雷替曲塞杂质C及其制备和应用的制作方法

本发明属于药物化学领域，特别的涉及一种雷替曲塞新杂质的制备及其应用。

背景技术：

雷替曲塞(raltitrexed)是由英国zeneca公司研制的新一代水溶性喹唑啉叶酸类似物胸苷酸合酶抑制剂，适用于晚期结直肠癌，其通过对胸苷酸合酶的专一抑制而产生抗肿瘤作用。其化学名为n-[[5-[[(1,4-二氢-2-甲基-4-氧-6-喹唑啉基)甲基]甲氨基]-2-噻吩基]羰基]-l-谷氨酸。结构式如下：

其与5-氟尿嘧啶相比，由于特异的选择性，毒副作用明显降低，但是其还是存在一定的毒性。根据相关临床试验的结果显示，其主要毒性不良反应包括对胃肠道、血液系统及肝酶的可逆性影响。

其中，对于血液系统主要有关的不良反应为白细胞减少(特别是中性粒细胞减少)、贫血和血小板减少(发生率分别为22％、18％和5％)，可单独发生或同时发生，这些反应通常为轻到中度(who1/2)，于用药后第1或2周内发生，第3周前恢复。也有可能发生重度(who3/4级)白细胞减少(特别是中性粒细胞减少)和who4级的血小板减少，可能会危及生命或致命，尤其与胃肠道毒性反应同时发生时。

目前当出现严重的不良反应时，临床上常用的策略为减少雷替曲塞的用量或者暂停药品的使用，并无相关如何降低雷替曲塞毒副作用的报道。因此，深入研究雷替曲塞发生不良反应的原因，提高雷替曲塞的用药安全性和有效性，更好地发挥其临床疗效，降低其不良反应或副反应，具有一定的实践意义。

经研究发现，雷替曲塞之所以会出现比较严重的血液系统副作用，与其成品中的噻吩类杂质具有一定的正相关性，即该杂质的含量越高，雷替曲塞的血液系统的毒副作用发生率就越大。

那么确定该杂质的结构类型，合理的控制其在成品中的含量即显得更为重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种引起雷替曲塞血液系统副作用的杂质，及其制备方法。

雷替曲塞主要由喹唑啉酮、噻吩和l-谷氨酸三部分组成，文献(quinazolineantifolatethymidylatesynthaseinhibitors：heterocyclicbenzoylringmodifications，j.med.chem.1991，34，1594-1605)和美国专利(us4992550，1991)中给出了雷替曲塞的合成中主要的两种方法，一种方法是以2-噻吩甲酸为起始原料，合成路线如下所示：

另一种方法是以5-硝基-2-噻吩甲酸为起始原料，合成路线如下所示：

但是，经过研究分析发现，不管是以上面所述的哪种制备方法进行制备，其最终成品中都会存在下述的噻吩类杂质，n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸，其结构如下：

该杂质是雷替曲塞制备工艺中产生的反应副产物，随着反应的进行最终传导至成品中。

本发明的目的在于提供上述结构的杂质及其制备方法，并合理的控制其含量。

一种雷替曲塞杂质cn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸的制备方法及其应用。

详细的合成方法如下：

具体而言包括如下步骤：

(1)5-硝基-2-噻吩甲酸经氯代反应制备得到5-硝基-2-噻吩甲酰氯；其中，氯代试剂选自：草酰氯、氯化亚砜、三氯氧磷、三氯化磷、五氯化磷等，优选氯化亚砜；

(2)5-硝基-2-噻吩甲酰氯低温下，在缚酸剂参与下与l-谷氨酸二乙酯缩合制备得到n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯；

其中，缚酸剂选自：碳酸氢钠、碳酸氢钾、二异丙基乙胺、乙二胺、三乙胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(dbu)等，优选二异丙基乙胺；

(3)n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯在还原剂作用下发生还原反应制备得到n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯；

其中，还原剂体系选自pd-c/h2，fe/feso4，fe/acoh，pd-c/甲酸铵，优选fe/feso4；

(4)n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯在极性非质子性溶剂中与甲基化试剂发生甲基化反应制备得到n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯；

其中，极性非质子性溶剂选自n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、n,n-二甲基乙酰胺(dma)、乙腈、丙酮、二甲基亚砜等，优选n,n-二甲基乙酰胺；甲基化试剂选自碘甲烷、硫酸二甲酯、重氮甲烷等，优选碘甲烷；

