利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法与流程

本发明涉及一种利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法。

背景技术：

紫色杆菌素(violacein)和脱氧紫色杆菌素(deoxyviolacein)是革兰氏阴性菌生成的具有多种生理活性的吲哚衍生物，具有抗肿瘤、抗致病微生物、抗病毒、抗寄生虫等活性。目前文献报道的能够产紫色杆菌素的天然微生物有chromobacteriumviolaceum、janthinobacteriumlividum、duganellasp.b2、alteromonasluteoviolacea、duganellaviolaceinigrastr.ni28等，其中研究相对较多的是chromobacteriumviolaceum、duganellasp.b2。

紫色杆菌素是由两分子的l-trp经过vioa-viob-vioe-viod-vioc催化生成的吲哚衍生物，同时也可以不经过基因viod的催化生成脱氧紫色杆菌素；对菌株的基因组信息测序结果显示，相关功能的结构基因vioa，viob，vioc，viod，vioe位于基因组上的同一个转录单位，并且按照顺序vioabcde，这点与紫色杆菌素的酶促反应顺序并不相同。

紫色杆菌素的生产，早期经历了对天然菌株的发酵生产，包括对chromobacteriumviolaceum，janthinobacteriumlividum和duganellasp.b2发酵条件的优化生产，但是由于天然生产菌株一般具有一定的致病性，同时紫色杆菌素作为其次级代谢产物引起的低生产效率，这些因素都不适合工业生产紫色杆菌素。近年来，随着代谢工程和合成生物学的发展，让异源高效生产紫色杆菌素成为了可能。但是，对微生物的遗传改造的周期长、劳动强度大往往需要大量的人力和物力，迫切需要一种菌株既能够提供充足的l-色氨酸前体又能够满足生产药物达到的安全级别。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法。

本发明首先提供了一种与紫色杆菌素生物合成相关的特异dna分子；所述特异dna分子包括五个紫色杆菌素生物合成途径功能基因和五个ptrc启动子；所述五个紫色杆菌素生物合成途径功能基因为vioa基因、viob基因、vioc基因、viod基因和vioe基因；每个紫色杆菌素生物合成途径功能基因由一个ptrc启动子调控表达。

所述五个紫色杆菌素生物合成途径功能基因来源于chromobacteriumviolaceum紫色杆菌素。

所述vioa基因如序列表的序列4自5’端第6680-7945位核苷酸所示。

所述viob基因如序列表的序列4自5’端第8271-11270位核苷酸所示。

所述vioc基因如序列表的序列4自5’端第11596-12885位核苷酸所示。

所述viod基因如序列表的序列4自5’端第13211-14332位核苷酸所示。

所述vioe基因如序列表的序列4自5’端第14658-15233位核苷酸所示。

所述ptrc启动子如序列表的序列4自5’端第6586-6679位核苷酸所示。

所述特异dna分子如序列表的序列4自5’端第6586-15233位核苷酸所示。

本发明还保护含有所述的特异dna分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

所述重组表达载体具体可为序列表的序列4所示的环状质粒。

本发明还保护一种重组菌，是将所述特异dna分子或所述重组表达载体导入谷氨酸棒状杆菌中得到的。

所述谷氨酸棒状杆菌是atcc编号为21850的谷氨酸棒状杆菌。

本发明还保护所述重组菌在生产紫色杆菌素中的应用。

本发明还保护一种生产紫色杆菌素的方法(方法甲)，包括如下步骤：培养所述重组菌，得到紫色杆菌素。

本发明还保护一种生产紫色杆菌素的方法(方法乙)，包括如下步骤：采用发酵培养基培养所述重组菌，得到紫色杆菌素。

所述方法乙具体包括如下步骤：采用发酵培养基培养所述重组菌，得到发酵液；从发酵液中提取得到紫色杆菌素。

所述紫色杆菌素的提取步骤如下：

(1)取发酵液离心后收集沉淀；

(2)采用无水乙醇将步骤(1)的沉淀重悬，超声震荡后离心，收集上清；

(3)将步骤(2)得到的上清离心，收集上清；

(4)将步骤(3)得到的上清进行真空旋转蒸发；

(5)完成步骤(4)后，清洗旋转容器内壁，将悬浮液超声振荡后过滤，将截留下来的物质真空冷冻干燥，得到所述紫色杆菌素。

所述步骤(1)中，所述离心的条件为16200×g离心10min。

所述步骤(1)中，还包括将沉淀洗涤数次(具体可为两次)后收集沉淀。

所述步骤(2)中，所述超声震荡的条件为250w，30min。所述离心的条件为16200×g离心10min。

为了提取充分，还可以重复步骤(2)数次(具体可为两次)后将上清液合并。

所述步骤(3)中，所述离心条件为8000×g、4℃离心30min。

所述步骤(4)中，所述真空旋转蒸发的蒸发温度为60℃。

所述步骤(5)中，采用双蒸水清洗内壁。所述超声震荡的条件为250w，10min。所述过滤采用0.22μm水系膜进行。

所述方法乙中，所述发酵液的制备方法具体可为：将od600nm＝30的所述重组菌菌液接种至发酵培养基中，30℃、200r/min培养18h，然后向培养体系中加入终浓度为0.5mm的iptg，继续20℃、200r/min发酵72h，得到发酵液。

