本发明涉及降解麦草秸秆的微生物复合菌系制备
技术领域：
，具体涉及一种新型降解麦草秸秆的复合菌系及其制备方法与应用。
背景技术：
：我国作为一个农业大国，农作物秸秆资源最为丰富，秸秆产量每年可达到7亿吨以上，尤其麦草秸秆的产量最大。目前对于麦草秸秆的主要利用途径是秸秆还田，因为秸秆在腐解过程中，能够释放许多营养物质，从而改善土壤结构，增加土壤有机质，增加土壤透气性，达到提高土壤肥力的目的。麦草秸秆主要由纤维素、半纤维素、木质素、粗脂肪、粗蛋白和灰分组成。纤维素构架之间填充着半纤维素和木质素，并以牢固的氨键、化学键相连接构成结晶区域，使得麦草秸秆的纤维化和木质化程度高，自然降解过程缓慢。秸秆的降解实际上是微生物为主导的酶解过程，自然界中广泛存在着能降解纤维素的微生物。但由于玉米秸杆中的天然木质纤维素结构复杂，很难被单一微生物和酶分解。因此筛选出降解麦草秸秆的复合菌系对于麦草秸秆腐熟还田来说具有很重要的意义。技术实现要素：有鉴于此，有必要提供一种新型降解麦草秸秆的复合菌系。还有必要提供一种新型降解麦草秸秆的复合菌系的制备方法。还有必要提供一种新型降解麦草秸秆的腐熟剂。还有必要提供一种新型降解麦草秸秆的复合菌系应用。一种新型降解麦草秸秆的复合菌系，包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属；一种新型降解稻草秸秆的复合菌系的制备方法，包括以下步骤：采集微生物样品：采集包含有细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的样品；制备麦草秸秆：收集干净的麦草秸秆1kg，将麦草秸秆风干后，用40g/lnaoh溶液浸泡24h，然后用清水将麦草秸秆冲洗数次直至冲洗液为中性ph＝7.0，接着将浸泡后的麦草秸秆在80℃条件下烘干12-16h，将烘干后的麦草秸秆切成1cm-2cm长片段备用；制备蚯蚓液：收集活体蚯蚓5kg，清洗2-3遍以去除蚯蚓体表面的污物，接着加入蚯蚓质量3倍的清水，将蚯蚓浸泡12h以上直至蚯蚓将体内的沙子全部吐出，再将吐沙后的活体蚯蚓用浓度为75％的酒精浸泡2-3min，酒精的加入量为蚯蚓质量的2倍，再用浓度为3％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，次氯酸钠溶液的加入量也为蚯蚓液质量的2倍，以去除蚯蚓体表面的微生物，接着用组织匀浆机将蚯蚓破碎，制成蚯蚓液，将蚯蚓液分装于自封袋中，每份重量为0.5kg，置于冰箱内冷冻储藏，冷冻温度在-20℃，用时取出化冻使用；制备选择培养基：将制备好的麦草秸秆10g/l、尿素5g/l、豆渣1g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸氢二钠5g/l及500ml去离子水混合形成选择培养基，用1mol/l的盐酸或1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.0-7.2，补足水至1,000ml，接着将选择培养基在温度为121℃，压力为0.12mpa的条件下灭菌20min；复合菌系的初筛：(1)取制备好的蚯蚓液20g/l与采集到的微生物样品按20g/l的接种量一起加入至装有300ml上述新鲜选择培养基的锥形瓶中进行选择培养，用通气封口膜将锥形瓶密封，在28～30℃黑暗条件下选择培养3天；(2)选择培养3天后，将所述锥形瓶内的选择培养基充分摇匀，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml所述新鲜选择培养基的锥形瓶中，重复4次，得到4组选择培养基，用通气封口膜将锥形瓶密封，在28～30℃黑暗条件下继续选择培养3-6天；(3)将培养3-6天后的4组选择培养基作继代筛选，具体操作为：分别将4组选择培养基充分摇匀，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml所述新鲜选择培养基的锥形瓶中，在28