本专利涉及一种临床检验用途的基因检测方法，采用探针法实时荧光pcr技术，能够对人类急性早幼粒白血病中tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因的表达进行检测，可有效的节约检测时间，提高检测精度。
背景技术：
急性早幼粒细胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是急性髓系白血病(acutemyeloidleukemia，aml)的一个特殊亚型，约占aml的17％-25.3％。apl患者主要为青壮年，发病率明显与年龄相关，病情凶险，进展迅速，由于弥漫性血管内凝血和纤溶亢进，临床常有严重出血，早期死亡率高。apl是白血病中对诱导分化治疗反应较好的一种类型，这与apl细胞中表达维a酸受体(rarα)融合蛋白诱导的染色质改变有关。目前已报道的apl相关的染色体易位均累及17号染色体上的rarα基因，其中90％以上的apl患者存在t(15；17)(q22；q21)易位，形成pml-rara融合基因，因此检测pml-rara融合基因是诊断apl的最特异、敏感的方法之一，也是apl治疗方案选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标。其他几种染色体易位类型，包括变异型t(11；17)(q23；q21)使11号染色体上的早幼粒细胞白血病锌指基因(plzf)与rarα基因融合，形成plzf-rara融合基因；变异型t(5；17)(q35；q21)，形成npm-rara融合基因；t(11；17)(q13；q21)，形成mma-rarα融合基因；t(3；17)(q26；q21)变异易位，形成tblr1-rarα融合基因；rara与信号转导与转录激活因子5b(signaltransducerandactivatoroftranscription5b，stat5b)易位融合形成形成stat5b-rarα融合基因。rarα与蛋白激酶a调节亚基1型a(proteinkinasearegulatorysubunittype1a，prkar1a)易位融合产生der(17)染色体，形成prkar1a-rarα融合基因等。
与其他的rarα融合基因一样，prkar1a的两种剪接体都可与rarα3号外显子融合。prkar1a-rarα融合基因长型剪接体由prkarla5’端2个外显子及3号外显子前100个碱基与rarα融合而成，形成符合读码框架的融合基因，编码含有495个氨基酸残基的ria-rarα融合蛋白。ria-rarα融合蛋白包含ria蛋白二聚化区域以及rarα的dbd和lbd(b-f区)。prkar1a-rarα融合基因短型剪接体包括prkar1a5’端2个外显子，形成不符合读码框架的融合基因，可能编码一个c端截短的ria融合蛋白。tblr1-rarα融合基因符合rarα融合基因的特点，累及rarα基因并且包含rarα基因3号外显子及其3’序列，所编码的融合蛋白含有tblrl的lish结构域和rarα的b-f区。tblr1-rarα融合蛋白以弥散的形式定位于细胞核和细胞浆内，与其他rarα融合蛋白一样，tblr1-rarα融合蛋白可以形成同源二聚体，募集转录抑制复合物对rarα靶基因进行转录抑制。
虽然这两种融合基因的发生率远小于pml-rarα融合基因，仅在不到2％的apl患者中可以检测到，但是检测这些融合基因对apl的正确诊断及治疗方案制定具有重要的意义。
tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因检测的常用技术有荧光原位杂交技术(fish)、rq-pcr等方法。fish检测结果较为直观，但是试验过程繁琐，涉及试剂种类繁多，费时费力，且结果需经验丰富的专业人士来判读，结果判读存在较大的主观性。rq-pcr采用taqman探针荧光定量技术，综合生物学、酶学和荧光化学于一体，从扩增到结果分析均在pcr反应管封闭状态下进行，解决了pcr产物污染而导致假阳性的问题，同时也提高了敏感度，其结果用拷贝数表示，实现了对pcr产物的准确定量，易于统一标准，与定性pcr技术相比，具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染，有较大的线性范围等优点，能够满足tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因的检测，被认为是目前首选检测方法，用于评价治疗效果、预测预后。实时荧光定量pcr中常见的方法有sybrgreeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。其中sybrgreeni由于是非饱和染料，特异性不如双探针杂交法以及taqman法，必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光pcr技术结合taqman探针法应用于tblr1-rarα和prkar1a-rarα的基因检测。
技术实现要素：
本发明设计了检测内参/目的基因用引物、探针序列，用实时荧光pcr技术检测tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因。通过调整引物、探针浓度及比例，优化pcr的反应体系和反应条件，使扩增效率和速率均达到最佳。