所述重组菌种子液菌液与所述发酵培养的的体积比为1：25。

所述方法乙中，所述发酵液的制备方法具体可为：将所述重组菌种子液接种至发酵培养基中，30℃、200r/min培养18h，然后向培养体系中加入终浓度为0.5mm的iptg，继续20℃、200r/min发酵72h，得到发酵液。

所述重组菌种子液的od600nm＝30。

所述重组菌种子液与所述发酵培养的的体积比为1：25。

所述重组菌种子液的制备方法具体可为：将重组菌菌悬液接种至种子培养基中，30℃、200r/min培养，得到重组菌种子液。

所述重组菌菌悬液的od600nm＝5。

所述种子培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在种子培养基中的浓度为：一水合葡萄糖50g/l，酵母浸粉10g/l，玉米浆干粉30g/l，硫酸铵4g/l，七水硫酸镁0.25g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾1g/l，七水硫酸亚铁10mg/l，硫酸锰10mg/l；所述溶剂为水。

所述种子培养基的ph为7.2。

所述重组菌菌悬液与所述发酵培养的的体积比为1：25。

所述重组菌菌悬液的制备方法具体可为：将所述重组菌接种至含有25μg/ml硫酸卡那霉素的bhis固体培养基上，30℃静置培养，挑取单克隆接种到6mlbhis液体培养基中，30℃、200r/min培养48h，得到所述重组菌菌悬液。

本发明还保护用于生产紫色杆菌素的试剂盒，包括所述发酵培养基。

所述试剂盒还包括所述重组菌。

以上所述发酵培养基由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在发酵培养基中的浓度为：一水合葡萄糖55-65g/l，玉米浆干粉45-55g/l，硫酸铵8-12g/l，七水硫酸镁0.4-0.6g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，磷酸氢二钾0.5-1.5g/l，七水硫酸亚铁8-12mg/l，硫酸锰8-12mg/l，苯丙氨酸25-35mg/l，酪氨酸25-35mg/l，碳酸钙8-12g/l；所述溶剂为水。

所述溶质及其在发酵培养基中的浓度具体可为：一水合葡萄糖60g/l，玉米浆干粉50g/l，硫酸铵10g/l，七水硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，磷酸氢二钾1g/l，七水硫酸亚铁10mg/l，硫酸锰10mg/l，苯丙氨酸30mg/l，酪氨酸30mg/l，碳酸钙10g/l。

所述发酵培养基的ph为7.2。

本发明首次选用一株已经商业化的产l-色氨酸的谷氨酸棒状杆菌作为异源生产紫色杆菌素的底盘细胞，与天然的紫色杆菌素生产菌株相比，具有更高的安全性，更加成熟的分子操作工具和发酵技术；与大肠杆菌相比，谷氨酸棒状杆菌作为gras菌株，更适合生产具有药用价值的化学品。本发明分别向谷氨酸棒状杆菌中引入了来源于chromobacteriumviolaceum和janthinobacteriumlividum紫色杆菌素生物合成途径功能基因，通过基因表达优化以及发酵条件优化最终获得高产紫色杆菌素菌株。

附图说明

图1为pec-j-vio-1质粒图谱。

图2为pec-j-vio-2质粒图谱。

图3为pec-c-vio-1质粒图谱。

图4为pec-c-vio质粒图谱。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

牛脑心浸粉：碧迪医疗器械(上海)有限公司，分析纯。

玉米浆干粉：上海阿拉丁生化科技有限公司，分析纯。

bhis固体培养基：牛脑心浸粉37g，d-山梨醇91g，琼脂粉15g，蒸馏水定容至1l，121℃灭菌15min。

bhis液体培养基：牛脑心浸粉37g，d-山梨醇91g，蒸馏水定容至1l，121℃灭菌15min。

种子液培养基：一水合葡萄糖50g，酵母浸粉10g，玉米浆干粉30g，硫酸铵4g，七水硫酸镁0.25g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸亚铁10mg，硫酸锰10mg，蒸馏水定容至1l，调ph至7.2，115℃灭菌20min。

发酵培养基：一水合葡萄糖60g，玉米浆干粉50g，硫酸铵10g，七水硫酸镁0.5g，磷酸二氢钾1g，磷酸氢二钾1g，七水硫酸亚铁10mg，硫酸锰10mg，苯丙氨酸30mg，酪氨酸30mg，碳酸钙10g，蒸馏水定容至1l，调ph至7.2，115℃灭菌20min。