(5)n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯在无机碱水溶液作用下水解，以盐酸调节ph至3～4，蒸除溶剂，脱盐后得到杂质c纯品；

其中，无机碱选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾等，优选氢氧化钠。

本发明还提供一种雷替曲塞的药物组合物，所述雷替曲塞的含量不低于98％，优选不低于99％，更优选不低于99.8％。

进一步的，雷替曲塞杂质cn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸的含量不高于0.3％，优选不高于0.2％，更优选不高于0.1％。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1)公开了一种雷替曲塞的噻吩类杂质，并对其活性进行了研究，其毒性以及对造血系统的影响远远大于雷替曲塞；

2)公开了上述杂质的制备方法，本方法无高温、加压反应，通过本法可以得到质量稳定，收率较高的杂质c对照品，为雷替曲塞的质量标准的建立及临床用药安全性提供保障。

3)本发明通过深入研究发现，当将噻吩类杂质含量控制在0.2％及其以下时，可以有效的减少严重性血液系统副作用的发生。

附图说明

图1雷替曲塞杂质c的esi-ms谱图；

图2雷替曲塞杂质c的¹hnmr谱图；

图3雷替曲塞杂质c的hplc图谱。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是，本发明实施例仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

实施例1杂质c的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

将30g5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml氯化亚砜投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。

②n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将35.0gl-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5ml二异丙基乙胺投入250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2-噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/l盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯38.2g。

③n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将上步制备得到的38.2gn-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯、76.4g还原铁粉、30.6g硫酸亚铁、573ml甲醇、191ml纯化水投入1l的三颈瓶中，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，布氏漏斗垫76.4g硅藻土抽滤，以76.4ml甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物28.7g。

④n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯

将上述得到的28.7g淡黄色油状物以287mldma溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入25.8g碘甲烷，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相tlc检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5)分离共得到淡黄色油状物18.7g。

⑤杂质c的制备

将10gn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃氢氧化钠水溶液中(5gnaoh、80ml纯化水)，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以2mol/l的盐酸调节ph至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到类白色杂质c6.7g，纯度为99.41％(详见附图3)。esi-ms得[m-h]^—为299.1，确证本品分子量为300.1,¹hnmr：δ1.92(2h，tr)，δ2.25-2.28(2h，q)，δ2.94(6h，s)，δ4.20-4.22(1h，d)，δ5.88-5.89(1h，d)，δ7.50-7.51(1h，d)，δ7.77(1h，s)(详见附图1、2)。

实施例2杂质c的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

将30g5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml三氯氧磷投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。

②n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将35.0gl-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5ml乙二胺投入250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2-噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/l盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯37.2g。

③n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将上步制备得到的38.2gn-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯、0.20gpd/c、573ml甲醇、191ml纯化水投入1l的三颈瓶中以氢气球提供h2，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，抽滤，以76.4ml甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物32.7g。

④n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯

取上述得到的淡黄色油状物28.7g以287mldmf溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入11.2g硫酸二甲酯，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相tlc检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5)分离共得到淡黄色油状物17.9g。

⑤杂质c的制备

将10gn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃氢氧化钾水溶液中，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以2mol/l的盐酸调节ph至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到类白色杂质c6.5g，纯度为99.1％。

实施例3杂质c的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

将30g5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml三氯化磷投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。

②n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将35.0gl-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5mldbu投入250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2-噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/l盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯37.2g。

③n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将上步制备得到的38.2gn-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯、0.2gpd/c、16.8g甲酸铵、573ml甲醇、191ml纯化水投入1l的三颈瓶中，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，布氏漏斗垫76.4g硅藻土抽滤，以76.4ml甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物26.5g。

④n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯

将上述得到的26.5g淡黄色油状物以287ml乙腈溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入10.6g硫酸二甲酯，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相tlc检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5)分离共得到淡黄色油状物18.2g。

⑤杂质c的制备

将10gn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃碳酸钾水溶液中，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以2mol/l的盐酸调节ph至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到类白色杂质c6.0g，纯度为98.3％。

