一种与母猪产仔数性状相关的分子标记的筛查及应用的制作方法

本发明属于猪的分子标记的筛查与应用技术领域，具体涉及一种与母猪产仔数性状相关的分子标记及应用。本发明筛选的分子标记与猪esr1基因相关，本发明利用esr1基因编码区snp作为母猪产仔数性状相关的分子标记，包括esr1基因编码区序列突变位点的检测方法与应用。

背景技术：

中国养猪业蓬勃发展，猪的存栏量与出栏量多年稳居世界首位。相关数据表明，2015年我国猪肉产量已达5487万吨，年末生猪存栏45113万头，生猪出栏70825万头，占同期世界各国生猪出栏量第一位。但英国养猪协会bpex于2014年12月发布的interpig全球养猪报告数据表明，丹麦每头母猪提供断奶仔猪数(sowproductivityperyear,psy)为30头，荷兰的psy已达到28.87头，加拿大的psy也有22.95头，然而我国的psy只有14.5头左右，与其他国家还有很大差距。由此可见，我国是名副其实的养猪大国，但并非强国。而猪的产仔数是影响养猪经济效益的重要性状，是衡量母猪生产力的重要指标。因为只有选择产仔数高的母猪进行繁育，才可以在相同的饲养条件下，用较低的成本来获得更高的生产效益，提高其生产效率。因此增加母猪的产仔数对降低饲养成本乃至提高经济效益均具有重要意义。

猪的产仔数性状是由多个基因控制的，而esr1基因早在1991年就被发现其多态性与产仔数有关(rothschildetal.pvuiipolymorphismsattheporcineoestrogenreceptorlocus(esr).animalgenetics,1991,22:448-448)。esr1基因位于猪的1号染色体上，全长6kb，包括8个外显子和8个内含子。rothschild等以人的esr1基因约1.3kb的cdna为探针，分析猪的esr1基因pvuii多态性，发现了1条4.3kb(命名为a)和一条3.7kb(命名为b)的特异带。同时以带有50％梅山猪血缘两个合成系中161头母猪为实验材料，探究了esr1基因的多态性，发现b等位基因在梅山猪合成系中可以使第一胎产仔数增加20％，bb型母猪初产总产仔数和产活仔数均比aa型多1.2头，b等位基因为优势等位基因(rothschildetal.theestrogenreceptorlocusisassociatedwithamajorgeneinfluencinglittersizeinpigs.proceedingsofthenationalacademyofsciences,1996,93:201-205)。wangetal.(2006)和humpoliecketal.(2006)分别利用pcr-rflp方法发现esr1基因与经产母猪的总产仔数和产活仔数有显著关联(wangetal.effectsofesr1,fshbandrbp4genesonlittersizeinalargewhiteandalandraceherd.archivfurtierzucht,2006,49:64-70；humpoliecketal.influenceofesr1andfshbgenesonlittersizeinczechlargewhitesows.archivfurtierzucht,2006,49:152-157)。而且有研究发现该基因还可以影响公猪的精液品质(gunawanetal.associationstudyandexpressionanalysisofporcineesr1asacandidategeneforboarfertilityandspermquality.animalreproductionscience,2011,128:11-21)。申请人课题组在进行通城猪及欧洲猪的基因组序列分析时，发现esr1基因上存在另一个变异位点，即a>g突变位点(wangetal.genome‐wideanalysisrevealsartificialselectiononcoatcolourandreproductivetraitsinchinesedomesticpigs.molecularecologyresources,2015,15:414-424)。经比对分析，该变异位点发生在1号染色体的16779229位(g.16779229a>g，snpid：rs81237273)，即esr1基因第6外显子的第92位碱基处，为同义突变。该位点与pvuii位点高度连锁(gloriaetal.associationwithlittersizeofnewpolymorphismsonesr1andesr2genesinachinese-europeanpigline.geneticsselectionevolution.2007,39:195-206)，提示该位点也有可能参与调控母猪的繁殖性状。

因此，研究esr1基因上的该变异位点在群体中的多态性，并与母猪产仔数性状进行关联分析，为通过标记辅助选择提高母猪产仔数提供有用的分子标记。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，根据esr1基因已知序列，寻找esr1基因上该突变位点以及基因多态性的检测方法，为母猪产仔数性状检测提供有用的分子标记和关联分析方法。

本发明通过以下技术方案实现：

通过在“大白猪”群体中随机挑选个体，克隆esr1基因dna片段，进行混池测序以筛查snps。该snps的部分核苷酸序列如seqidno:1所示(该序列作为与母猪产仔数性状相关的分子标记，其核苷酸序列如下所示：

atggaaagcacctgccctaggtgatagacaggacatgcacggcaggcaggcgcctggagcccagtacctaccccctttcatcatgcccacttcgtagcacttgcgtagccggcaggcctgacagctcttcctcctgttcttatcaattgtgcactggttggtr(a/g)gctggacacatgtagtcattatgtcctatcaaaagcaagaggacagaattagtattatttcagcaaatttagccggtcagaatctgcagggaagctgtctggaggatgttttcctgtcacttactgggacctccctgtggttgctacctcagtccgccatccttcttctgcccttc，上述序列的163位碱基处的r是a或g，该突变导致pcr-alui-rflp多态性)，在该序列的第163位碱基处存在一个a/g碱基突变(该位点即是esr1基因第6个外显子的第92位碱基处，其未能引起所编码的氨基酸的改变)，但该突变导致alui-rflp酶切多态性。

