稻穗发育基因的沉默子CNV-18bp及在水稻产量改良中的应用的制作方法

文档序号：16478467发布日期：2019-01-02 23:51阅读：579来源：国知局

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一个稻穗发育基因的沉默子cnv-18bp及在水稻产量改良中的应用。所述的沉默子被命名为cnv-18bp，其位于sgdp7基因起始密码子“atg”上游5309bp处，它的序列如seqidno:1所示。该序列具有控制水稻每穗颖花数、粒形和粒重性状，这些性状与水稻产量性状相关。本发明还克隆得到sgdp7基因的等位基因，该等位基因可以控制水稻每穗颖花数、千粒重、粒长和产量，所述的等位基因的核苷酸序列如seqidno：2所示。本发明还包括对多效性基因sgdp7及其等位基因的生物学功能验证，分子标记的制备及其在水稻产量改良中的应用。

背景技术：

世界粮食安全是人们密切关注的问题之一，如何进一步提高水稻产量对我国乃至世界人口粮食安全具有重要意义。水稻产量主要由分蘖数、每穗颖花数和千粒重三个主要组成因子构成；水稻每穗颖花数主要与稻穗二次枝梗数相关。它对产量的影响效应较粒形与千粒重较为突出。

每穗颖花数是由多个数量性状位点控制，并分主效基因和微效基因。它们都可以通过构建近等基因系f2，利用图位克隆技术将其分离并克隆。1986年，剑桥大学的alancoulson首先提出了图位克隆技术(map-basedcloning)(coulsonetal.1986)，通过构建f2分离群体，利用分子标记跟基因位点的连锁关系，根据重组单株逐步把候选区段缩小到很小的区段甚至单个基因。进而通过遗传转化来互补验证，本发明应用了类似的技术路线(如图1所示)。近年来，不同国家的多个课题组利用图位克隆策略将水稻第4染色体上的穗粒数与产量主效基因nal1/lschl4/qtsn4成功分离(fujitaetal.2013；zhangetal.2014；taguchi-shiobaraetal.2015；fabreetal.2016)。此外，在2015年我国科学家通过图位克隆策略鉴定到一个拷贝数变异位点调控粒形基因gl7的表达，从而实现对水稻粒形变异的调控(wangetal.2015)。

本发明利用水稻品种“南洋占”(大粒小穗)与“川7”(小粒大穗)衍生的重组自交系f7代中，其ri68与ri76家系中出现二次枝梗数、每穗颖花数、粒长与粒重的分离，具体为大粒少颖花株数与小粒多颖花株数接近3：1分离。以此分离群体为近等基因系(baietal.,bmcgenetics2010,11:16)，利用图位克隆策略，最终将这个同时控制水稻每穗颖花数、粒重、粒长及产量的多效性qtl-sgdp7克隆。在ri68衍生的家系中，来自水稻品种“川7”等位基因型的每穗颖花数(239个)与单株产量(22.4g)分别显著多于南洋占基因型的每穗颖花数(119个)与单株产量(15.0g)，“川7”等位基因型的千粒重(17.0g)轻微小于“南洋占”基因型的千粒重(20.6g)，单株产量增产49.3％；在ri76衍生的近等基因系中，来自“川7”等位基因型的每穗颖花数(162个)与单株产量(17.4g)分别显著多于“南洋占”基因型的每穗颖花数(118个)与单株产量(14.8g)。“川7”等位基因型的千粒重(16.4g)轻微小于“南洋占”基因型的千粒重(19.5g)，单株产量增产17.5％。它的克隆将有助于水稻增产育种。通过进一步研究我们发现位于sgdp7基因起始密码子atg上游5309bp处，“川7”基因型中插入一个18bp的重复序列(该序列抑制下游基因表达，因此定义为沉默子cnv-18bp)。此外，通过研究证实该18bp插入片段可使水稻产量增加17.5％以上。同时，我们针对该插入与缺失位点设计了分子标记(indel712)，可以直接用于分子标记辅助育种。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，分离克隆一个控制水稻产量如每穗颖花数、粒形、粒重与产量的多效性基因sgdp7及等位基因，也包括涉及sgdp7基因及等位基因分子标记的应用。在sgdp7基因上游5309bp处的18bp序列的插入导致该基因表达量降低致使粒形与粒重轻微减少，但增加二次枝梗数形成多粒并增加产量。申请人将克隆获得的这个多效性基因命名为sgdp7，并在其起始密码子atg上游鉴定到一个18bp的插入片段。同时针对该插入/缺失设计了分子标记indel712。