实施例4杂质c的制备

①5-硝基-2-噻吩甲酰氯的制备

将30g5-硝基-2-噻吩甲酸与50ml五氯化磷投入100ml的三颈瓶中，升温，控制内温75℃～80℃搅拌反应2h后，取反应液约1ml，加入2ml无水甲醇衍生化，以5-硝基-2-噻吩甲酸为对照，tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。将反应液转移至250ml单口瓶中，浓缩至干，加入30ml甲苯减压带干，得绿色针状结晶。

②n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将35.0gl-谷氨酸二乙酯、150ml二氯甲烷及12.5ml碳酸氢钠投入250ml三颈瓶中，降温，控制内温0℃～5℃缓慢滴加50ml的二氯甲烷/5-硝基-2-噻吩甲酰氯溶液，滴毕，保温0℃～5℃搅拌反应30min，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，将反应液依次用2mol/l盐酸100ml×2洗涤，饱和碳酸氢钠100ml×2洗涤，分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，滤液减压浓缩至干得n-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯35.2g。

③n-(5-氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯的制备

将上步制备得到的35.2gn-(5-硝基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯、76.4g还原铁粉、25ml乙酸、573ml甲醇、191ml纯化水投入1l的三颈瓶中，升温，控制内温60℃～65℃搅拌反应5h后取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5)至反应终点。反应毕，布氏漏斗垫76.4g硅藻土抽滤，以76.4ml甲醇洗涤滤饼，合并滤液减压浓缩至无液滴。旋蒸残留物以150ml×3二氯甲烷萃取，合并有机相，以5g无水硫酸钠干燥，抽滤，旋蒸至干得到棕色油状物42.4g。该油状物以150ml二氯甲烷分散，55g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:1.5～1:1)分离共得到淡黄色油状物26.7g。

④n-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯

将上述得到的26.7g淡黄色油状物以287ml乙腈溶解后加入到500ml的三颈瓶中，依次加入25.8g碘甲烷，6.6g吡啶后升温，控制内温50℃～55℃搅拌反应12h，取样1ml加入5ml纯化水淬灭后以1ml乙酸乙酯萃取，吸取有机相tlc检测乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应结束。反应毕，以二氯甲烷150ml×3萃取，合并有机相以饱和氯化钠溶液150ml×2洗涤后分取有机相，以5g无水硫酸钠干燥，浓缩，得到21.1g棕色油状物，该油状物以150ml二氯甲烷分散，45g硅胶(200～300目)拌样后进行柱层析(洗脱剂比例乙酸乙酯：正己烷＝1:2～1:1.5)分离共得到淡黄色油状物18.2g。

⑤杂质c的制备

将10gn-(5-二甲氨基-2-噻吩甲酰)-l-谷氨酸二乙酯以50ml无水乙醇分散后加入预先冷却至5℃～10℃碳酸锂水溶液中，控制内温5℃～10℃搅拌反应5h，取样约1ml进行tlc检测(乙酸乙酯：正己烷＝1:1)至反应终点。反应毕，以50ml×2乙酸乙酯洗涤水相，分取水相，以2mol/l的盐酸调节ph至3.5，将反应液减压浓缩至干进行脱盐操作(加入50ml×3乙腈洗涤旋蒸后的残留物，合并乙腈浓缩至干)，共得到类白色杂质c6.4g，纯度为98.9％。

实施例5杂质c的毒性研究

试验动物：sd大鼠100只，体重200g±20g；昆明种小白鼠100只，体重20g±2g。动物尾静脉注射给予雷替曲塞杂质c，给药剂量为：大鼠为1.0ml/100g(1mg/ml,用氯化钠溶液稀释至指定浓度)，小鼠为0.1ml/10g(1mg/ml，用氯化钠溶液稀释至指定浓度)，每天给药一次。给药后，连续观察2周。

观察指标：

(1)注射药物后，观察动物死亡时间及其死亡数量，并计算ld50值；

(2)给药后中毒症状和持续时间；

(3)死亡动物立行解剖检查；在观察结束时，对存活动物进行解剖检查。

表1雷替曲塞及其杂质c的ld50值

从上表数据可以看出，雷替曲塞的ld50在sd大鼠和小鼠中的值为杂质c的90倍和60倍，说明杂质c的毒性远大于雷替曲塞的毒性，由此推测，其副作用与其杂质有一定的相关性。