申请人提供了一种克隆(筛查)esr1基因片段用以验证snps的引物组合(如seqidno:2和seqidno:3所示)，该引物组合的序列如下所示：

正向引物esr1_seq-f5'-atggaaagcacctgccctag-3'，

反向引物esr1_seq-r5'-gaagggcagaagaaggatgg-3'。

一种用于检测上述与母猪产仔数性状相关分子标记多态性的引物组合(如seqidno:4和seqidno:5所述)，其序列如下所示：

正向引物esr1_snp-f5'-gctcttcctcctgttcttatc-3'，

反向引物esr1_snp-r5'-ttgctgaaataatactaattctgtc-3'。

申请人提供了一种检测与母猪产仔数性状相关的分子标记的方法，所述的方法包括以下步骤：

从ensembl数据库中获取猪esr1基因的序列，设计引物，分别提取母猪的基因组dna，以基因组dna为模板设计引物(seqidno:2和seqidno:3)，随机挑选10头扩增esr1基因的dna片段，进行克隆和混池测序。分析测序结果显示，在esr1基因序列的第6外显子的第92位碱基存在一个等位基因突变(a/g)。根据seqidno:1基因序列，设计引物(见seqidno:4和seqidno:5)，进行pcr扩增，应用pcr-alui-rflp的方法检测该变异位点在群体中的多态性，对该突变位点与母猪产仔数性状之间进行关联分析。

本发明为猪的分子辅助选择提供了新的标记。

本发明的分子标记可在母猪产仔数性状辅助选择中应用。

附图说明

序列表seqidno:1是本发明检测上述与母猪产仔数性状相关分子标记多态性的dna序列。该序列也是本发明筛选的分子标记的序列。

序列表seqidno:2是筛查seqidno:1基因片段中碱基突变(a/g)的正向引物。

序列表seqidno:3是筛查seqidno:1基因片段中碱基突变(a/g)的反向引物。

序列表seqidno:4是本发明检测seqidno:1特异基因片段所用的正向引物，也是实施猪a/g变异pcr-alui-rflp基因型分型方法的正向引物。

序列表seqidno:5是本发明检测seqidno:1特异基因片段所用的反向引物，也是实施猪a/g变异pcr-alui-rflp基因型分型方法的反向引物。

图1：筛查猪esr1基因snps的测序峰图(箭头所指碱基为突变位点)。

图2：本发明中猪esr1基因用于检测上述与母猪产仔数性状相关分子标记多态性的dna片段，即本发明筛选得到的分子标记。

图3：是本发明中猪esr1基因的三种基因型电泳结果。附图标记说明：图3中的dna分子量的标准为dl2000。

具体实施方式

实施例1、esr1基因snps的筛选

1.1利用苯酚抽提法提取总dna

称少量大白猪(遗传资源来自于武汉华中农业大学试验猪场，为常规品种)猪耳组织块，置于2ml离心管中，用手术剪剪碎，加入1ml组织裂解液，10μl蛋白酶k，反复颠倒数次，于56℃水浴中过夜消化，使混合液呈透明状；加入等体积饱和酚，缓慢颠倒离心管10min，4℃12000r/min离心10min，转移上清(1ml左右)至另一离心管；然后再重复一次；用等体积苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为25：24：1)重复上述抽提步骤；用等体积氯仿/异戊醇(体积比为24：1)重复上述抽提步骤，将上清转移至2ml的ep管中；在上清中加1/10体积的3mnaac(≈100μl)及2.5体积的无水乙醇(≈2.5ml，-20℃预冷)，轻轻翻转至dna聚集成团，转移dna至新的离心管中；加入75％乙醇(-20℃预冷)，使dna沉淀悬浮于溶液10分钟，4℃12000r/min离心2min，离心后倒掉残留液体，再重复洗涤两次；4℃12000r/min离心2min，离心后倒掉后再短暂离心后吸出残留液体，将dna自然晾干后，加入100μlte溶解，检测和稀释分装完毕后于-20℃或-70℃长期保存，原液避免反复冻融(参见：sambrooketal.分子克隆实验指南，第三版.黄培堂等译；北京：科学出版社，2002：468-470)。

1.2引物设计

根据ensembl数据库中猪esr1基因(登陆号：np_999385esr1)的序列信息，设计一对引物(引物组合)，用来克隆猪esr1基因，该引物组合的序列如下所示：