本发明通过以下技术方案实现：

本发明通过植物基因工程方法和转基因方法从水稻品种“川7”中克隆获得一个控制水稻每穗颖花数、粒形、粒重与产量的多效性基因sgdp7，与参照基因组(日本晴基因组)以及水稻品种“南洋占”相比，在水稻品种“川7”中sgdp7基因起始密码子atg上游5309bp处插入一个18bp的重复片段(其核苷酸序列如seqidno：1所示)。整个基因(包括6489bp上游序列与957bp的cds)核苷酸序列(川7等位基因序列)如seqidno：2所示，seqidno：3所示(注：sgdp7南洋占等位基因与川7等位基因具有相同的cds)，其编码的蛋白质的序列如“seqidno：4”所示(注：sgdp7南洋占等位基因与川7等位基因编码相同的氨基酸)。从水稻品种“南洋占”中克隆获得sgdp7基因的等位基因，该等位基因的核苷酸序列(亦为遗传互补转化序列)如seqidno：5所示。

申请人通过转基因方法，将上述多效性基因sgdp7(即可克隆自南洋占品种的等位基因)转化到其近等基因系“川7”等位基因型(该近等基因系来源于水稻品种“南洋占”和“川7”衍生的重组自交系f7，技术路线如图1所示)，其转基因阳性单株的二次枝梗数与每穗颖花数减少，而粒重和粒长增加，符合转基因预期的表型。

本发明的优点在于：

(1)本发明基于qtl定位结果，分离克隆了一个调控水稻每穗颖花数、粒形、粒重与产量的一因多效基因sgdp7。该基因调控水稻产量对提高水稻产量进一步打下基础。

(2)本发明检测到在sgdp7基因起始密码子atg上游5309bp处存在一个18bp的插入/缺失多态性位点。该位点为sgdp7基因的功能位点，负调控sgdp7的表达，进而调控水稻的产量。

(3)本发明针对18bp的插入/缺失片段设计了一种特异性分子标记indel712，该分子标记可用于水稻分子标记辅助育种。

更详细的技术方案见《具体实施方式》。

附图说明

序列表seqidno：1是多效性基因sgdp7起始密码子atg上游5309bp处插入的18bp片段的核苷酸序列。

序列表seqidno：2是多效性基因sgdp7的水稻川7的等位基因的全序列(其中atg上游为6489bp；cds区的序列为957bp，编码318个氨基酸序列)。

序列表seqidno：3是多效性基因sgdp7的cds序列(注：sgdp7南洋占等位基因与sgdp7川7等位基因具有相同的cds)。

序列表seqidno：4是多效性基因sgdp7编码的蛋白质序列(注：南洋占等位基因sgdp7和川7等位基因sgdp7编码相同的氨基酸)。

序列表seqidno：5是多效性基因sgdp7的南洋占等位基因sgdp7的核苷酸序列(也为遗传互补转化序列)。

图1.是本发明的总体技术路线图。

图2.是本发明中sgdp7基因的精细定位和候选基因的预测。附图标记说明：图2中的a图是sgdp7在水稻第7染色体上的精细定位候选区间；图2中的b图是精细定位候选区间的所有变异位点(含snp与indel)；图2中的c图是sgdp7候选基因及其上游区间展示图；图2中的d图是遗传转化的互补片段大小与相对位置，及多态性位点snp4碱基变异与indel712插入序列的展示图。

