本发明涉及源于草酸青霉的黑麦酮酸i在制备抗人结肠癌药物的应用，属于医药领域。
背景技术：
黑麦酮酸类化合物（secalonicacids）属于麦角色素类（ergochrome）次生代谢产物，为氧杂蒽酮二聚物。自从stoll等在1952年从真菌中分离得到黑麦酮酸a（secalonicacida）之后，该系列的化合物黑麦酮酸（a,b,c,d,e,f,g）就不断地被发现及研究。黑麦酮酸类化合物具有各种不同的生理活性，以黑麦酮酸d（secalonicacidd,sad）为例，5mg/ml的sad加入到生理盐水中,在5-20mg范围内，即可以治疗早期膀胱癌，50-100mg范围内，对更严重的膀胱癌有疗效并且没有副作用发生。经研究发现，一些海洋真菌能够在次级代谢过程中产生结构新颖、活性好的黑麦酮酸类化合物，具有很好的药用和产业化前景。
本发明人研究得知，草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714)的发酵产物的粗提取物有很好的细胞增殖抑制活性，遂对其活性成分进行研究。研究发现所示黑麦酮酸类化合物具有抗人结肠癌活性，目前尚未见该化合物对人结肠癌细胞的增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种源于草酸青霉的黑麦酮酸类化合物secalonicacidi制备方法及其抑制人结肠癌细胞增殖方面的应用。该化合物具有抑制结肠癌细胞增殖作用，具有抗人结肠癌活性。其结构式为：
该化合物的制备方法，是通过发酵培养草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，获取发酵物，然后从发酵物中分离纯化出该化合物。具体步骤如下：
1发酵生产
培养微生物的常规方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6接种到pda固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天，然后接种到培养液中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液；所述培养液组成：每升水含甘露醇20.0g、酵母膏3.0g、麦芽糖20.0g、味精10.0g、葡萄糖10.0g、kh2po40.5g、mgso4·7h2o0.3g、nacl15.0g；
2浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到菌丝体的含丙酮和水的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5g。
3化合物的分离精制
菌丝体浸膏通过100-200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分a-e。组分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱剂，进行加压柱硅胶色谱层析，经过薄层色谱分析后合并得到五个亚组分d1-d5。组分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（sephadexlh-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分d2-1~d2-4。d2的亚组分d2-3(212mg)通过半制备液相色谱(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分离流速为5ml/min，流动相为55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
所述草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6，已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714。
本发明还保护了所述的化合物在制备抑制人结肠癌细胞增殖药物中的应用，及该化合物在制备抗人结肠癌药物中的应用。
本发明的显著优点：研究所示该黑麦酮酸化合物未见报道且具有显著的抑制人结肠癌细胞增殖活性，目前尚未见该化合物对人结肠癌细胞增殖抑制活性的报道，因此市场上也尚未见有与此相关的药物。
附图说明
图1secalonicacidi主要的cosy，hmbc和noe信号。
具体实施方式
在如下的实施例中所指的化合物的化学结构：
实施例1该化合物的发酵生产及分离精制
1发酵生产
生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6(已于2013年12月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址:武汉武汉大学，保藏编号是：cctccno：m2013714)适量，接种到pda固体斜面培养基上在28℃培养箱中培养2至3天。
取斜面培养2至3天的草酸青霉(penicilliumoxalicum)ibpt-6适量，接种到装有400ml培养液[培养液组成(克/升)：甘露醇20.0，酵母膏3.0，麦芽糖20.0，味精10.0，葡萄糖10.0，kh2po40.5，mgso40.3，nacl15.0定容]的1000ml锥形瓶中，28℃静止培养30天后，获得菌丝体和发酵液。
2浸膏的获得
用纱布将菌丝体和发酵液分离。菌丝体用丙酮溶液（含20%~30%水）连续超声破壁3次，过滤去除残渣，得到菌丝体的含丙酮和水的粗提物。减压浓缩去除丙酮，得到粗体物的水溶液，再以体积比1:2加入乙酸乙酯萃取3次，得乙酸乙酯粗提液，减压浓缩至近干得菌丝体浸膏36.5g。
3化合物的分离精制
菌丝体浸膏通过200目硅胶拌样，以石油醚：二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱液，进行减压硅胶色谱柱层析。经过简单的薄层色谱分析，合并，分离成组分a-e。组分d(5.9g)(二氯甲烷：甲醇v/v=100:1的洗脱物)以二氯甲烷：甲醇为梯度洗脱剂，进行加压柱硅胶色谱层析，经过薄层色谱分析后合并得到五个亚组分d1-d5。组分d2(1.2g)以三氯甲烷：甲醇=1:2为梯度洗脱剂，进行凝胶柱层析（sephadexlh-20），经过薄层色谱分析后合并得到四个亚组分d2-1~d2-4。d2的亚组分d2-3(212mg)通过半制备液相色谱(1010型ods-a，10×250mm，5μm)：分离流速为5ml/min，流动相为55%乙腈含0.1%tfa，得到所示化合物(2.7mg，tr13.8min)。
化合物常温下为黄色油状物，高分辨电喷雾质谱hresi-ms在m/z：659.1377处给出分子离子峰[m+na]+（calcdforc32h28nao14，659.1377），提示分子量为636，结合波谱信息推测分子式为c32h28o14。1h和13c-nmr数据见表1，主要的cosy，hmbc和noe信号见图1。
表1化合物的1h和13c-nmr数据(500mhz1hand126mhz13c，indmsod6)
实施例2体外抗肿瘤活性的测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制测试样品为上述实施1中分离精制的化合物纯品。精密称取适量样品，用甲醇配制成所需浓度的溶液，供测活性。
细胞系及细胞的继代培养采用肿瘤细胞系，肿瘤细胞用含10%fbs的dmem培养基，在37℃于通入5%co2的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法
四氮唑盐（mtt）法取对数生长期的肿瘤细胞，将细胞密度调至每毫升2×105个细胞，按每孔200微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5%co2的培养箱中培养4小时。每孔加入2微升的样品液或空白溶液，培养24小时之后，每孔加入mtt液（mtt的每毫升5毫克生理盐水溶液）10微升，继续培养4小时，37℃、2000转/分钟离心8分钟，吸取上清。每孔加入dmso各100微升，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解之后，利用md公司生产的spectramaxplus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光（od）值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔，另设置三孔的空白对照和无细胞凋零孔（如果药物有颜色要做相应药物浓度无细胞凋零）。各孔od值先做相应无细胞凋零，再取三孔平均od值按ir(%)=(od空白对照-od样品)/od空白对照×100%计算每个浓度下细胞的增殖抑制率（ir%）。
2.实验结果
细胞增殖抑制活性测试结果
在mtt法测试中，根据不同浓度的该化合物的肿瘤细胞增殖抑制率，应用spss16.0软件进行数据处理并计算半数抑制浓度ic50值。结果见表2。
表2化合物对人结肠癌细胞增殖的抑制活性
3.结论
该化合物对人结肠癌细胞具有较好的抗肿瘤活性。可作为制备结肠癌细胞增殖抑制药物或抗肿瘤药物用于结肠癌的研究。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。