本发明涉及一种猪圆环病毒2型的培养方法，特别涉及一种大规模培养猪圆环病毒2型的全悬浮培养方法，还涉及一株适应大规模无血清全悬浮培养的spk15-yp细胞，本发明属于医药技术领域。
背景技术：
猪圆环病毒2型(pcv2)全病毒颗粒具有良好的免疫原性，适合做全病毒灭活疫苗，但是pcv2在pk15细胞上的繁殖能力不高是影响pcv2全病毒疫苗质量的最大瓶颈之一。
在pcv2培养过程中发现，牛血清对pcv2的繁殖具有很大的影响，不利于pcv2病毒感染pk15细胞，并且由于牛血清的来源和批间差异都造成了pcv2疫苗半成品培养的不确定性，国内外研究发现d-氨基葡萄糖、氯化铵和两性霉素等对pcv2的增殖效果也存在一定的局限性。
为了建立pcv2病毒大规模全悬浮高效培养方法，本发明的发明人驯化了一株适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞，命名为spk15-yp。利用生物反应器对spk15-yp细胞的悬浮培养参数和pcv2/lg株的悬浮培养参数进行探索发现，当spk15-yp细胞传代浓度达到40～80×104/ml时培养60～72h，细胞浓度可达到50～60×105/ml；当接毒剂量控制在2～3％、spk15-yp细胞浓度为50～80×104/ml、96～120h收毒和溶氧在40～50％之间，pcv2培养滴度可达到106.8～107.2tcid50/ml之间，然后用中空纤维超滤膜将全悬浮pcv2病毒液进行抗原浓缩纯化去除杂蛋白79.9％，利用该纯化抗原制备疫苗免疫试验猪，结果表明，过氧化物酶单层细胞染色法测定pcv2血清抗体效价介于1600～6400之间，免疫组试验猪均未见腹股沟淋巴结肿大，并且最小免疫剂量0.1ml试验组猪腹股沟淋巴结病毒载量均小于3.59×107拷贝/g，攻毒对照组试验猪腹股沟淋巴结病毒载量均大于1.58×109拷贝/g，综上表明，利用生物反应器全悬浮培养工艺培养pcv2病毒液可以获得比转瓶工艺高出8～10倍的pcv2抗原，并且克服了牛血清对pcv2繁殖的影响，获得了高滴度的pcv2病毒培养液，从而降低pcv2病毒培养液的生产成本，为后续pcv2相关疾病联苗的开发奠定了坚实基础。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一株适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞。
本发明的目的之二在于提供一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明获得的一株适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞，命名为spk15-yp，分类命名为猪肾细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmccno.13846，保藏时间为2017年5月25日。
进一步的，本发明还提出了所述的适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞在病毒培养中的用途。其中，优选的，病毒为猪圆环病毒2型(pcv2)。
一种猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法，包括所述的猪肾细胞接种猪圆环病毒2型的步骤。
具体的，包括以下步骤：
(1)在生物反应器中，采用半换液或逐步加液的方式对所述的猪肾细胞spk15-yp进行全悬浮培养；
(2)向步骤(1)培养得到的猪肾细胞spk15-yp中接种猪圆环病毒2型病毒株，培养猪圆环病毒2型病毒株；
(3)猪圆环病毒2型病毒株的收集和纯化。
其中，优选的，步骤(1)中用于猪肾细胞spk15-yp全悬浮培养的培养基为viruspropk-15-s细胞无血清培养基，搅拌转速为100～120r/min，培养温度为37℃。
其中，优选的，步骤(2)中当spk15-yp细胞培养浓度达到30～50×104/ml时，按照接种剂量为2-10％(v/v)，向spk15-yp细胞中接种猪圆环病毒2型病毒株，在37℃条件下继续培养，保持搅拌转速为100～120r/min。
其中，优选的，步骤(3)中当猪圆环病毒2型病毒株培养96～120h时，收获猪圆环病毒2型病毒液，采用0.45μm的中空纤维膜柱来澄清pcv2病毒液，再用300kd滤膜去除小分子蛋白，即得到浓缩纯化后的猪圆环病毒2型病毒液。更进一步的，本发明还提出了按照所述的大规模全悬浮培养方法制备得到的猪圆环病毒2型。以及