实施例6雷替曲塞杂质c对小鼠白细胞和粒细胞的影响

雌性昆明种小白鼠60只，体重20±2g，适应饲养后，随机分为溶剂对照组、雷替曲塞组、雷替曲塞杂质c组，共3组。

受试药物：纯度为99.8％的雷替曲塞(市售雷替曲塞原料药由南京正大天晴有限责任公司生产提供)，黄色结晶粉末，实施例1制备的雷替曲塞杂质c，类白色粉末。

给药方法：小鼠尾静脉注射给药，给药体积为0.1ml/10g，连续给药4周，给药前，受试药物经0.9％的氯化钠溶液溶解，并按照剂量要求稀释至所需浓度。

剂量设计：根据雷替曲塞的人用临床剂量为(3mg/m²/天)，相当于70kg的人每天0.075mg/kg，以此设定小鼠的给药剂量为0.029mg/g。

雷替曲塞杂质c的高剂量均为17mg/kg，中剂量为10mg/kg，低剂量为3mg/kg

对照组给予等体积的生理盐水。

观察指标

血象检测：尾静脉取血20ul，以日产血象检测仪检测。各组小鼠在给药前、给药期间每周、给药结束一周各检测一次。结果见表2和表3。

表2雷替曲塞杂质c对小鼠外周血白细胞的影响(单位10⁹/l)

*表示与对照组相比，p＜0.05

由表2可见，与对照组相比，雷替曲塞白细胞含量有所下降，但是雷替曲塞杂质c各剂量组动物的白细胞数下降都较大，与对照组相比呈现显著性差异。说明雷替曲塞杂质c可致小鼠外周血的白细胞数减少，而雷替曲塞本身对外周白细胞的影响较小，故合理控制杂质含量可以有效减少其严重血液系统副作用的发生。

表3雷替曲塞杂质c对小鼠粒细胞的影响

由表3可见，与对照组相比，雷替曲塞组的小鼠骨髓呈轻微被抑制状态，但是粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异；而雷替曲塞杂质c组小鼠的骨髓均呈严重被抑制状态，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦出现明显差异。说明雷替曲塞杂质c可对小鼠粒细胞的生成和分化产生严重影响。

综上，可以看出雷替曲塞杂质c对于小鼠血液系统的影响以及毒性均明显大于雷替曲塞，故合理控制其在最终成品中的含量，能有效减少与血液系统相关的严重副作用的发生，从而提升雷替曲塞在临床上应用的安全性。

实施例7雷替曲塞组合物对小鼠粒细胞的影响

雌性昆明种小白鼠80只，体重20±2克，适应饲养后，随机分为溶剂对照组、雷替曲塞组、雷替曲塞与雷替曲塞杂质c组，共8组。

受试药物：纯度为99.8％的雷替曲塞，黄色结晶粉末；雷替曲塞与雷替曲塞杂质c的重量比分别为1∶0.1、1∶0.2、1∶0.3、1∶0.4、1∶0.5和1∶0.6的组合物组(下称“组合物”)。

给药前，受试药物经注射用水溶解，并按剂量要求稀释至所需浓度。

给药方法：小鼠尾静脉注射给药，给药体积为0.1ml/10g体重，连续给药4周。

剂量设计：根据雷替曲塞的人用临床剂量为(3mg/m²/天)，相当于70kg的人每天0.075mg/kg，以此设定小鼠的给药剂量为0.029mg/天，对照组给予等体积的生理盐水。

观察指标

血象检测：尾静脉取血20μl，以日产血象检测仪检测。各组小鼠在给药前、给药期间每周、给药结束一周各检测一次。结果见表4。

表4雷替曲塞及其组合物对小鼠骨髓涂片细胞分类计数结果的影响

由表4可见，雷替曲塞组小鼠的骨髓均呈轻微被抑制状态，粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异；而组合物组表现不同，当组合物中雷替曲塞杂质c的含量≤0.20时，各组小鼠的骨髓均呈轻微抑制状态，粒细胞系统总的比例变化不大，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦未出现明显差异与雷替曲塞类似；当组合物中雷替曲塞杂质c的含量达到0.3％、0.4％、0.5％和0.6％，随着杂质c含量的增大，小鼠的骨髓均呈被抑制状态越发加剧，而且粒系各不同分化阶段的组成比例亦出现的差异逐渐增大，说明雷替曲塞组合物可以对粒细胞的生成和分化产生严重影响。因此，为了保证用药的安全性，雷替曲塞杂质c的含量不应高于0.20％。