本发明属于生物提取领域，具体涉及一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法。
背景技术：
白藜芦醇是多酚类化合物，主要来源于花生、葡萄(红葡萄酒)、虎杖、桑椹等植物。白藜芦醇是一种生物性很强的天然多酚类物质，又称为芪三酚，是肿瘤的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防和治疗动脉粥样硬化、心脑血管疾病的化学预防剂。在虎杖提取物中含有较多的白藜芦醇，因此经常地被作为一种有效的白藜芦醇的来源进行使用。
白藜芦醇化学名称为(e)-3，5，4-三羟基二苯乙烯。它是非黄酮类的多酚化合物，为白色针状晶体，难溶于水，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，在波长365nm的紫外光照射下能产生荧光，并能和三氯化铁-铁氰化钾起显色反应。
英文名resveratrol，cas号：501-36-0，分子式：c14h12o3，分子量：228.24，熔点：253-255℃。
白藜芦醇是一种天然的抗氧化剂，可降低血液粘稠度，抑制血小板凝结和血管舒张，保持血液畅通，可预防癌症的发生及发展，具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。抑制肿瘤的作用还具有雌激素样作用，可用于治疗乳腺癌等疾病。
20世纪90年代，中国科技工作者对白藜芦醇的研究不断深入，并揭示其药理作用:抑制血小板非正常凝聚，预防心肌硬塞、脑栓塞，对缺氧心脏有保护作用，对肥胖者可以起一个控制与减肥作用，对烧伤或失血性休克引起的心输出量下降有效恢复，并能够扩张动脉血管及改善微循环。
1998年美国艾尔·敏德尔编撰《抗衰老圣典》时，将白藜芦醇列为"100种最热门有效抗衰老物质"之一；白藜芦醇保健食品将会成为21世纪营养健康的新时尚。
白藜芦醇的主要来源是从天然植物中提取，国内一直是以虎杖、葡萄等植物为原料，国外主要是以虎杖等为原料。
目前对白藜芦醇的提取方法主要有：
1、醇提法:多采用乙醇回流提取或索氏提取。张建超等利用正交设计确定了醇提最优条件为:95%乙醇15倍量，回流提取3次，2h/次。也有用50%乙醇或甲醇提取的。该法简单、经济，但醇提出来的产品，颜色深，白藜芦醇含量低。
2、水提法:取虎杖粗粉水煎，过滤.浓缩。用95%乙醇溶解过滤，除杂，回收乙醇。用乙酸乙酯萃取4次，合并萃取液。减压回收乙酸乙酯至浸膏状，用稀乙醇溶解，放置，过滤，析出物即为白藜芦醇。该法操作简单，但得到的白藜芦醇纯度不高，且收率低。
3、薄层色谱法:采用此法可将白藜芦醇苷与虎杖中其他蒽醌类成分有效分离。薄层条件:流动相:3十六烷三甲基溴化铵水溶液(ctab)一乙酰丙酮(8:1.4)的微碱性溶液;固定相:聚酰胺铺板。取虎杖药粉置锥形瓶中，加入95乙醇适量，浸渍数小时，取乙醇液点于聚酰胺板上，以上述展开剂上行展开，即可分离出白藜芦醇苷该法得率较低，且使用有毒金属铅，会给环境带来严重污染。
4、超临界流体技术:曹庸等采用超临界co。流体技术对虎杖中自藜芦醇进行萃取，获得了初步萃取条件。该技术具有萃取能力强、提取率高、操作温度低、提取时间快，流程简单，操作方便、清洁等优点，代表了以后白藜芦醇乃至中药提取工艺的发展方向。该法综合成本低，污染小，但目前仅限于实验室规模提取。
5、人工合成法：以3，5一二羟基苯甲醇为起始原料，经甲基化、溴代、arbuzov重排反应得到中间体3，5一二甲氧基苄基磷酸酯，再与茴香醛经wittig-horner缩合及脱甲基化5步反应得到白藜芦醇。
也有人以大茴香醇为原料，经溴代，arbuzov重排反应得到中间体对甲氧基苄基磷酸酯，再与3，5一二甲氧基苯甲醛经过wittig-horner缩合反应及脱甲基化4步反应合成反式产物白藜芦醇。该法产量大，但易造成环境污染，环保压力大。