一种猪圆环病毒2型疫苗，其有效成分为经灭活后的所述的猪圆环病毒2型。
相较于现有技术，本发明所取得的有益效果是：
pcv2在pk15细胞内复制过程中，病毒滴度低是制约pcv2疫苗质量不稳定的主要原因，pcv2病毒滴度低受到诸多因素的制约，在试验过程中发现，牛血清不利于pcv2在pk15细胞中复制，现在传统pcv2全病毒疫苗半成品培养工艺都是应用转瓶和微载体培养都离不开牛血清。本发明采用适应全悬浮培养的spk15-yp细胞无血清培养pcv2，取代了传统的转瓶培养工艺，减少了人力资源，提高了产品的质量，解决了pcv2全病毒疫苗培养的瓶颈问题，制备得到了高效价的pcv2半成品，通过pcv2病毒的浓缩纯化工艺能够得到高纯度的pcv2浓缩抗原，为pcv2多联多价疫苗的研究奠定了坚实基础，大大减少疫苗的用量，显著降低了疫苗对猪群的应激，极大提高了猪群的免疫水平。
附图说明
图1为spk15-yp细胞在摇瓶中48h细胞无血清悬浮培养照片。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞spk15-yp的驯化
1.材料和方法
1.1材料
贴壁pk-15细胞为上海源培生物科技股份有限公司保存，viruspropk-15-s细胞无血清培养基，d-pbs，trpzyme重组胰酶消化液为上海源培生物科技股份有限公司产品。
1.2方法
将贴壁有血清培养的pk-15细胞按照以下方法驯化为适应无血清培养的悬浮细胞系：
(1)t-75贴壁培养pk-15细胞的汇合率达到50％-80％时，弃上清液，加入5ml无钙镁离子的d-pbs洗涤2遍。
(2)弃pbs，加入5mltrpzyme，室温作用片刻后弃胰酶消化液，残留少许胰酶足以覆盖细胞即可，37℃孵育，显微镜观察细胞变圆后轻拍瓶底解离细胞。
(3)加入10mlviruspropk-15-s细胞无血清培养基重悬细胞，1000rpm离心5min。
(4)弃上清，用5mlviruspropk-15-s细胞无血清培养基重悬细胞，取样计细胞密度及活率。
(5)将细胞密度稀释至5×105cells/ml，接种到带通气盖的一次性摇瓶。37℃，130rpm，5％co2培养箱培养。
(6)每天取样计细胞密度和活率。
(7)当细胞密度达到1×106cells/ml或已悬浮培养4天，以5×105cells/ml的接种密度进行细胞传代。如果培养第4天细胞密度低于1×106cells/ml，离心后用新鲜培养基重选细胞，继续培养。
(8)继续监测细胞生长及活率。一旦连续3代以上细胞密度在第3天能达到1×106cells/ml，细胞活率不低于90％，则认为此细胞适应了悬浮培养。
2.结果
按1.2的方法，经过两个月的驯化，pk-15细胞在viruspropk-15-s细胞无血清培养基中成功悬浮培养，以5×105cells/ml的密度接种，48h长至2×106cells/ml，细胞照片如图1所示。
驯化得到的一株适应大规模无血清全悬浮培养的猪肾细胞，命名为spk15-yp，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为：cgmccno.13846。
实施例2猪圆环病毒2型的大规模全悬浮培养方法的建立
1.材料与方法
1.1病毒和细胞
猪圆环病毒2型(pcv2/lg株)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所保存；spk15-yp细胞(cgmccno.13846)由实施例1驯化。
1.2方法
1.2.1spk15-yp细胞的全悬浮培养
1.2.1.1细胞初始接种密度的优化
将spk15-yp细胞浓度以10×103/ml、10×104/ml、30×104/ml、50×104/ml和80×104/ml分别在生物反应器中进行培养，培养温度为37℃，培养基为mem培养基，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测。
1.2.1.2补液方式的优化
分别采用半换液和逐步加液的方式在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测，观察spk15-yp细胞的生长状态，选择最佳的补液方式。
1.2.1.3搅拌转速选择
