有核红细胞膜蛋白抗体作为双抗体，结合dapi，对步骤5)释放的胎儿有核红细胞进行识别，以双抗体同时标记为阳性且细胞核在紫外光激发下呈蓝色作为胎儿有核红细胞鉴定的标准；在众多的胎儿有核红细胞的膜蛋白中，结合使用膜蛋白cd71和细胞质蛋白ε-hbf鉴定胎儿有核红细胞特异性较高。

优选地，步骤4)使用sio2@gel微球浓度在10⁵/毫升左右，抗体anti-cd147浓度为使用无菌pbs将抗体anti-cd147母液稀释至浓度为20微克/毫升，用于不同孕周的孕妇外周血样中胎儿有核红细胞的捕获。

优选地，步骤5)中所述的明胶酶优选为基质金属蛋白酶9(mmp-9)。

优选地，步骤6)具体包括以下步骤：首先用4％多聚甲醛(pfa)溶液1ml对细胞进行固定，静置10分钟，用pbs清洗一遍；然后用0.1％triton-x100溶液1ml对细胞进行穿孔处理，静置10分钟，用pbs清洗一遍，用10％山羊血清1ml进行封阻30分钟，用pbs冲洗；加入anti-cd45-fitc、anti-ε-hbf-pe和anti-cd71-fitc荧光染料各10微升对细胞进行免疫荧光染色，并4℃下静置过夜，最后经dapi染色后利用多通道荧光检测系统进行ctcs观测和计数；anti-cd45-fitc在蓝光激发下发绿色荧光用于识别白细胞，anti-ε-hbf-pe在绿光激发下发红色荧光用于识别胎儿有核红细胞，anti-cd71-fitc在蓝光激发下发绿色荧光用于识别胎儿有核红细胞，dapi在紫外光激发下呈蓝色用于细胞核染色。

优选地，以上所述的方法，其中，母血在10-30周的妊娠期提取。

本发明相对于现有技术具有如下优点和效果：

(1)本发明采用的二氧化硅微球密度为2.0g/ml，远大于血细胞的密度。通过抗原抗体特异性捕获到胎儿有核红细胞后，选择性扩大了靶细胞与血细胞的分选密度差异；通过优化后密度为1.15g/ml的percoll溶液，在400g/15min条件下，捕获到细胞的sio2@gel微球由于密度远大于细胞分离液而沉到下层被收集，其他血细胞(红细胞密度1.10-1.15g/ml，白细胞密度1.07-1.09g/ml)密度小于分离液而浮在上层被去除，因此，提高了分选纯度。

(2)本发明用抗体anti-cd147修饰的sio2@gel微球能特异性识别胎儿有核红细胞，而不吸附血细胞，从而实现了对胎儿有核红细胞的特异性识别和捕获。

(3)本发明是同时结合了基于细胞密度和抗原抗体特异性识别的捕获胎儿有核红细胞的方法。

(4)本发明在二氧化硅微球表面包裹了一层明胶，捕获完成后，通过明胶酶降解可以实现对胎儿有核红细胞的无创伤性释放。

(5)本发明提供了一种可信的对胎儿有核红细胞进行免疫荧光鉴定的方法，通过荧光识别胎儿有核红细胞表面血红蛋白(hbf)、膜蛋白(cd71)以及细胞核(dapi)，实现细胞的荧光鉴定。

(6)本发明的分选过程简单、方便、易操作、特异性强且成本低，具有良好的应用前景。

附图说明

图1是本发明sio2@gel微球的制备、修饰以及细胞捕获、释放的示意图。

图2是本发明对胎儿有核红细胞进行密度分选的示意图。

图3是本发明分选装置的实际效果图。

图4是用sio2@gel微球捕获胎儿有核红细胞的显微图。

图5是sio2裸球和sio2@gel微球的傅里叶红外结果图。

图6是没有抗体修饰的sio2裸球和sio2@gel微球、抗体修饰的sio2裸球和sio2@gel微球对靶细胞捕获效果的影响结果图。

图7是抗体浓度对靶细胞捕获效果的影响结果图。

图8是sio2@gel微球的数量对靶细胞捕获效果的影响结果图。

图9是sio2@gel微球对脐带血中胎儿有核红细胞的释放效果图。

图10是使用免疫荧光对释放下来的胎儿有核红细胞和白细胞进行鉴定的荧光显微图，其中，胎儿有核红细胞有细胞核荧光(蓝色)、血红蛋白(hbf)荧光(红色)、膜蛋白(cd71)荧光(绿色)，白细胞只有细胞核荧光(蓝色)。图中标尺为10um。