因此，总的来说，以上常用的提取白藜芦醇的方法，都能有效提取白藜芦醇，但是却无法有效转化白藜芦醇苷，造成资源的极大的浪费和生产成本的增加，另外还存在提取时间长、提取率低、产品中白藜芦醇含量低的问题。在以上研究的基础上，取长补短，从虎杖中提取纯化白藜芦醇，建立一种易于产业化、清洁环保的绿色工艺是非常有必要的。
技术实现要素：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法，本发明白藜芦醇提取率高，且含量高，绿色环保，利于工业化生产。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将虎杖粉碎过10～20目筛，得到虎杖粗粉；
（2）酶解、提取、浓缩：按照质量比1:2～4将虎杖粗粉加入水中，先高速剪切15～20min，再高频电磁波处理10～15min，然后加入相当于虎杖粗粉质量0.4～0.6%的阿魏酸酯酶；再用摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液调节ph=5～6，水浴加热至35～40℃，酶解24～48h，双频超声波交替处理15～25min后加入相当于虎杖粗粉质量10～15倍的体积分数为80%的乙醇溶液，回流提取1～2h，滤出提取液，按照料液比1:10～15将滤渣加入体积分数为80%的乙醇溶液中，高频电磁波处理15～20min，再回流提取2～3h，滤出提取液，合并两次提取液，浓缩至相当于虎杖投料量的2～6倍；
（3）酶解：向步骤（2）制得的浓缩液中加入相当于浓缩液质量0.3～0.5%的β-葡萄糖苷酶和0.2～0.4%的纤维素酶，高频电磁波处理10～15min，再水浴加热至40～45℃，搅拌酶解24～72h，得酶解液；
（4）离心分离：将步骤（3）反应好的酶解液离心分离，取沉淀加入相当于沉淀质量10～20倍的体积分数为70～95%的乙醇溶液中，水浴加热至50～60℃，搅拌至沉淀完全溶解，过滤，得乙醇溶解液；
（5）上中性氧化铝脱色纯化：将步骤（4）制得的乙醇溶解液过100～200目的中性氧化铝，控制流速为0.6～0.8ml/min，得脱色纯化液；
（6）活性炭脱色、浓缩结晶：向脱色纯化液中加入相当于脱色纯化液质量0.4～0.6%的活性炭，回流搅拌脱色2～4h，冷却过滤，滤液浓缩至最小体积，冷却至常温，结晶12～24h；
（7）离心、重结晶：将步骤（6）得到的结晶粗品离心，沉淀粗品用乙酸乙酯重结晶2～3次；
（8）过滤：将步骤（7）重结晶好的物料用布氏漏斗过滤，得白藜芦醇精品湿品沉淀；
（9）干燥：将白藜芦醇精品湿品沉淀放入烘箱干燥，干燥温度为70～80℃，干燥时间为12～24h；
（10）粉碎过筛：将干燥的白藜芦醇精品粉碎，过80～100目筛，得白藜芦醇成品。
步骤（2）中所述高速剪切的转速为6000～8000r/min。
步骤（2）中所述高频电磁波处理中电磁波频率为2400～2500mhz，功率为10～20kw。
步骤（2）中所述双频超声波交替处理中双频超声波交替频率为40～50khz/20～30khz，双频超声波交替工作时间为3～6s，超声波功率密度150～200w/l。
步骤（3）中所述高频电磁波处理中电磁波频率为2000～2200mhz，功率为15～25kw。
本发明的有益效果：
本发明在提取之前先采用阿魏酸酯酶结合高速剪切和高频电磁波对虎杖粗粉进行处理，不仅可以破碎虎杖的细胞壁结构，还可以切断木质素和半纤维素的交联架构，有利于虎杖细胞内有效成分的溶出，提取过程中采用双频超声波交替处理和高频电磁波处理，可以进一步促进虎杖细胞内有效成分的溶出；提取液再采用β-葡萄糖苷酶和纤维素酶两种酶配合高频电磁波进行处理，可有效低将白藜芦醇苷转化为白藜芦醇，显著提高虎杖中白藜芦醇的提取率。将得到的酶解物先后经离心分离、中性氧化铝脱色纯化、活性炭脱色、浓缩结晶、再结晶等工艺，可以显著提高成品白藜芦醇的含量。