分别选择60、80、90、100、120r/min的转速，于生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数、活力检测，观察spk15-yp细胞的生长状态，选择最适搅拌转速。
1.2.2pcv2/lg株悬浮培养参数确定
1.2.2.1接毒剂量的优化
按照体积比1％、2％、5％、7.5％和10％的接毒剂量，细胞浓度为80×104/ml的条件下进行培养，逐日观察细胞的状态，细胞计数和活力检测，在接毒后96～120h收获，按reed-muench法计算病毒的tcid50。确定最佳接毒剂量。
1.2.2.2细胞浓度的优化
细胞浓度分别确定为10×103/ml、10×104/ml、30×104/ml、50×104/ml和80×104/ml，同步接种5v/v％pcv2/lg株病毒，在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测，观察spk15-yp细胞的生长状态，在接毒后96～120h同时收获病毒，按reed-muench法计算病毒的tcid50。确定最佳细胞浓度。
1.2.2.3收毒时间的优化
细胞浓度确定为50×104/ml，同步接种5v/v％pcv2/lg株病毒，在生物反应器中进行培养，每隔24h取样进行细胞计数，活力检测，观察细胞生长状态，在接毒后24h、48h、72h、96h和120h收获病毒，按reed-muench法计算病毒的tcid50。确定最佳收毒时间。
1.2.3pcv2病毒纯化
选用中空纤维0.45μm膜柱来澄清pcv2病毒液，300kd膜柱来浓缩澄清液并配合洗滤除去杂蛋白，然后检测杂蛋白去除量。
2结果
2.1细胞初始接种密度的优化
将spk15-yp细胞接种密度为10×103/ml、10×104/ml、30×104/ml、50×104/ml、80×104/ml和10×105/ml分别在生物反应器内进行全悬浮培养，结果表明，随着spk15-yp细胞培养时间延长，当细胞浓度达到7.0×106/ml以上时，细胞的生长速毒显著变慢处于一个平台期不在生长，即使高接种浓度当细胞生长到7.0×106/ml以上时细胞的浓度也处于停滞生长状态，不再生长(表1)。
表1不同spk15-yp细胞浓度对细胞生长的影响
2.2补液方式的确定
将spk15-yp细胞接种密度调整为40×104/ml开始在生物反应器中进行培养，分别在细胞培养到48h和72h时进行半换液和逐步加液的方式进行比较发现，在生物反应器中，分别在于48h和72h时更换50％培养基和逐步加液的方式，均可获得较高的细胞密度，也避免了营养成分过低和细胞代谢产物浓度过高对细胞生长的抑制作用，逐步加液的方式更有利于在培养实践中广泛应用。
2.3搅拌转速确定
将spk15-yp细胞接种密度调整为40×104/ml开始在生物反应器中进行培养，转速分别定为60、80、100、120、120r/min，结果表明，100r/min和120r/min的转速对细胞生长影响小，培养3d细胞生长密度可达到600～700×104/ml，因此，100～120r/min为最适搅拌转速(表2)。
表2不同转速对spk15-yp细胞生长的影响
2.4细胞浓度的确定
细胞浓度分别确定为10×103/ml、10×104/ml、30×104/ml、50×104/ml和80×104/ml，同步接种5％pcv2/lg株病毒，在生物反应器中进行培养，在接毒后96～120h同时收获病毒，结果表明，细胞浓度在30×104/ml和50×104/ml时，pcv2病毒滴度可达到106.8tcid50/ml和107.2tcid50/ml，即最佳细胞培养浓度为30～50×104/ml时，pcv2毒价最高(表3)。
表3不同spk15-yp细胞浓度对pcv2增殖的影响
2.5接毒剂量的确定
按照体积比为1％、2％、5％、7.5％和10％的接毒剂量，细胞浓度为40×104/ml的条件下进行培养，结果表明，2％、5％、7.5％和10％的接毒剂量均能达到106.5～107.2tcid50/ml(表4)。
表4不同pcv2/lg接种剂量对pcv2/lg增殖的影响
2.6收毒时间的确定
spk15-yp细胞浓度确定为40×104/ml，同步接种5v/v％pcv2/lg株病毒，在生物反应器中进行培养，在接毒后24h、48h、72h、96h和120h分别收获病毒，结果表明，96h和120h收获的病毒毒价可达到106.7tcid50/ml和107.1tcid50/ml。确定最佳收毒时间为96h～120h(表5)。
表5不同收毒时间对pcv2增殖的影响