图11是sio2@gel微球对不同孕周外周血样里胎儿有核红细胞的捕获效率结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

本发明在优化密度后的percoll溶液中基于抗原抗体特异性识别和细胞密度差异来分选胎儿有核红细胞的方法的原理图见图1、图2，其中图1是在二氧化硅微球表面包裹明胶、明胶表面修饰抗体、细胞表面抗原与抗体特异性结合、明胶被mmp-9降解后细胞被释放下来的示意图。图2是胎儿有核红细胞在优化密度后的percoll溶液中被分选出来的原理图，具体过程为：将修饰上抗体的sio2@gel微球与血样在细胞混匀仪上旋转半小时，使sio2@gel微球捕获到胎儿有核红细胞，图4为sio2@gel微球捕获到胎儿有核红细胞的显微图，可以看出，修饰上抗体的sio2@gel微球具有较好的捕获能力。然后将样品加到优化密度后的percoll溶液上层，在400g下离心15min，捕获到细胞的sio2@gel微球由于密度远大于细胞分离液而沉到下层被收集，其他血细胞(红细胞密度1.10-1.15g/ml，白细胞密度1.07-1.09g/ml)密度小于分离液而浮在上层被去除，完成胎儿有核红细胞的分选过程。图3为实际分选效果图。

【实施例1】

(1)优化密度的percoll溶液的制备

percoll原液的密度是1.13g/ml；使用2.5m(1.316g/ml)的蔗糖溶液以1:9体积比例浓缩percoll原液，得到密度为1.15g/ml的percoll溶液。

(2)sio2@gel微球的制备

称取0.1g粒径为30um左右、密度为2.0g的二氧化硅微球加入三口烧瓶中，加入50ml无水乙醇，60℃水浴加热搅拌条件下加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷0.5ml，反应3h，离心收集到的微球分别经过无水乙醇、去离子水离心洗涤3次后得到了氨基修饰的二氧化硅微球(nh2-sio2)。接着，将nh2-sio2重新分散到50ml去离子水中，加入0.5ml浓度为50％的戊二醛溶液，室温搅拌10h，离心收集到的微球经过去离子水离心洗涤3次后得到了醛基修饰的二氧化硅微球(cho-sio2)。最后，将cho-sio2再次分散到50ml浓度为1％的明胶溶液，室温搅拌4h后用去离子水离心洗涤3次得到表面均匀包裹上一层10-50nm明胶的二氧化硅微球(下面简称sio2@gel)。整个实验离心的过程转速设定为1000转/分钟。

图5是明胶(gel)、包裹上明胶的二氧化硅微球sio2@gel、二氧化硅微球(sio2)的傅里叶红外结果图，从图5可以看出sio2@gel在吸收峰1635cm^-1处很明显有一个吸收光谱带，是明胶的n-h伸缩振动峰，而单独的二氧化硅微球在这个波数位置并没有吸收峰，表明二氧化硅微球表面包裹上了一层明胶。

(3)sio2@gel微球的抗体修饰

1)用吗啉乙磺酸(mes)溶液洗涤sio2@gel三次，然后将sio2@gel浸泡在适量mes溶液中；

2)在1)中的微球溶液里分别加入edc和nhs，反应30min后，用pbs洗涤3遍；

3)将2)处理的微球浸入链霉亲和素溶液中，4℃过夜处理，用pbs洗涤3遍；

4)对3)处理的微球进行anti-cd147修饰2h，用pbs洗涤得到抗体修饰的sio2@gel。

【实施例2】

为了探究抗体的特异性作用以及二氧化硅微球表面明胶膜对细胞的吸附作用，使用相同浓度的没有抗体修饰的sio2裸球和sio2@gel微球、抗体修饰的sio2裸球和sio2@gel微球分别来捕获同一脐带血样本1毫升，样品放在细胞混匀仪上室温下搅拌30min，转速设定为10rpm。通过在olympusix71显微镜下计数微球对胎儿有核红细胞的捕获率，实验结果如图6所示，没有抗体修饰的sio2裸球和sio2@gel微球几乎捕获不到靶细胞，经抗体修饰的sio2@gel微球相比抗体修饰的sio2裸球具有更好的捕获效率，推测明胶膜的纳米结构能更好的贴合细胞表面所致。上述结果表明，经过anti-cd147修饰的sio2@gel微球对靶细胞具有很好的捕获能力，并且微球的非特异性吸附可以忽略不计。