具体实施方式
实施例1
一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将虎杖粉碎过10目筛，得到虎杖粗粉；
（2）酶解、提取、浓缩：按照质量比1:2将虎杖粗粉加入水中，先在转速为8000r/min的条件下高速剪切15min，再在电磁波频率为2500mhz，功率为20kw的条件下高频电磁波处理10min，然后加入相当于虎杖粗粉质量0.4%的阿魏酸酯酶；再用摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液调节ph=5，水浴加热至35℃，酶解48h，在双频超声波交替频率为50khz/30khz，双频超声波交替工作时间为3s，超声波功率密度200w/l的条件下双频超声波交替处理15min后加入相当于虎杖粗粉质量10倍的体积分数为80%的乙醇溶液，回流提取1h，滤出提取液，按照料液比1:10将滤渣加入体积分数为80%的乙醇溶液中，在电磁波频率为2500mhz，功率为20kw的条件下高频电磁波处理15min，再回流提取2h，滤出提取液，合并两次提取液，浓缩至相当于虎杖投料量的2倍；
（3）酶解：向步骤（2）制得的浓缩液中加入相当于浓缩液质量0.3%的β-葡萄糖苷酶和0.2%的纤维素酶，在电磁波频率为2200mhz，功率为25kw的条件下高频电磁波处理10min，再水浴加热至40℃，搅拌酶解72h，得酶解液；
（4）离心分离：将步骤（3）反应好的酶解液离心分离，取沉淀加入相当于沉淀质量10倍的体积分数为70%的乙醇溶液中，水浴加热至50℃，搅拌至沉淀完全溶解，过滤，得乙醇溶解液；
（5）上中性氧化铝脱色纯化：将步骤（4）制得的乙醇溶解液过100目的中性氧化铝，控制流速为0.6ml/min，得脱色纯化液；
（6）活性炭脱色、浓缩结晶：向脱色纯化液中加入相当于脱色纯化液质量0.4%的活性炭，回流搅拌脱色2h，冷却过滤，滤液浓缩至最小体积，冷却至常温，结晶12h；
（7）离心、重结晶：将步骤（6）得到的结晶粗品离心，沉淀粗品用乙酸乙酯重结晶2次；
（8）过滤：将步骤（7）重结晶好的物料用布氏漏斗过滤，得白藜芦醇精品湿品沉淀；
（9）干燥：将白藜芦醇精品湿品沉淀放入烘箱干燥，干燥温度为70℃，干燥时间为24h；
（10）粉碎过筛：将干燥的白藜芦醇精品粉碎，过80目筛，得白藜芦醇成品。
上述实施例白藜芦醇提取率为为1.714%，hplc分析成品中白藜芦醇含量为98.13%。
实施例2
一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将虎杖粉碎过15目筛，得到虎杖粗粉；
（2）酶解、提取、浓缩：按照质量比1:3将虎杖粗粉加入水中，先在转速为7000r/min的条件下高速剪切18min，再在电磁波频率为2450mhz，功率为15kw的条件下高频电磁波处理12min，然后加入相当于虎杖粗粉质量0.5%的阿魏酸酯酶；再用摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液调节ph=5.5，水浴加热至38℃，酶解36h，在双频超声波交替频率为45khz/25khz，双频超声波交替工作时间为4s，超声波功率密度180w/l的条件下双频超声波交替处理20min后加入相当于虎杖粗粉质量12倍的体积分数为80%的乙醇溶液，回流提取1.5h，滤出提取液，按照料液比1:12将滤渣加入体积分数为80%的乙醇溶液中，在电磁波频率为2450mhz，功率为15kw的条件下高频电磁波处理18min，再回流提取2.5h，滤出提取液，合并两次提取液，浓缩至相当于虎杖投料量的4倍；