2.7pcv2/lg病毒纯化
选用ge公司提供的中空纤维膜柱来澄清pcv2/lg病毒收获液800ml，利用0.45μm中空纤维膜柱去除细胞碎片等杂蛋白，再用300kd滤膜去除小分子蛋白，在去除的小分子蛋白中未检测到pcv2/lg病毒，表明在pcv2/lg纯化过程中未出现pcv2/lg病毒流失现象，该条件可用作pcv2/lg病毒的纯化，并且该方法可去除杂蛋白79.9％以上(表6)。
表6pcv2/lg病毒纯化结果
实施例3pcv2/lg株疫苗的制备及免疫效力检验
1.材料与方法
1.1质粒与菌株
含有pcv2病毒orf2的质粒pmd-18-pcv2由本实验室构建保存备用。
1.2其他试剂
dna提取试剂盒购自天根生物科技有限公司，rtaqdna聚合酶，dntp均购自大连宝生物科技有限公司，质粒提取试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司。
1.3方法
1.3.1pcv2/lg株疫苗的制备
将实施例2纯化得到的pcv2/lg病毒利用0.2％甲醛溶液灭活24h，然后与法国赛比克公司佐剂isa15avg进行乳化，每ml疫苗中所含有的病毒的量为106.5tcid50/ml。将制备得到的pcv2/lg灭活疫苗进行免疫效力试验。
1.3.2引物设计与扩增
参考genbank下载的pcv2基因序列(af166528)，采用oligo6.0软件设计特异性引物，pcv2-f：5′-cagcaagaagaatggaagaagcgga-3′，pcv2-r：5′-ccaggactacaatatccgtgtaact-3′，扩增目的片段长度为1057bp，引物合成由北京六合华大基因科技公司完成。
1.3.3荧光定量pcr测定腹股沟淋巴结病毒载量的变化
根据pcv2基因组，设计并合成引物和探针，引物序列为：pcv2-cap-f:gccgaggcctacgtggtc；pcv2-cap-r:tactttacccccaaacctgtcct；探针为：6famtgtttggttggaagtaatcaatagtggaatctamra；探针及引物由life公司合成。反应体系为：mastermix10μl，上下游引物各0.2μl，探针0.25μl，dna样品2μl，最后用7.35μl超纯水补充至总体积20μl。反应参数为：95℃10min；95℃变性15s，60℃退火/延伸60s，共40个循环。以含有pcv2病毒orf2的质粒pmd-18-pcv2作为该定量pcr标准品，10倍梯度稀释并制备8个标准品，拷贝数从3.23×109～3.23×102。在mx3005p实时定量pcr仪上扩增并分析结果。
1.3.4动物试验
选用35日龄健康仔猪30头，经pcr和ipma方法检测pcv2/lg(抗原和抗体)均为阴性试验猪，随机分为6组，每组5头。其中1组为未免疫攻毒对照组，另外，5组分别免疫不同剂量pcv2灭活疫苗，免疫35d后，进行pcv2/lg株攻毒保护试验，攻毒后第28d迫杀试验猪，取腹股沟淋巴结进行病理学检查和病毒分布测定。
2、结果
2.1pcv2疫苗检验
pcv2/lg株疫苗外观均为粉白色乳状液，为水包油剂型，稳定性好，取10ml疫苗装于离心管中，以3000转/分离心30分钟，不分层，粘度低，1ml吸管吸取25℃左右的疫苗1ml，垂直自然流出时间为1.5秒。按照现行《中国兽药典附录所规定的方法对pcv2/lg疫苗进行检验，结果表明，pcv2/lg疫苗均无菌生长(表7)。
表7pcv2成品疫苗检验
2.2pcv2血清抗体测定
将制备的pcv2/lg疫苗以4ml、2ml、1ml、0.5ml、0.1ml的免疫剂量分别免疫试验猪，免疫35d后测定抗体，结果表明，4ml免疫组和2ml免疫组血清抗体效价均可达到6400倍以上，1ml免疫组血清抗体效价可达到3200倍以上，0.5ml免疫组和0.1ml免疫组试验猪血清抗体效价均能达到800倍以上。根据中国农业科学院哈尔滨兽医研究所pcv2/lg株灭活疫苗规程标准表明，ipma血清抗体效价达到800倍以上对试验猪能够提供有效保护(表8)。
表8pcv2疫苗不同免疫剂量对血清抗体产生的影响
2.3腹股沟淋巴结荧光定量pcr测定
攻毒后通过对各个免疫组及未免疫对照组腹股沟淋巴结病毒载量测定表明，攻毒对照组5头试验猪病毒载量均高于1.58×109拷贝/g，各个免疫组试验猪病毒载量均低于3.59×107拷贝/g(表9)。
表9pcv2/lg疫苗不同免疫剂量对pcv2攻毒后腹股沟淋巴结病毒载量的影响