图3.sgdp7在近等基因系两基因型(南洋占，即nil-nn和川7，即nil-cc)幼穗中的差异表达分析。图4.用于克隆sgdp7转化序列的原始质粒pcambia1301和本发明构建的转化质粒pcambia1301-sgdp7的图谱。附图标记说明：图4中的a图是原始质粒pcambia1301图谱与sgdp7遗传互补转化片段；图4中的b图是转化质粒pcambia1301-sgdp7的图谱。

图5.sgdp7近等基因系穗型与粒形表型图。附图标记说明：图5的左边为nil-nn，图5的右边为nil-cc。

图6.是近等基因系两基因型(南洋占，即nil-nn和川7，即nil-cc)的产量及产量相关性状的表型比较分析。附图标记说明：图6中的a图的“paniclenumberperplant”为有效穗数，它在nil-nn与nil-cc两基因型之间没有显著差异；图6中的b图的“no.ofprimarybranches”为一次枝梗数，它在nil-nn与nil-cc两基因型之间没有显著差异；图6中的c图的“no.ofsecondarybranches”为二次枝梗数，nil-cc的二次枝梗数显著多于nil-nn的二次枝梗数；图6中的d图的“ratioofnsb/npb”为二次枝梗数与一次枝梗数比值，nil-cc的二次枝梗数与一次枝梗数比值显著大于nil-nn的二次枝梗数与一次枝梗数比值；图6中的e图的“spikeletsperpanicle”为每穗颖花数，nil-cc的每穗颖花数显著多于nil-nn的每穗颖花数；图6中的f图的“1000-grainweight”为千粒重，nil-nn的千粒重显著大于nil-cc的千粒重；图6中的g图的“grainyieldperplant”为单株产量，nil-cc的单株产量显著高于nil-nn的单株产量。

图7.利用indel标记indel712进行pcr扩增检测不同水稻品种基因型的3％琼脂糖胶电泳胶图。附图标记说明：图中：“nyz”表示南洋占带型，“c7”表型川7带型；泳道1中为dnamaker泳带，泳道2-18带型同于川7带型，泳道19-31带型同于南洋占带型。

具体实施方式

根据图1所述的的技术路线，申请人利用水稻品种“南洋占”和“川7”(上海市农业生物基因中心罗利军研究员赠送)衍生的重组自交系f7代群体构建遗传连锁图谱并收集表型进行了数量性状位点分析后，在第7染色体长臂下端(rm22065-rm5720)定位到的每穗颖花数、千粒重、粒长的数量性状位点(baietal.,bmcgenetics2010,11:16)。对185个重组自交系进行筛选并发现ri68与ri76株系在区间“rm22065-rm5720”呈杂合状态。收获该两株系种子进行种植来获得f2分离群体。该分离群体即为sgdp7的近等基因系。

种植sgdp7的近等基因系f2大群体(6890株)利用有关ssr公用标记和新开发的indel和snp标记(分子标记引物序列见表2)进行重组单株筛选，最终将sgdp7定位到17.8-kb。在定位区间内，除了6个snp差异外，在loc_os07g47330的上游还发现存在一个18bp的插入/缺失的多态位点；为此，将“loc_os07g47330”作为sgdp7的候选基因，它起始密码子“atg”上游6489bp区段(包含该18bp插入片段)为该基因调控区段(图2；序列见seqidno:1)。此外，通过表达分析发现“loc_os07g47330”在nil-nn中表达显著高于在nil-cc中的表达(见图3)。

通过比较测序分析，两候选基因的“南洋占”等位基因序列与“日本晴”的等位基因序列基本相同。因此，我们利用“日本晴”的bac克隆a0044i19。使用pstⅰandspeⅰ分离获得8.2-kb的dna片段(即df1，见图2)，进而通过pcr扩增与片段重组将其中snp2的“日本晴”等位型碱基“c”置换成“南洋占”等位型碱基“t”；之后再将上述分离并重组的片段克隆至互补载体pcambia1301(pcambia1301是公开报道和广泛使用的载体：http://www.cambia.org/daisy/cambia/585，见图4a)得到转化质粒pcambia1301-sgdp7，见图4b)，进而将转化质粒pcambia1301-sgdp7转化到受体sgdp7近等基因系川7基因型水稻中。通过对转基因阳性植株的表型考察和统计分析发现：该片段可以互补表型。证实“loc_os07g47330”(并包含6489bp的上游片段)为sgdp7基因。