～30℃黑暗条件下继续选择培养3-6天后摇匀选择培养基，再吸取20ml摇匀后的培养液接种新鲜选择培养基上继续选择培养，将4组选择培养基分别如此循环传代30次后，挑选出其中麦草秸秆降解能力强的选择培养基做进一步的复筛；复合菌系的复筛：(1)将所述复合菌系的初筛挑选出的麦草秸秆降解能力强的选择培养基充分摇匀后，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，继续培养12天，每隔3天分别测定一次锥形瓶内的滤纸酶活、外切β-1,4-葡聚糖酶活、内切β-1,4-葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活及半纤维素酶活；(2)继续传代和驯化处理，选取步骤(1)中滤纸酶活、外切β-1,4-葡聚糖酶活、内切β-1,4-葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活和半纤维素酶活高的选择培养基，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，继续在28～30℃黑暗条件下选择培养3天后摇匀选择培养基，再吸取20ml摇匀后的培养液接种新鲜选择培养基上继续选择培养，如此循环传代20次后，继续测定以上指标，筛选出麦草秸秆降解能力最高、能够稳定遗传的选择培养基；(3)选取降解能力最高、能稳定遗传的选择培养基进行复合菌系菌种的鉴定，通过对选择培养基中的复合菌系进行16s-rrna测序确定出复合菌系包含有细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属。优选的，所述制备选择培养基步骤中加入的尿素、硫酸镁、硫酸锰及磷酸氢二钠，均为分析纯，筛选过程中的制备水均为去离子水。优选的，在所述复合菌系的初筛和复合菌系的复筛过程中通过目测观察麦草秸秆的漂浮情况来判定麦草秸秆降解的程度，降解能力强的选择培养基内的麦草秸秆部分或全部漂浮到锥形瓶液面上，降解能力较弱的选择培养基内的麦草秸秆沉在锥形瓶底部，以筛选出降解能力最高、能稳定遗传的选择培养基。一种腐熟剂，包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系及必要的辅料，所述包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系为所述腐熟剂的活性成分，所述包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系为权利要求1所述的复合菌系。一种腐熟剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系：(1)将包含有细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系的选择培养基，按10g/l的接种量接入到已灭菌的装有650ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶的温度保持在32-34℃，在180r/min持续震荡的状态下培养24h后，作为扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系的种子液，全部移入已灭菌的发酵罐中，将发酵罐的温度控制在32-34℃之间，在180r/min震荡状态下培养72h，即完成扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系的过程；制备固体培养基：将所述制备好的麦草秸秆200g/l、豆饼268g/l、尿素14g/l、氯化钠8g/l、葡萄糖8g/l、硫酸锰0.4g/l、硫酸镁0.8g/l及500ml去离子水混合为一体，至整个混合料捏在手中刚能搓开的状态，形成固体培养基，用1mol/l的盐酸或1mol/l氢氧化钠溶液调节固体培养基的ph至7.0～7.2；制备秸秆腐熟剂：将制备好的固体培养基装于浅盘中，将装有固体培养基的浅盘在温度为121℃，压力为0.12mpa的条件下灭菌20min，待浅盘冷却后将扩大培养后的麦草秸秆降解菌复合菌系按30g/l的接种量接种到浅盘中，接种完成后，将浅盘置于固态发酵箱内在34℃条件下，固态发酵72h，制得麦草秸秆腐熟剂，发酵期间保持固态发酵箱内湿度在60％-70％，温度在32-34℃；烘干：将浅盘固态发酵完全的麦草秸秆腐熟剂烘干，烘干温度为40-50℃，烘干时间为12h-16h。