以下实施例中紫色杆菌素的提取步骤如下：

1、取0.5ml发酵液，16200×g离心10min后弃上清，再用蒸馏水将沉淀洗涤两次后离心弃上清，保留细胞沉淀。

2、采用1ml无水乙醇重悬步骤1得到的细胞沉淀，超声震荡30min(超声功率为250w)，然后16200×g离心10min，收集蓝紫色的上清液。

3、重复步骤2两次，将上清液合并，得到萃取液。

4、将步骤4得到的萃取液8000×g、4℃离心30min，收集上清溶液分批进行真空旋转蒸发，蒸发温度为60℃。

5、向步骤4处理后的蒸馏瓶中加入适量双蒸水清洗内壁，超声震荡10min(超声功率为250w)，对悬浮液进行真空抽滤处理(过滤膜为0.22μm水系膜)，将截留下来的紫色杆菌素粗提物收集到玻璃小瓶，进行真空冷冻干燥处理，得到紫色杆菌素粗提物。

实施例1、重组表达质粒的构建

一、pec-j-vio-1质粒的构建

人工合成pec-j-vio-1质粒。pec-j-vio-1质粒包含如下元件：自于janthinobacteriumlividum的紫色杆菌素生物合成途径功能基因vioa、viob、vioc、viod、vioe，五个基因共用一个ptrc启动子。经过测序验证，对pec-j-vio-1质粒描述如下：将序列表的序列4所述的dna分子自5’端第6680-15223位核苷酸替换为序列1所示的特异dna分子得到的环状质粒。pec-j-vio-1质粒示意图如图1所示。

二、pec-j-vio-2质粒的构建

人工合成pec-j-vio-2质粒。pec-j-vio-2质粒是通过在pec-j-vio-1质粒的基础上分别在viob，vioc，viod，vioe基因前面引入谷氨酸棒状杆菌的强rbs序列(gaaaggaggtttggaca)得到的。经过测序验证，对pec-j-vio-2质粒描述如下：将序列表的序列4所述的dna分子自5’端第6680-15223位核苷酸替换为序列2所示的特异dna分子得到的环状质粒。pec-j-vio-2质粒示意图如图2所示。

三、pec-c-vio-1质粒的构建

人工合成pec-c-vio-1质粒。pec-c-vio-1质粒的构建方法为：克隆来自chromobacteriumviolaceum紫色杆菌素功能基因vioa，viob，vioc，viod，vioe，并在viob，vioc，viod，vioe基因前面添加rbs序列(gaaaggaggtttggaca)，转录单位上功能基因的顺序按照vioa-viob-vioc-viod-vioe，五个基因共用一个ptrc启动子。经过测序验证，对pec-j-vio-2质粒描述如下：将序列表的序列4所述的dna分子自5’端第6680-15223位核苷酸替换为序列3所示的特异dna分子得到的环状质粒。pec-c-vio-1质粒示意图如图3所示。

四、pec-c-vio质粒的构建

人工合成pec-c-vio质粒。pec-c-vio质粒的构建方法为：在pec-c-vio-1质粒的基础上分别在vioa，viob，vioc，viod，vioe基因前面引入ptrc启动子。五个基因分别受各自的ptrc启动子调控表达。pec-c-vio质粒为序列表的序列4所示的环状质粒(已测序验证)。pec-c-vio质粒示意图如图4所示。

实施例2、重组菌的构建及紫色杆菌素产量的检测

1、将实施例1构建的pec-j-vio-1质粒采用电转化法导入底盘细胞谷氨酸棒状杆菌(atcc21850)中，得到重组菌。

2、将步骤1制备的重组菌接种至含有25μg/ml硫酸卡那霉素的bhis固体培养基上，30℃静置培养，挑取单克隆接种到6mlbhis液体培养基中，30℃、200r/min培养48h，得到菌悬液(od600nm＝5)。

3、将1ml步骤2得到的菌悬液接种至25ml种子液培养基中，30℃、200r/min培养至菌液od600nm＝30，得到种子液。

4、将1ml步骤3得到的种子液接种至25ml发酵培养基中，30℃、200r/min培养18h，然后向培养体系中加入终浓度为0.5mm的iptg，继续20℃、200r/min发酵72h，得到发酵液。

5、从步骤4得到的发酵液中提取紫色杆菌素，得到紫色杆菌素粗提物。紫色杆菌素产量为629mg/l。

6、采用实施例1构建的pec-j-vio-2质粒替代pec-j-vio-1质粒，按照步骤1-5进行操作，得到紫色杆菌素粗提物。紫色杆菌素产量为815mg/l。

7、采用实施例1构建的pec-c-vio-1质粒替代pec-j-vio-1质粒，按照步骤1-5进行操作，得到紫色杆菌素粗提物。紫色杆菌素产量为1115mg/l。

8、采用实施例1构建的pec-c-vio质粒替代pec-j-vio-1质粒，按照步骤1-5进行操作，得到紫色杆菌素粗提物。紫色杆菌素产量为1835mg/l。

<110>中国科学院天津工业生物技术研究所

<120>利用谷氨酸棒状杆菌生产紫色杆菌素的方法

<160>4

<210>1

<211>7326

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

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