在引物设计中，充分考虑了tblr1-rarα融合基因和prkar1a-rarα融合基因的基因特点，创造性的设计出以下引物和探针。
tblr1-rarα融合基因由于(3；17)(q26；q21)易位形成的。tblr1基因的第5外显子与rarα基因的第3外显子融合，与其他类型的融合基因一样，可竞争性结合rxr，从而干扰rarα的信号转导。因此扩增tblr1-rarα融合基因的上游引物(f)从tblr1基因的第5外显子上选择，下游引物(r)从rarα基因的第3外显子选择，探针位于rarα基因的第3外显子，如此设计引物在保证扩增产物特异性的同时，可与prkar1a-rarα融合基因共用下游引物和探针，节省成本。此外扩增产物只有148bp，可保证较高的扩增效率。扩增tblr1-rarα的引物和探针，分别为：
tblr1-rarα-f:ggaggagaatggagcacatact
tblr1-rarα-r:gtggtagcctgaggacttgt
tblr1-rarα-probe:
fam-agacccagagcagcagttctgaagaga-tamra
prkar1a-rarα融合基因的第2外显子和第3外显子均可能与rarα基因的第3外显子融合，因此扩增tblr1-rarα融合基因的上游引物(f)分别从第2外显子和第3外显子设计，形成了prkar1a-rarα-f(ex2)和prkar1a-rarα-f(ex3)；下游引物(r)及探针与tblr1-rarα融合基因的下游引物及探针通用，均选自rarα基因的第3外显子，在保证检测特异性的同时，最大限度降低了检测成本。两个检测产物均在200bp以内，可保证扩增的高效性。
prkar1a-rarα的引物和探针，分别为：
prkar1a-rarα-f(ex2):ggaatactttgagaggttggagaa
prkar1a-rarα-f(ex3):cacccaacccagtggttaaag
prkar1a-rarα-r：gtggtagcctgaggacttgt
prkar1a-rarα-probe:
fam-agacccagagcagcagttctgaagaga-tamra。
用于制定apl个体化治疗方案的检测试剂盒，包括红细胞裂解液、trizol、
氯仿、异丙醇、无水乙醇等试剂以及qiagenrneasyffpekit逆转录试剂
盒、检测体系pcr反应液、阳性对照品和阴性对照品。
检测体系pcr反应液包括thunderbirdqpcrmix(toyobo,qps-101)、检测目的基因用上下游引物tblr1-rarα-f，tblr1-rarα-r，探针为tblr1-rarα-probe；prkar1a-rarα-f；prkar1a-rarα-r；prkar1a-rarα-probe；检测内参基因abl用引物为abl-f，abl-r，探针为abl-probe。引物及探针碱基序列如下：
进一步地，所述阳性对照品为含有tblr1-rarα和prkar1a-rarα基因的溶液；所述阴性对照品为无tblr1-rarα和prkar1a-rarα基因的溶液。
本发明还提供了一种检测tblr1-rarα融合基因和prkar1a-rarα融合基因相对表达量的试剂盒，包括：
(i)全血基因组rna抽提试剂及逆转录试剂；
(ii)荧光定量pcr扩增反应试剂；
所述荧光定量pcr反应试剂的引物和探针，包括：
扩增tblr1-rarα融合基因的引物和探针，分别为：
tblr1-rarα-f:ggaggagaatggagcacatact
tblr1-rarα-r:gtggtagcctgaggacttgt
tblr1-rarα-probe:
fam-agacccagagcagcagttctgaagaga-tamra；
扩增prkar1a-rarα融合基因的引物和探针，分别为：
prkar1a-rarα-f(ex2):ggaatactttgagaggttggagaa
prkar1a-rarα-f(ex3):cacccaacccagtggttaaag
prkar1a-rarα-r：gtggtagcctgaggacttgt
prkar1a-rarα-probe:
fam-agacccagagcagcagttctgaagaga-tamra。
并且所述荧光定量pcr反应试剂还可包括扩增abl内参基因的引物和探针，分别为：
abl-f:gatacgaagggagggtgtacca
abl-r:ctcggccagggtgttgaa
abl-probe:fam-tgcttctgatggcaagctctacgtctcct-tamra。
本发明的有益效果：本发明将实时荧光pcr技术结合采用tapman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建内参基因abl和tblr1-rarα、prkar1a-rarα目的基因的定量标准曲线，检测受测者体内tblr1-rarα和prkar1a-rarα的表达水平。相比于以往的fish和△△ct法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性粒细胞白血病患者体内tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因的检测，对于调整治疗方案、评价治疗效果、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。
附图说明