优选的，所述制得的固体培养基能过90目筛。一种腐熟剂在降解麦草秸秆中的应用。本发明的技术效果为：由于蚯蚓体内含有能快速降解麦草秸秆中木质纤维素的微生物群，因此本发明将活体蚯蚓破碎后与采集到的微生物样品一起置于装有新鲜选择培养基的锥形瓶内进行复合菌系的筛选，经过复合菌系的初筛和复筛筛选取降解能力最高、能稳定遗传的选择培养基进行复合菌系菌种的鉴定，将筛选出的复合菌系制作成麦草秸秆腐熟剂来降解麦草秸秆，利用蚯蚓体内的微生物群与微生物样品中的微生物菌种协同作用，能够同步降解麦草秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素，降解速度快、效率高。所述复合菌系的初筛和复筛过程中通过目测观察麦草秸秆的漂浮情况来筛选出降解能力较高、能稳定遗传的选择培养基，方法简便，筛选效率高，且更易操作。复合菌系的复筛过程中以滤纸酶活、外切β-1,4-葡聚糖酶活、内切β-1,4-葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活和半纤维素酶活作为秸秆降解优势菌系筛选依据。由于液态发酵容易胀气且不好运输，因此在制备麦草秸秆腐熟剂时采用液体发酵和浅盘固态发酵相结合的方式，先将筛选到的复合菌系经过液态发酵扩大复合菌系的菌数量，再将扩大数量后的复合菌系置于固体培养基中进行固态发酵，发酵后进行烘干制得麦草秸秆腐熟剂。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定，不应以此限制本发明的保护范围。1、采集微生物样品采集地来自银川市周边、永宁县、贺兰县，石嘴山市的大武口区、惠农区、平罗县、吴忠市的利通区、红寺堡区、青铜峡市、同心县、盐池县，固原市的原州区、西吉县、隆德县、泾源县和彭阳县中卫市的沙坡头区、中宁县和海原县，采集这些地区的长期秸秆还田土壤、多年秸秆堆积处土壤、以腐熟的以秸秆和动物粪便腐熟为主的堆肥和堆肥改良土壤作为样品供菌种筛选。2、制备选择培养基制备麦草秸秆：收集干净的麦草秸秆1kg，将麦草秸秆风干后，用40g/lnaoh溶液浸泡24h，然后用清水将麦草秸秆冲洗数次直至冲洗液为中性，ph＝7.0，naoh能洗脱麦草秸秆上的腊质层，破坏麦草秸秆内部木质素包裹，从而增加降解菌与纤维素的接触面积，使得降解菌能更快的降解麦草秸秆，接着将浸泡后的麦草秸秆在80℃条件下烘干12-16h，将烘干后的麦草秸秆切成1cm-2cm长片段备用；制备蚯蚓液：收集活体蚯蚓5kg，清洗2-3遍以去除蚯蚓体表面的污物，接着加入蚯蚓质量3倍的清水，将蚯蚓浸泡12h以上直至蚯蚓将体内的沙子全部吐出，再将吐沙后的活体蚯蚓用浓度为75％的酒精浸泡2-3min，酒精的加入量为蚯蚓质量的2倍，再用浓度为3％的次氯酸钠溶液浸泡10-15min，次氯酸钠溶液的加入量也为蚯蚓液质量的2倍，以去除蚯蚓体表面的微生物，接着用组织匀浆机将蚯蚓破碎，制成蚯蚓液，将蚯蚓液分装于自封袋中，每份重量为0.5kg，置于冰箱内冷冻储藏，冷冻温度在-20℃，用时取出化冻使用；蚯蚓体内存在的特殊微生物群能够分解蛋白质、脂肪和纤维等，因此将活体蚯蚓破碎后与采集到的微生物样品一起置于装有新鲜选择培养基的锥形瓶内进行复合菌系的筛选，利用蚯蚓体内丰富的微生物群，达到快速降解麦草秸秆中纤维素的目的，以与微生物样品中的微生物菌协同作用以快速降解麦草秸秆。