本发明属于医学检验领域，涉及一种mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用。
背景技术：
2016年新版who肾脏肿瘤病理组织学分类新增了一种肾细胞癌类型：mit家族易位性肾细胞癌。mit家族是小眼畸形转录因子家族(microphthalmia-associatedtranscriptionfactorfamily)的缩写，该家族成员包括mitf，tfe3、tfeb和tfec基因。
目前已经发现的mit家族易位性肾细胞癌包括xp11.2易位/tfe3基因融合相关性肾细胞癌和t(6；11)(p21；q12)易位/tfeb基因融合相关性肾癌。mitf和tfec基因易位的肿瘤在世界范围内暂无文献报道。
mit家族易位性肾细胞癌致病机理清晰明确，mit家族成员基因(tfe3/tfeb)的易位是其关键致病因素：这类肿瘤均涉及mit家族成员基因同其它染色体易位及其所致形成融合基因，通过启动子变换从而高表达tfe3/tfeb融合蛋白，而tfe3/tfeb作为一个转录因子，通过与特异的dna结构相结合，转录调控体内多种基因表达最终致病。目前至少有10种不同的易位伴侣和融合基因被报道，包括aspl-tfe3、prcc-tfe3、sfpq-tfe3、nono-tfe3、cltc-tfe3、luc7l3-tfe3、khsrp-tfe3、parp14-tfe3、dvl2-tfe3、rbm10-tfe3和malat1-tfeb等，每例肿瘤内仅存在单一的易位形式。
mit家族易位性肾细胞癌是一罕见类型肿瘤，tfe3基因易位性肾癌约占所有肾细胞癌的1.6％-4％，tfeb基因易位性肾癌相对更加罕见。但该疾病以发病年龄轻为突出特征，占儿童肾细胞癌的40％，且造成极其沉重的家庭及社会负担。此外，有明确证据表明mit家族易位性肾细胞癌的患者对血管内皮生长因子受体(vascularendothelialgrowthfactorreceptor，vegfr)或哺乳动物雷帕霉素(mammaliantargetofrapamycin，mtor)分子靶向治疗敏感。另有研究表明，met酪氨酸激酶为aspl-tfe3融合基因的靶基因，并有望成为tfe3易位性肿瘤的治疗靶点。因此，精确诊断此类肿瘤显得十分重要。
本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合mit家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出prcc-mitf融合基因，该融合基因型为首次发现，国内外均无报道，且这是国际首次发现mitf基因易位相关性肾细胞癌。
目前高通量测序是唯一可以明确未知易位位点的检测手段，然而高通量测序费用高昂，检测周期长，检测平台稀缺，对样品质量要求高，不利于普及推广，对于大多数患者来说也不是首选检测手段。依赖以往经验，针对已知的融合位点设计特异性的pcr引物组合，对肿瘤组织中提取出的rna逆转录之后进行pcr扩增并测序，检测融合基因具体易位位点，是最准确、便捷、经济的方法。因此，发现新的致病融合位点，进而设计pcr引物将有利于mit家族易位性肾细胞癌检测准确度的进一步提高。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因。
本发明的另一目的是提供该新融合基因的检测引物。
本发明的又一目的是提供引物的应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种prcc-mitf融合基因，由prcc外显子5和mitf外显子4融合形成。mitf、prcc基因序列来自genebank，序列版本号grch38.p7,prcctranscript_id＝"xm_005245313.1",mitftranscript_id＝"nm_198159.2""。
所述的mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因优选包含seqidno.3所示的核苷酸序列。
本发明所述的mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因在制备prcc-mitf易位性肿瘤诊断试剂中的应用。
一种检测prcc-mitf易位性肿瘤的pcr引物，为检测本发明所述的prcc-mitf基因易位的pcr引物。所有能够检测本发明所述prcc-mitf基因易位的引物对均在本发明的保护范围内。
针对本发明找到的新的融合基因，我们在prcc的5号外显子和mitf的4号外显子内分别设计引物。遵循引物设计原则，引物最好在模板cdna的保守区内设计，引物长度在15bp-30bp之间，引物gc含量在40％～60％之间，退火温度最好接近72℃，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增条带单一特异。由于工作中经常需要在石蜡固定标本中开展工作，石蜡标本rna碎裂严重，因此扩增产物不宜过长，需要控制在300bp以下。
经过多次调试和验证，最终设计的引物序列为：prcc-e5-f：tacagtggtggctactatcct(seqidno.1)；mitf-e4-r:cgctcgtgaatgtgtgtt(seqidno.2)，理论扩增产物长162bp，扩增产物(融合基因)的全部序列如下：tacagtggtggctactatcctgcacaggacccggccctggtccccccccaggaaattgccccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggattttataagtttgaagagcaaaacagggcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcacgagcg(seqidno.3)。经实验验证，该引物可成功扩增出目的条带，条带单一、特异。