以下实施例进一步定义了本发明，并描述了sgdp7基因的分离克隆及功能标记的开发中的应用过程。

实施例1：sgdp7近等基因系构建及效用评价

在武汉华中农业大学水稻实验基地种植水稻品种“南洋占”和“川7”(上海市农业生物基因中心罗利军研究员惠赠)构建得到185个重组自交系f7家系(baietal.,bmcgenetics2010,11:16)，并利用几乎覆盖整个基因组的分子标记构建遗传连锁图进而结合表型进行qtl定位分析，其结果发现：在水稻的第7染色体长臂末端“rm22065-rm5720”区间存在一个分别控制千粒重、粒长和每穗颖花数的多效性qtl。鉴于这个结果，本发明对所有的重组自交系家系排查在区段“rm22065-rm5720”为杂合状态，而在其他基因组位置为纯合状态的株系，结果发现“ri68”与“ri76”(baietal.,bmcgenetics2010,11:16)株系属于这种情况。因此，将该ri68与ri76株系的后代收获并种植，发现其后代中出现千粒重、粒长和每穗颖花数的分离，分离比例接近3：1；因此它们的后代群体被称为sgdp7近等基因系(baietal.,bmcgenetics2010,11:16)。两个近等基因系群体中各基因型的不同表型值汇总于如表1和图5-6所示。

表1sgdp7的近等基因系表型比较分析(ri68)

在表1中，“trait”代表表型性状；“nil-nn”代表近等基因系南洋占基因型；“nil-cc”代表近等基因系川7基因型；“pn”代表单株有效穗数；“npb”代表一次枝梗数；“nsb”代表二次枝梗数；“nsb/npb”代表二次枝梗数与一次枝梗数比值；“spp”代表每穗颖花数；“gl”代表粒长；“tgw”代表千粒重；表型值为平均值±标准差.p值由t检验得出。

实施例2：sgdp7的精细定位和候选基因确定

1.重组单株筛选和sgdp7的精细定位

2009年的生长季节(5月至10月)在中国湖北武汉种植6890株sgdp7近等基因系分离群体。利用该基因定位区段的ssr分子标记“rm22065”、“rm5720”、“rm6389”和“rm22115”(见http://www.gramene.org/markers/)及自创多态性标记“indel76”、“indel712”和“snp1-snp7”(引物序列见表2)来筛选重组单株并最终将该基因定位到“snp4-snp8”(17.8kb)的区段中(图2)。

2.候选基因的确定

从上述候选区段内鉴定到一个18bp的插入/缺失的多态位点，而该位点位于loc_os07g47330的上游，为此，本发明将“loc_os07g47330”作为sgdp7的候选基因。而该候选基因的编码区在“南洋占”与“川7”两亲本之前未发现任何变异。而在起始密码子atg上游5309bp处存在一个插入/缺失(“川7”中插入了18bp的片段)的多态位点，此外还有2个snp多态性位点(snp2与snp4)，而snp2不在候选区间内(见图2)。此外，通过real-timepcr方法(见baietal.,scientificreports,2016,6:19022)检测loc_os07g47330在两近等基因系(nil-nn与nil-cc)幼穗中的差异表达，结果表明loc_os07g47330在nil-nn中表达显著高于nil-cc中的表达(如图3)。