【实施例3】

为了探究抗体浓度对靶细胞捕获率的影响，使用不同浓度的抗体anti-cd147(1.0、10、20、50微克/毫升)来修饰sio2@gel微球，分别用于捕获同一脐带血样本1毫升。样品放在细胞混匀仪上室温下搅拌30min，转速设定为10rpm。通过在olympusix71显微镜下计数微球对胎儿有核红细胞的捕获率，实验结果如图7所示，当抗体浓度在20微克/毫升时，捕获率达到饱和，故下述实施例所使用的抗体浓度在20微克/毫升左右。

【实施例4】

为了探究1ml脐带血中sio2@gel微球数量对靶细胞捕获效率的影响，使用不同浓度的微球浓度(1×10⁴、5×10⁴、10⁵、5×10⁵/毫升)分别来捕获同一脐带血样本1毫升，样品放在细胞混匀仪上室温下搅拌30min，转速设定为10rpm。通过在olympusix71显微镜下计数微球对胎儿有核红细胞的捕获率，实验结果如图8所示，微球浓度为10⁵/毫升时，达到最优的捕获效果。故下述实施例所使用的微球浓度在10⁵/毫升左右。

【实施例5】

将修饰上抗体的sio2@gel微球与血样在细胞混匀仪上旋转半小时，使sio2@gel微球捕获到胎儿有核红细胞，然后将样品加到优化密度后的percoll溶液上层，在400g下离心15min，捕获到细胞的sio2@gel微球由于密度远大于细胞分离液而沉到下层被收集，其他血细胞(红细胞密度1.10-1.15g/ml，白细胞密度1.07-1.09g/ml)密度小于分离液而浮在上层被去除，实现胎儿有核红细胞的捕获和纯化分选，然后用基质金属蛋白酶溶液(mmp-9)降解二氧化硅表面明胶膜实现靶细胞的释放。效果图如图9所示，可以看到经降解明胶后，细胞从微球上脱落。经过pbs多次冲洗离心收集释放下来的细胞。

【实施例6】

释放下来的胎儿有核红细胞用免疫荧光鉴定：首先用4％多聚甲醛(pfa)溶液1ml对细胞进行固定，静置10分钟，用pbs清洗一遍；然后用0.1％triton-x100溶液1ml对细胞进行穿孔处理，静置10分钟，用pbs清洗一遍，用10％山羊血清1ml进行封阻30分钟，用pbs冲洗；加入anti-cd45-fitc、anti-ε-hbf-pe和anti-cd71-fitc荧光染料各10微升对细胞进行免疫荧光染色，并4℃下静置过夜，最后经dapi染色后利用多通道荧光检测系统进行ctcs观测和计数。anti-cd45-fitc在蓝光激发下发绿色荧光用于识别白细胞，anti-ε-hbf-pe在绿光激发下发红色荧光用于识别胎儿有核红细胞，anti-cd71-fitc在蓝光激发下发绿色荧光用于识别胎儿有核红细胞，dapi在紫外光激发下呈蓝色用于细胞核染色(图10)。综合结果：(1)胎儿有核红细胞(ε-hbf+/cd71+/dapi+)(2)白细胞(ε-hbf-/cd71-/dapi+)。

【实施例7】

优化实验参数后，使用sio2@gel微球浓度在10⁵/毫升左右、抗体anti-cd147浓度在20微克/毫升左右，用于不同孕周的孕妇外周血样中胎儿有核红细胞的捕获，实验结果如图11所示，孕妇外周血中胎儿有核红细胞的数量与孕周有一定的关联，呈现出先多后少的趋势，并且在18孕周左右数量较多。