图1是使用本发明所述核酸检测试剂盒检测临床样品的结果图，其中(a)tblr1-rarα1号样本扩增曲线图；(b)prkar1a-rarα(ex1)1号样本扩增曲线图；(c)prkar1a-rarα(ex2)1号样本扩增曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
本发明用于辅助临床上急性粒细胞白血病的诊断及个体化治疗方案制定的方法。主要包括以下试剂：红细胞裂解液、trizol、氯仿、无水乙醇、revertraaceqpcrrtkit(toyobo公司)。
检测体系pcr反应液：revertraaceqpcrrtkit(toyobo公司)；thunderbirdprobeqpcrmix(2×)、abl内参基因及tblr1-rarα、prkar1a-rarα目的基因的引物和探针均为10μm；
其中检测内参基因abl和目的基因tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因的引物和探针，分别为：
阳性对照品：含tblr1-rarα或prkar1a-rarα基因组的溶液；
阴性对照品：不含tblr1-rarα和prkar1a-rarα基因组的溶液。
实施例2
本发明方法的操作流程：
(1)抽提血液中的总rna：在洁净的1.5ml的离心管中加入1ml红细胞裂解液，取抗凝血0.5ml混匀。室温静置10min；1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；再次加入0.5ml红细胞裂解液，1500rpm离心5min，弃上清，收集底部的细胞；向细胞中加入1mltrizol，反复吹打直至沉淀完全溶解，室温静止5min；加入0.2ml氯仿，震荡均匀；14000rpm4℃离心10min，吸取上清层转移至另一新的离心管中；加入等体积的异丙醇，上下充分混匀，室温静置10min；14000rpm4℃离心10min，弃上清，加入75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤管壁；14000rpm4℃离心5min，弃乙醇；室温干燥10-15min，加入20ulrnase-free水溶解沉淀，测定rna浓度，-80℃保存备用。
(2)参考toyobo公司的revertraaceqpcrrtkit试剂盒说明书，将rna反转为cdna。
(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份23μl分装：
x＝23μl反应液×(8份内参(标准曲线)+8份目的基因(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)；
(4)加样：加入检测体系pcr反应液中2μlcdna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μl生理盐水或不加任何物质。
(5)检测：检测在实时荧光pcr仪上进行，可用仪器包括abi7300，7500(美国appliedbiosystems公司)等。反应条件：95℃预变性1min；95℃15s，58℃35sec40个循环，荧光信号于58℃35sec时采集。
(6)结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。
1)内参阳性时，检测结果才认为有效；
2)阳性判断标准：ct<36，为阳性；35≤ct≤38，为疑似阳性，需要再次验证；ct＞38，为阴性。
实施例3
采用本发明核酸检测方法检测健康体检人群标本，取待检的健康体检样品12例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性，阴性，空白对照,内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测12份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。12例筛查样本中所有样本的abl均起线，但tblr1-rarα、prkar1a-rarα未有标本出现起线。结果如表1所示
表112例健康体检样本tblr1-rarα、prkar1a-rarαmrna表达水平
实施例4
采用本发明核酸检测方法检测临床标本，取待检的临床样品12例，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。
每份样品加入检测体系pcr反应液中2μl。同时做阳性参考品、阴性对照、内参基因/目的基因的标准曲线各一份。一台96孔的荧光pcr仪可同时检测12份样品，每个样本2次重复，一份阳性对照，一份阴性对照，检测时间仅为100分钟。12例筛查样本中所有样本的abl均起线，但tblr1-rarα、prkar1a-rarα未有标本出现起线。实验结果如下表2所示：
表212例临床样本tblr1-rarα、prkar1a-rarαmrna表达水平
序列表
<110>杭州艾迪康医学检验中心有限公司
<120>检测tblr1-rarα和prkar1a-rarα融合基因相对表达量引物探针方法
<160>10
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
ggaggagaatggagcacatact22
<210>2
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