表2sgdp7定位、克隆和测序所设计的相关引物序列

注：表2中的序列均为分子标记的引物序列。其中，indel712是功能标记，其余均标记均为定位过程中的标记。

实施例3：sgdp7的转基因互补试验

通过比较测序分析，两候选基因的南洋占等位基因序列与日本晴的等位基因序列基本相同。因此，利用日本晴的bac克隆“a0044i19”。使用pstⅰ与speⅰ双酶切bac克隆a0044i19，获得8.2-kb的dna片段(df1，见图2)，进而将其中snp2日本晴等位型(c)置换成南洋占等位型(t)；之后将上述分离的片段和pstⅰ与speⅰ双酶切后的空载体pcambia1301(见图4中的a图)，并分别纯化和回收(fermentas*genomicdnapurificationkit，thermofisherscientificinc)进而用t4-dna连接酶(promega)将转化片段分别连接克隆到“pcambia1301”表达载体上(见图4中的b图)；利用农杆菌介导的遗传转化方法将转化载体携带着候选基因“loc_os07g47330”转化至sgdp7近等基因系川7基因型水稻中。其中，所得“loc_os07g47330”转基因阳性单株(t1代)表现型与sgdp7近等基因系南洋占基因型单株表现型极为相似(表3)。因此认为loc_os07g47330为候选基因。sgdp7即被成功克隆。

表3sgdp7互补转化转基因单株的表型

表3的说明：“genotype”代表基因型；“npb”代表一次枝梗数；“nsb”代表二次枝梗数；“nsb/npb”

代表二次枝梗数与一次枝梗数比值；“spp”为每穗颖花数；“gl”为粒长；“tgw”为千粒重

实施例4：利用分子标记indel712检测不同水稻品种的sgdp7基因型

针对上述18bp的插入/缺失多态性位点设计了分子标记引物indel712(见表2)。pcr扩增体系为：2×gcbuffer(http://www.takarabiomed.com.cn/)8μl、dntp4μl、indel712引物(正向+反向)2μl(2mm)，

dna模板2μl、r-taq(http://www.takarabiomed.com.cn/)0.3μl、ddh2o补齐至25μl。pcr反应程序为：95℃5分钟，95℃30秒，64℃30秒，72℃30秒，循环35次，72℃5分钟，25度1分钟完成pcr扩增。pcr扩增产物加溴酚蓝后上样3％琼脂糖胶电泳(100瓦)15分钟后成像系统照胶。其检测结果如图7所示。含18bp插入的水稻品种同川7(c7)带型，而无插入的水稻品种同南洋占(nyz)带型。

本发明的转基因具体步骤如下：

将正确克隆的质粒通过农杆菌介导的水稻遗传转化体系导入到sgdp7近等基因系川7基因型中，经

过愈伤诱导，继代，预培养、侵染、共培养、筛选具有潮霉素抗性的愈伤、分化、生根、练苗和移栽，得到转基因植株。农杆菌介导的水稻(粳稻亚种)遗传转化体系主要应用hiei等人报道的方法(参见：efficienttransformationofrice，oryzasatival.，mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna，1994，plantjournal6:271-282)基础上进行优化。

遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写

本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；cn(carbenicillin，羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量元素成分溶液)；n6mix(n6微量元素成分溶液)；msmax(ms大量元素成分溶液)；msmix(ms微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)n6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10x)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)n6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100x)配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(fe2edta)贮存液(按照100x浓缩液配制)；

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(na2edta·2h2o)和2.78克feso4·7h2o分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100x浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)ms培养基大量元素母液(msmax母液)(按照10x浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)ms培养基微量元素母液(msmin母液)(按照100x浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2,4-d贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2,4-d100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-苄基氨基嘌呤(6-ba)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-ba100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(naa)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取naa100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(iaa)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取iaa100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)as贮存液的配制：

秤取as0.392克，加入dmso10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1n氢氧化钾贮存液

秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，用1n的氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法在121℃下灭菌25分钟；

2)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升as贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按常规方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升as贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节ph值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升as贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节ph值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升hn(50毫克/毫升)和400微升cn(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升hn(50毫克/毫升)250微升cn(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1n氢氧化钾调节培养基的ph值至5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