（3）酶解：向步骤（2）制得的浓缩液中加入相当于浓缩液质量0.4%的β-葡萄糖苷酶和0.3%的纤维素酶，在电磁波频率为2100mhz，功率为20kw高频电磁波处理12min，再水浴加热至42℃，搅拌酶解48h，得酶解液；
（4）离心分离：将步骤（3）反应好的酶解液离心分离，取沉淀加入相当于沉淀质量15倍的体积分数为80%的乙醇溶液中，水浴加热至55℃，搅拌至沉淀完全溶解，过滤，得乙醇溶解液；
（5）上中性氧化铝脱色纯化：将步骤（4）制得的乙醇溶解液过150目的中性氧化铝，控制流速为0.7ml/min，得脱色纯化液；
（6）活性炭脱色、浓缩结晶：向脱色纯化液中加入相当于脱色纯化液质量0.5%的活性炭，回流搅拌脱色3h，冷却过滤，滤液浓缩至最小体积，冷却至常温，结晶18h；
（7）离心、重结晶：将步骤（6）得到的结晶粗品离心，沉淀粗品用乙酸乙酯重结晶3次；
（8）过滤：将步骤（7）重结晶好的物料用布氏漏斗过滤，得白藜芦醇精品湿品沉淀；
（9）干燥：将白藜芦醇精品湿品沉淀放入烘箱干燥，干燥温度为75℃，干燥时间为18h；
（10）粉碎过筛：将干燥的白藜芦醇精品粉碎，过90目筛，得白藜芦醇成品。
上述实施例白藜芦醇提取率为为1.753%，hplc分析成品中白藜芦醇含量为98.51%。
实施例3
一种从虎杖中提取高含量白藜芦醇的方法，包括以下步骤：
（1）粉碎：将虎杖粉碎过20目筛，得到虎杖粗粉；
（2）酶解、提取、浓缩：按照质量比1:4将虎杖粗粉加入水中，先在转速为8000r/min的条件下高速剪切15min，再在电磁波频率为2400mhz，功率为10kw的条件下高频电磁波处理15min，然后加入相当于虎杖粗粉质量0.6%的阿魏酸酯酶；再用摩尔浓度为0.1mol/l的盐酸溶液调节ph=6，水浴加热至40℃，酶解24h，在双频超声波交替频率为40khz/20khz，双频超声波交替工作时间为6s，超声波功率密度150w/l的条件下双频超声波交替处理25min后加入相当于虎杖粗粉质量15倍的体积分数为80%的乙醇溶液，回流提取2h，滤出提取液，按照料液比1:15将滤渣加入体积分数为80%的乙醇溶液中，在电磁波频率为2400mhz，功率为10kw的条件下高频电磁波处理20min，再回流提取3h，滤出提取液，合并两次提取液，浓缩至相当于虎杖投料量的6倍；
（3）酶解：向步骤（2）制得的浓缩液中加入相当于浓缩液质量0.5%的β-葡萄糖苷酶和0.4%的纤维素酶，在电磁波频率为2000mhz，功率为15kw高频电磁波处理15min，再水浴加热至45℃，搅拌酶解24h，得酶解液；
（4）离心分离：将步骤（3）反应好的酶解液离心分离，取沉淀加入相当于沉淀质量20倍的体积分数为95%的乙醇溶液中，水浴加热至60℃，搅拌至沉淀完全溶解，过滤，得乙醇溶解液；
（5）上中性氧化铝脱色纯化：将步骤（4）制得的乙醇溶解液过200目的中性氧化铝，控制流速为0.8ml/min，得脱色纯化液；
（6）活性炭脱色、浓缩结晶：向脱色纯化液中加入相当于脱色纯化液质量0.6%的活性炭，回流搅拌脱色4h，冷却过滤，滤液浓缩至最小体积，冷却至常温，结晶24h；
（7）离心、重结晶：将步骤（6）得到的结晶粗品离心，沉淀粗品用乙酸乙酯重结晶3次；
（8）过滤：将步骤（7）重结晶好的物料用布氏漏斗过滤，得白藜芦醇精品湿品沉淀；
（9）干燥：将白藜芦醇精品湿品沉淀放入烘箱干燥，干燥温度为80℃，干燥时间为12h；
（10）粉碎过筛：将干燥的白藜芦醇精品粉碎，过100目筛，得白藜芦醇成品。
上述实施例白藜芦醇提取率为为1.725%，hplc分析成品中白藜芦醇含量为98.28%。