制备选择培养基：将制备好的麦草秸秆10g/l、尿素5g/l、豆渣1g/l、硫酸镁0.1g/l、硫酸锰0.1g/l、磷酸氢二钠5g/l及500ml去离子水混合形成选择培养基，用1mol/l的盐酸或1mol/l氢氧化钠溶液调节ph至7.0-7.2，补足水至1,000ml，接着将选择培养基在温度为121℃，压力为0.12mpa的条件下灭菌20min；所述尿素、硫酸镁、硫酸锰及磷酸氢二钠，均为分析纯，筛选过程中的制备水均为去离子水。3、复合菌系的初筛(1)取制备好的蚯蚓液20g/l与采集到的微生物样品按20g/l的接种量一起加入至装有300ml上述新鲜选择培养基的锥形瓶中进行选择培养，用通气封口膜将锥形瓶密封，在28～30℃黑暗条件下选择培养3天；(2)选择培养3天后，将所述锥形瓶内的选择培养基充分摇匀，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml所述新鲜选择培养基的锥形瓶中，重复4次，得到4组选择培养基，用通气封口膜将锥形瓶密封，在28～30℃黑暗条件下继续选择培养3-6天；(3)将培养3-6天后的4组选择培养基作继代筛选，具体操作为：分别将4组选择培养基充分摇匀，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml所述新鲜选择培养基的锥形瓶中，在28～30℃黑暗条件下继续选择培养3-6天后摇匀选择培养基，再吸取20ml摇匀后的培养液接种新鲜选择培养基上继续选择培养，将4组选择培养基分别如此循环传代30次后，挑选出其中麦草秸秆降解能力强的选择培养基做进一步的复筛；通过目测观察各个锥形瓶内选择培养基的麦草秸秆的漂浮情况，来淘汰无分解和降解能力较弱的选择培养基，降解能力强的选择培养基内的麦草秸秆部分或全部漂浮到锥形瓶液面上，降解能力较弱的选择培养基内的麦草秸秆基本沉在锥形瓶底部，从而挑选出麦草秸秆降解能力强的做进一步的复筛；(4)初筛测定结果初筛共挑选出11组麦草秸秆降解能力强的选择培养基，将其按序号命名为mj-1、mj-2至mj-11。4、复合菌系的复筛(1)将所述复合菌系的初筛挑选出的麦草秸秆降解能力强的选择培养基充分摇匀后，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，继续培养12天，每隔3天分别测定一次锥形瓶内的滤纸酶活、外切β-1,4-葡聚糖酶活、内切β-1,4-葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活及半纤维素酶活；(2)继续传代和驯化处理，选取步骤(1)中滤纸酶活、外切β-1,4-葡聚糖酶活、内切β-1,4-葡聚糖酶活、β-葡聚糖酶活和半纤维素酶活高的选择培养基，吸取20ml摇匀后的培养液接种到装有300ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，继续在28～30℃黑暗条件下选择培养3天后摇匀选择培养基，再吸取20ml摇匀后的培养液接种新鲜选择培养基上继续选择培养，如此循环重复20次后，继续测定以上指标，筛选出降解能力最高、能够稳定遗传的选择培养基；降解能力强的选择培养基内的麦草秸秆部分或全部漂浮到锥形瓶液面上，降解能力较弱的选择培养基内的麦草秸秆基本沉在锥形瓶底部，从而筛选出麦草秸秆降解能力强的锥形瓶内的选择培养基重复；(3)复筛测定结果：分别对11组降解能力强的选择培养基做了酶活性的测定计算，选出了各个酶活性最高的五组数据如下：表1酶活性(u/ml)由表1中数据看出mj-5组的滤纸酶活1.432u/ml、外切β-1,4-葡聚糖酶活0.640u/ml、内切β-1,4-葡聚糖酶活1.477u/ml、β-葡聚糖酶活0.870u/ml和半纤维素酶活4.118u/ml均高于其他组分，得出mj-5组降解麦草秸秆能力最强，由此作为继续传代培养的选择培养基。将mj-5连续传代20代后，再测定各个酶活性，滤纸酶活为1.443u/ml，外切β-1,4-葡聚糖酶活0.820u/ml、内切β-1,4-葡聚糖酶活为1.234u/ml、β-葡聚糖酶活为0.770u/ml、半纤维素酶活4.023u/ml，变化不显著，说明mj-5在传代培养中保持了良好的酶活性，能够稳定遗传。