将成熟的sgdp7近等基因系川7基因型种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(hgcl2)种子表面消毒15分钟；

用灭菌水洗种子4-5次；

将种子放在诱导培养基上；

将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代

挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的la培养基(la培养基的配制参照j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌eha105(该菌株来自cambia公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

调节农杆菌的悬浮液至od6000.8-1.0；

将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

浸泡在含400毫克/l羧苄青霉素(cn)的灭菌水中30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同普通大田。

通过以上转基因方法，成功获得三株转基因水稻阳性植株，对转基因阳性植株的进一步考察表明，本发明获得的转基因植株的每穗颖花数显著减少，而千粒重和粒长显著增加(见表3，图4和图5)。

参考文献

1.alancoulson,johnsulston,sydneybrenner,jonathankarn.(1986)towardaphysicalmapofthegenomeofthenematodecaenorhabditiselegans.procnatlacadsciusa,83:7821-7825.

2.daisukefujita,kurniawanruditrijatmiko,analizagrubanzotagle,mariaveronicasapasap,yoheikoide,kazuhirosasaki,nikolaostsakirpaloglou,ritchelbuenogannaban,takeshinishimura,seijiyanagihara,yoshimichifukuta,tomokazukoshiba,inezhortenseslamet-loedin,tsutomuishimaru,nobuyakobayashi*.(2013)nal1allelefromaricelandracegreatlyincreasesyieldinmodernindicacultivars.procnatlacadsciusa,2013,110:20431-20436.

3.denisfabre*,dewie.adriani,michaeldingkuhn,tsutomuishimaru,bermenitopunzalan,tanguylafarge,anneclement-vidal,delphineluquet.(2016)theqtsn4effectonflagleafsize,photosynthesisandpaniclesize,benefitstoplantgrainproductioninrice,dependingonlightavailability.frontplantsci,7,article623.

4.fumiotaguchi-shiobara*,tatsuyaota,kaworuebana,taiichiroookawa,masanoriyamasaki,takanaritanabata,utakoyamanouchi,jianzhongwu,nozomiono,yasunorinonoue,kazufuminagata,shuichifukuoka,hideyukihirabayashi,toshioyamamoto,masahiroyano.(2015)naturalvariationintheflagleafmorphologyofriceduetoamutationofthenarrowleaf1geneinoryzasatival.genetics,201,795-808.

5.guang-hengzhang,shu-yuli,liwang,wei-junye,da-lizeng,yu-chunrao,you-linpeng,jianghu,yao-longyang,jiexu,de-yongren,zhen-yugao,lizhu,guo-jundong,xing-minghu,mei-xianyan,long-biaoguo,chuan-youli,qianqian*.(2014).lschl4fromjaponicacultivar,whichisallelictonal1,increasesyieldofindicasuperrice93-11.molplant,7,1350-1364

6.xufengbai,lijunluo,wenhaoyan,mallikarjunaraokovi,weizhanandyongzhongxing*.geneticdissectionofricegrainshapeusingarecombinantinbredlinepopulationderivedfromtwocontrastingparentsandfinemappingapleiotropicquantitativetraitlocusqgl7.bmcgenet,2010,11:16.

7.xufengbai,yonghuang,donghaimao,miwen,lizhang,yongzhongxing*.(2016)regulatoryroleoffzpinthedeterminationofpaniclebranchingandspikeletformationinrice.scirep-uk,6:19022.

8.yuexingwang,guoshengxiong,jianghu,liangjiang,hongyu,jiexu,yunxiafang,longjunzeng,erboxu,jingxu,weijunye,xiangbingmeng,ruifangliu,hongqichen,yanhuijing,yonghongwang,xudongzhu*,jiayangli*,qianqian*.copynumbervariationatthegl7locuscontributestograinsizediversityinrice.natgenet,2015,47:944-948。

sequencelisting

<110>华中农业大学

<120>稻穗发育基因的沉默子cnv-18bp及在水稻产量改良中的应用

<130>

<141>2017-05-10

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<213>水稻（oryzasativa）

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