一种生产3-羟基丙酸的重组假单胞菌、其构建方法及其应用与流程

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体涉及一种生产3-羟基丙酸的重组假单胞菌、其构建方法及其应用。

背景技术：

3-羟基丙酸，是合成具有高附加经济价值的丙烯酸的绿色原料，广泛用于婴儿纸尿裤、表面涂层、油漆涂料和粘合剂工业上。近年来，丙烯酸的需求不断增加。传统的化学法生产3-羟基丙酸具有过程复杂、成本高和易环境污染等特点，而微生物法生产3-羟基丙酸可以有效地避免这些因素。目前生物基3-羟基丙酸主要以甘油为底物通过微生物发酵获得的，原料甘油价格受生物柴油产业发展影响较大。在中国不与粮油争地的政策前提下，生物柴油产业原料资源不足、成本过高，给利用甘油作为原料合成3-羟基丙酸带来了局限性。因此，解决原料来源和成本问题对于提高中国生物基3-羟基丙酸生产的竞争力，实现生物基3-羟基丙酸的可持续发展至关重要。乙酸在我国来源丰富，工农业排放的废水中富含大量的乙酸；合成生物气转化，一碳物质甲醇和甲烷转化，污水污泥厌氧消化等也会产生大量的乙酸。与其他原料相比，乙酸原料价格低廉。若以乙酸为原料用于生物基3-羟基丙酸的合成，将可以大幅度降低生产成本，提高生物基3-羟基丙酸的竞争力，实现生物基3-羟基丙酸的可持续发展。模式微生物大肠杆菌(e.coli)已经被报道可以利用乙酸合成3-羟基丙酸，但是可耐受乙酸的浓度低(<8g/l)，菌体代谢乙酸时细胞生长缓慢。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种对底物乙酸的耐受性高的生产3-羟基丙酸的重组假单胞菌，及其构建方法，以及利用重组假单胞菌发酵生产3-羟基丙酸的方法。

作为本发明的第一方面，提供了一种产3-羟基丙酸的重组假单胞菌的构建方法，所述构建方法为下列方法之一：

方法1：将乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc和丙二酰辅酶a还原酶基因mcr构建到原核表达载体上，然后将原核表达载体导入假单胞菌中，构建得到重组假单胞菌；

方法2：将将乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc和丙二酰辅酶a还原酶基因mcr整合到假单胞菌基因组中构建得到重组假单胞菌。

优选的，方法1具体包括：将乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc和丙二酰辅酶a还原酶基因mcr构建到大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pucpk上，得到的重组质粒pucpk-am，然后用pucpk-am转化假单胞菌，得到重组假单胞菌zap-am1。

优选的，所述假单胞菌为atcc13867。

作为本发明的第二方面，提供了由上述构建方法所述构建的重组假单胞菌。

作为本发明的第三方面，提供了重组假单胞菌在发酵生产3-羟基丙酸中的应用。

优选的，所述发酵是以乙酸为原料进行好氧发酵。

优选的，所用发酵培养基配方为：100mmol/l磷酸缓冲液、5g/l乙酸钠、0.25g/l硫酸镁、1g/l氯化铵、1g/l酵母膏；生物素2.2mg/l，碳酸氢钠20mmol/l，磷酸缓冲液的ph＝7.0。

优选的，所述发酵条件为：以接种后od600＝0.1的接种量将种子液接种到50ml发酵培养基中，温度37℃、250rpm条件下发酵24小时。

本发明的有益效果：本发明的重组假单胞菌对底物乙酸的耐受性高，可用于规模化生产3-羟基丙酸；以本发明的重组假单胞菌生产3-羟基丙酸生产菌，可固定co2、提高3-羟基丙酸碳收率和底物原子经济性、降低生产原料成本和发酵产酸过程碱性中和试剂添加成本。

附图说明

图1为本发明实施例中利用重组假单胞菌生产3-羟基丙酸的代谢途径。

具体实施方式：

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，如sambrook等分子克隆实验手册，或按照产品说明书建议的条件。

以下实施例中使用的大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pucpk为前期构建。

实施例1在假单胞菌中过表达乙酰辅酶a羧化酶基因accadbc和丙二酰辅酶a还原酶基因mcr

以假单胞菌(pseudomonassp.atcc13867)的基因组为模板，设计引物进行pcr分别扩增acca(seqidno.1)，accb(seqidno.2)，accc(seqidno.3)，accd(seqidno.4)，然后进行重叠pcr，以获得accadbc的一个基因簇。以ncbi中嗜热光合绿丝菌的基因组信息查询mcr基因的核苷酸序列，然后进行密码子优化后，送去基因合成公司合成mcr基因(mcr基因序列如seqidno.5所示)，将合成的基因进行pcr扩增。将大肠杆菌-假单胞菌穿梭质粒pucpk用xbai和hindiii进行酶切，将mcr片段连接到pucpk上，获得的重组质粒命名为pucpk-m；此质粒用bamhi和ecori进行酶切，将accabdbc片段连接到pucpk-m上，获得的重组质粒命名为pucpk-am。利用电穿孔仪(伯乐)将pucpk-am通过电转化转入到假单胞菌中，电极条件为25μf，200ω，180v(电击杯宽度为2mm)。在含有30mg/l的卡那霉素lb平板上筛选获得重组菌，命名为zap-am1。

实施例2利用重组假单胞菌发酵生产3-羟基丙酸

将假单胞菌野生菌株zap以及重组菌zap-am1分别在lb平板上过夜培养。从该新鲜平板上单菌落接种到含有10ml种子培养基的50ml三角瓶中，37℃、250rpm培养12小时，所得种子液od600值为3-4。

种子培养基luria-bertani(lb)的配方为：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母膏，10g/l氯化钠。

以接种后od600＝0.1的接种量将种子液接种到50ml发酵培养基中，发酵采用250ml三角瓶，控制温度37℃、250rpm，发酵时间24小时。

发酵培养基的配方包括：100mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)、5g/l乙酸钠、0.25g/l硫酸镁、1g/l氯化铵、1g/l酵母膏；生物素2.2mg/l，碳酸氢钠20mmol/l。

如图1所示，乙酸在微生物体内代谢生成中间产物乙酰辅酶a，乙酰辅酶a首先在乙酰辅酶a羧化酶(acc)的作用下生成丙二酰辅酶a，丙二酰辅酶a再进一步通过丙二酰辅酶a还原酶(mcr)的催化生成3-羟基丙酸。

发酵24小时后，经测定，野生菌株zap不产3-羟基丙酸，而重组菌zap-am产5mm的3-羟基丙酸。

序列表

<110>江苏师范大学

<120>一种生产3-羟基丙酸的重组假单胞菌、其构建方法及其应用

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<213>嗜热光合绿丝菌(chloroflexusaurantiacus)

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