(4)通过对选择培养基mj-5中的复合菌系进行16s-rrna测序确定出复合菌系包含有细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属。5、一种腐熟剂，包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系及必要的辅料，所述包含细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系为所述腐熟剂的活性成分。6、一种腐熟剂的制备方法扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系：将包含有细菌myroides、ignatzschineria、wohlfahrtiimonas、bacteroides、alcaligenes、kerstersia、macellibacteroides、escherichia及desulfovibrio菌属的复合菌系的选择培养基，按10g/l的接种量接入到已灭菌的装有650ml新鲜选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶的温度保持在32-34℃，在180r/min持续震荡的状态下培养24h后，作为扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系的种子液，全部移入已灭菌的发酵罐中，将发酵罐的温度控制在32-34℃之间，在180r/min震荡状态下培养72h，即完成扩大培养麦草秸秆降解菌复合菌系的过程；制备固体培养基：将所述制备好的麦草秸秆200g/l、豆饼268g/l、尿素14g/l、氯化钠8g/l、葡萄糖8g/l、硫酸锰0.4g/l、硫酸镁0.8g/l及500ml去离子水混合为一体，至整个混合料捏在手中刚能搓开的状态，形成固体培养基，用1mol/l的盐酸或1mol/l氢氧化钠溶液调节固体培养基的ph至7.0～7.2；所述制得的固体培养基能过90目筛。制备秸秆腐熟剂：将制备好的固体培养基装于浅盘中，将装有固体培养基的浅盘在温度为121℃，压力为0.12mpa的条件下灭菌20min，待浅盘冷却后将扩大培养后的麦草秸秆降解菌复合菌系按30g/l的接种量接种到浅盘中，接种完成后，将浅盘置于固态发酵箱内在34℃条件下，固态发酵72h，制得麦草秸秆腐熟剂，发酵期间保持固态发酵箱内湿度在60％-70％，温度在32-34℃；烘干：将浅盘固态发酵完全的麦草秸秆腐熟剂烘干，烘干温度为40-50℃，烘干时间为12h-16h。7、一种腐熟剂在降解麦草秸秆中的应用将上述制备好的麦草秸秆腐熟剂应用到麦草秸秆上进行降解测试，在制备好的1cm-2cm的麦草秸秆段中按麦草秸秆重量的1‰加入秸秆腐熟剂混合均匀形成秸秆降解腐熟堆，1号降解腐熟堆内加入本发明制备的麦草秸秆腐熟剂，2号降解腐熟堆内加入其他品牌的秸秆腐熟剂，3号降解腐熟堆不加秸秆腐熟剂做空白对照，调节三个降解腐熟堆内的含水量均在65％-70％，三个降解腐熟堆的长均在1m，宽均在0.5m，高均在0.6m，放置15天让三个降解腐熟堆充分发酵，待发酵结束后分别测定三个降解腐熟内氮、磷、钾、总养分和有机质的含量。下表是三个降解腐熟堆内氮、磷、钾、总养分和有机质的测试结果。表2降解腐熟堆内氮、磷、钾、总养分(n+p2o5+k2o)和有机质的含量n(％)p2o5(％)k2o(％)n+p2o5+k2o(％)有机质(％)1号1.321.542.265.1250.382号1.111.442.434.9845.263号0.561.021.342.9228.43由表2看出，1号腐熟堆内的总养分和有机质的含量均明显高于其他两组，本发明制备出的麦草秸秆腐熟剂在降解麦草秸秆过程中能够释放更多的营养物质，增加土壤有机质，能够明显改善土壤结构提高土壤肥力。当前第1页12