正向引物es1r_seq-f5'-atggaaagcacctgccctag-3'，

反向引物es1r_seq-r5'-gaagggcagaagaaggatgg-3'。

1.3pcr扩增

pcr反应总体积为20μl，体系具体如下：50ng的基因组dna2μl，2×powertaqpcrmastermix10μl，步骤1.2的正向引物0.4μl，反向引物0.4μl。pcr扩增程序如下：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min40s，34个循环；最后72℃继续延伸5min。

1.4pcr产物的纯化

pcr产物的纯化：在紫外灯下从低熔点琼脂糖凝胶上切下含目的片段的凝胶，放入1.5ml离心管中，然后用pcr产物纯化试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司，按该试剂盒的说明书操作)纯化pcr产物，所得纯化pcr产物于-20℃下保存备用。

1.5pcr产物的序列测定

序列测定由武汉擎科创新生物科技有限公司完成。pcr产物序列测序峰图结果见图1。

实施例2esr1基因pcr-rflp检测方法的建立

2.1引物序列

设计了一个针对esr1基因片段的rs81237273位点的引物组合，检测该变异位点在群体中的多态性。该引物组合的具体序列如下所示：

正向引物esr1_snp-f5'-gctcttcctcctgttcttatc-3'，

反向引物esr1_snp-r5'-ttgctgaaataatactaattctgtc-3'。

2.2pcr扩增条件

pcr反应总体积10μl，其中猪基因组dna约50ng,含2xtaqpcrmix5ul(购自北京艾德莱生物科技有限公司)，用步骤2.1所述的正向引物0.2μl(浓度为10μm)，反向引物0.2μl，灭菌水：3.6μl。pcr扩增程序如下：95℃5min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；最后72℃继续延伸10min。pcr反应产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，得到特异扩增片段。

2.3pcr-rflp检测条件

pcr产物酶切反应体积是10μl,其中10xcutsmartbuffer1μl，pcr产物5μl,限制性内切酶为0.1μl(1u),用灭菌的双蒸水定容至10μl,将样品混匀后离心，37℃孵育12h,用2.5％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，在凝胶成像系统中拍照并记录基因型。基因型的带型分别为：aa(65bp+41bp)，ag(65bp+41bp+106bp)，gg(106bp)，分型结果如图3所示。

2.4本发明的分子标记在与母猪产仔数性状关联分析中的应用

试验共检测了福建一春猪场的566头大白母猪的esr1基因g.16779229a>g多态性位点，其中544头具有表型记录。申请人利用sas软件对该544头母猪的esr1基因g.16779229a>g多态性位点与产仔数(包括总产仔数和产活仔数)进行关联分析。建立如下所述的固定效应模型：

初产：yi＝u+si+ysi+gi+εi

经产：yi＝u+si+pi+ysi+gi+εi

其中，yi为性状观察值，si为父系效应，ysi为年度-季节效应，pi为胎次效应，gi为基因型效应，εi为随机误差，假定服从n(0,σ²)分布。

表1esr1基因的g.16779229a>g位点在群体中基因型频率和等位基因频率分布

表2esr1基因g.16779229a>g位点与猪产仔数关联分析结果

表2的说明：同一列中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。

*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001

等位基因g与等位基因a在群体中的分布情况见表1，基因型检测结果表明在566个个体中，aa基因型有105个个体，占18.55％；ag基因型有284个个体，占50.18％；gg基因型有177个个体，占31.27％；。esr1基因多态位点与性状关联分析的结果是：esr1基因在g.16779229a>g多态位点与经产母猪的总产仔数和产活仔数显著关联，且具有显著的加性遗传效应(见表2)。其中gg基因型母猪的每窝总产仔数和产活仔数分别比aa和ag基因型个体多1.04头、0.9头和0.92头、0.76头(p<0.05)。由表1和表2可以看出在大白母猪群体中，gg基因型为优势基因型，g等位基因为优势等位基因。

sequencelisting

<110>华中农业大学

<120>一种与母猪产仔数性状相关的分子标记的筛查及应用

<130>

<141>2017-07-19

<160>5

<170>patentinversion3.1

<210>1

<211>339

<212>dna

<213>猪（susscrofa）

<220>

<221>gene

<222>(1)..(339)

<223>

<220>

<221>mutation

<222>(163)..(163)

<223>

<400>1

atggaaagcacctgccctaggtgatagacaggacatgcacggcaggcaggcgcctggagc60

ccagtacctaccccctttcatcatgcccacttcgtagcacttgcgtagccggcaggcctg120

acagctcttcctcctgttcttatcaattgtgcactggttggtggctggacacatgtagtc180

attatgtcctatcaaaagcaagaggacagaattagtattatttcagcaaatttagccggt240

cagaatctgcagggaagctgtctggaggatgttttcctgtcacttactgggacctccctg300

tggttgctacctcagtccgccatccttcttctgcccttc339

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>2

atggaaagcacctgccctag20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(20)

<223>

<400>3

gaagggcagaagaaggatgg20

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(21)

<223>

<400>4

gctcttcctcctgttcttatc21

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>primer_bind

<222>(1)..(25)

<223>

<400>5

ttgctgaaataatactaattctgtc25