本发明所述的pcr引物在制备prcc-mitf易位性肿瘤诊断试剂中的应用。
一种prcc-mitf易位性肿瘤诊断试剂盒，包括本发明所述的pcr引物。
有益效果：
本发明针对高通量测序发现的新融合基因设计了特异性的pcr引物，扩大了原有检测手段的检测范围，应用于临床，可提高诊断mit家族易位性肾细胞癌的检出率和准确率。为诊断分型及分子靶向治疗提供依据。根据我们的实验结果，该引物组合诊断的特异性和敏感性均达到了100％，且操作对象只需要在石蜡包埋组织切片上进行，时间仅为三个工作日。采用本发明提供的探针组合进行检测prcc-mitf易位性肿瘤，不但方便、快速、可靠而且检出率高，可用于制备prcc-mitf易位性肿瘤诊断试剂盒，为prcc-mitf易位性肿瘤的快速准确的诊断提供了新的工具。
附图说明
图1：在已知prcc-mitf融合型肿瘤中应用本发明引物组合进行验证，成功检出的prcc-mitf融合基因测序图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1针对明确诊断的病例进行验证：
本发明团队通过高通量测序技术，在一例形态学符合mit家族易位性肾细胞癌特征的病例中检测出prcc-mitf融合基因,发现该基因由prcc外显子5和mitf外显子4融合形成。对于这例高通量测序rna-seq检测出prccexon5-mitfexon4新融合基因的病例，使用我们设计的引物进行验证。
一、rna的提取：
严格按照rneasyffpekit操作说明进行提取。①脱蜡：将收集好的玻片进行二甲苯脱蜡，再用无水乙醇漂洗，风干后用手术刀片刮下来装入1.5mlep管中；②酶解：加入150μl消化液,再加入10μl蛋白酶k，混匀，56℃酶解15min,80℃15min，冰上冷却；③加入16μldndna酶缓冲液,再加入10μldnasei,混匀，室温静置15mimin,12000rpm离心15min，取上清；④加入320μl结合液液再加入720μl无水乙醇，混匀，分2次转移至吸附柱中，8000rpm离心1min，，弃废液；⑤洗涤：加入500μl洗涤液,8000rpm离心1min；重复洗涤一次，弃废液，将吸附柱转移到一个新的2ml收集管中，12000rpm离心5min；⑥洗脱：将吸附柱转移到1.5ml的ep管中，加入100μl的洗脱液，室温静置1min,12000rpm离心1min，将收集好的洗脱液(即dna提取液)进行浓度和纯度测定，-80℃保存存待用。
二、逆转录pcrrt-pcr
采用试剂盒(k1622，revertaidfirststrandcdnasynthesiskit，mbi)对rna进行逆转录，方法详见试剂盒说明。pcr扩增引物为本专利prcc-mitf融合基因引物组合。反应体系包括：0.125μltakaraextaqtmhs液，2.5μl10×taqbuffer(mg2+plus)，2μldntp(均购自日本takara公司)，引物浓度为20μmol/l，cdna模版为100ng，无菌去离子水加至25μl。pcr扩增条件为94℃变性3min后，94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35次循环，最后72℃延伸5min。pcr产物用3％琼脂糖，电压100v，电泳，溴化乙啶染色后于紫外光下观察结果，并送测序。
结果：使用本发明引物pcr后可见单一特异的电泳条带，对扩增产物进行测序，得到prccexon5-mitfexon4融合基因序列(图1)，证明本项目设计的引物组合可靠且敏感。
实施例2针对对照组病例进行检测
我们对30例诊断明确的对照组病例(包括10例透明细胞性肾细胞癌，5例乳头状肾细胞癌，5例嫌色细胞性肾细胞癌，5例tfe3易位相关性肾细胞癌和5例tfeb易位相关性肾癌，理论上均不存在mitf基因易位)使用本发明的引物组合进行检测，rna提取、逆转录pcr和测序方法同上。
结果：使用本发明设计引物组合检测，未检测出prcc-mitf融合基因，证明本项目设计的引物特异性高。
评价：本发明引物组合是对原有mit家族易位性肾细胞癌融合基因引物的补充，扩展了mit家族易位性肾细胞癌融合基因的类型，增加了rt-pcr方法诊断该肿瘤的检出率。
<110>中国人民解放军南京军区南京总医院
<120>一种mit家族易位性肾细胞癌的新融合基因及其检测引物和应用
<160>3
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物prcc-e5-f
<400>1
tacagtggtggctactatcct21
<210>2
<211>18
<212>dna
<213>人工序列
<220>
<223>引物mitf-e4-r
<400>2
cgctcgtgaatgtgtgtt18
<210>3
<211>162
<212>dna
<213>人类
<220>
<223>prcc-mitf融合基因片段
<400>3
tacagtggtggctactatcctgcacaggacccggccctggtccccccccaggaaattgcc60
ccagatgcctccttcatcgatgacgaagcaggattttataagtttgaagagcaaaacagg120
gcagagagcgagtgcccaggcatgaacacacattcacgagcg162