EMP基因在水稻愈伤分化发育中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程
技术领域：
，更具体地，涉及一种emp基因在水稻愈伤分化发育中的应用。
背景技术：
：以农杆菌为介导的植物转基因技术广泛应用于植物基因功能研究和作物遗传改良。农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。农杆菌介导法具有效率高、成本低、可转移较长基因片段等优点。目前，所得到转基因植株中有85%都是通过农杆菌介导法而得到的。农杆菌介导的植物遗传转化中转化率仍然是一个需要解决的问题，有一些理化和生理因素影响着转化率和t-dna进入植物细胞，主要有菌株、质粒、组培环境、培养基、外植体类型以及植物基因型等，不同的植物，有利于t-dna转移的条件是不同的，通过优化其中的某个或某些因素，可以大大提高转化率。植物组织培养过程中植物基因型差异对于转化效率影响较大，例如水稻籼稻和粳稻的愈伤再生能力差异较大，目前对于籼稻再生能力低导致的转化效率极低问题的改良集中在培养基试剂成分的调整，而且仅有少量成功报道，说明其再生能力的提高不能仅依赖愈伤再生培养基的改进。通过研究影响水稻粳稻高再生能力相关的基因型，不仅对研究水稻愈伤再生的机理，而且对提高水稻遗传转化效率应用具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供emp基因在水稻愈伤分化发育中的应用。本发明的目的是通过以下技术方案给予实现的：本发明利用反向遗传学得到的影响水稻中花11的rna干涉突变体，并通过与野生型品种的愈伤分化能力比较分析鉴定了一个与水稻愈伤分化能力相关的基因，至今尚未有与此基因相关的文献报道。水稻中该影响水稻愈伤分化发育的基因被破坏，即可导致水稻愈伤分化再生能力下降。所述基因的序列如seqidno：1所示，其编码氨基酸序列如seqidno：2所示，所述蛋白为一个10.1kd小分子量蛋白；比对发现其为水稻emp基因，现有中仅公开了其与水稻渗透胁迫、盐胁迫和干旱胁迫的耐受性有关，除此之外的其他功能还未见报道。因此，本发明首先保护emp基因及其编码蛋白在如下几个方面的应用：seqidno：1所述的emp基因在水稻愈伤分化发育中的应用。seqidno：2所述蛋白在水稻愈伤分化发育中的应用。优选地，为在提高水稻愈伤分化发育能力中的应用。具体地，所述应用为构建过量表达seqidno：1所述基因的重组表达载体，并转化水稻植株。seqidno：1所述的emp基因在鉴别水稻愈伤分化发育能力中的应用。具体地，所述应用为检测水稻品种中seqidno：1所示emp基因的表达水平，若emp基因表达水平高，则表示该水稻愈伤分化发育能力强，反之则表示该水稻品种愈伤分化发育能力弱。优选地，所述emp基因的实时定量rt-pcr引物如seqidno：11和seqidno：12所示，内参基因osactin1的扩增引物如seqidno：9和seqidno：10所示，seqidno：9：5’-cacattccagcagatgtgga-3’seqidno：10：5’-accacaggtagcaataggta-3’seqidno：11：5’-tcatatggtgatgcgtgctt-3’seqidno：12：5’-aagaagctagcagctgctg-3。优选地，所述检测反应体系为：2×sybrgreen染料定量pcr反应液10μl，无菌水8.6µl，10µmol/l上下游引物各0.2µl，模板为1µl，总体积20μl。优选地，反应程序为（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；（iii）72℃延伸5min。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明的emp基因与水稻愈伤分化发育相关，通过检测emp基因的表达量，可以快速检测鉴定水稻愈伤再生能力；同时，过表达emp基因，可提高水稻愈伤分化能力，提高水稻遗传转化效率，进而改进以农杆菌介导的水稻转基因转化效率，对培育新的水稻品种具有具有重要意义。附图说明图1为中花11和rna干涉突变体诱导愈伤组织的基因表达水平的rt-pcr结果图；其中，zh是指野生型水稻中花11，empi是指雌激素诱导型rnai干涉转基因植株；+er指加入诱导剂雌激素er处理。图2为中花11和rna干涉突变体的愈伤组织分化能力差异结果图；其中，zh是指野生型水稻中花11，empi是指雌激素诱导型rnai干涉转基因植株；+er指加入诱导剂雌激素er处理。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1水稻影响愈伤分化能力相关基因emp的rna干涉突变体材料的获得根据ncbi数据库os05g0349800序列信息设计特异引物：seqidno：3：ctagtcgactctagcctcgagatggcgtccgggcagcagseqidno：4：atctgctccttcctcgtctseqidno：5：ggaggcctggatcgactagtatggcgtccgggcagcagseqidno：6：agacgaggaaggagcagatctcggcgaggttctcctg利用引物seqidno：3和seqidno：4组合以及seqidno：5和seqidno：6组合扩增两个dna片段后利用一步构建rna干涉载体方法（jiang,etal.,planta.2013.(238)：325-330）构建per8雌激素诱导型rna干涉载体（zuoj,etal.,2000.11(2):146-151.）。通过农杆菌介导转化方法转化中花11，获得稳定的转基因株系，该转基因株系的愈伤分化能力与中华11相比显著下降，即影响愈伤分化能力相关基因emp的rna干涉突变体材料。实施例2水稻影响愈伤分化能力相关基因功能鉴定1、水稻rna的提取和反转录反应（1）取水稻（中花11）组织约0.5g，放入预冷的研钵中，加入液氮，将其研磨成粉末后，放入2ml离心管中，加入1000μlrna提取缓冲液和200μl氯仿，混匀，65℃水浴5min；（2）在12000转/分的条件下离心12min，将上清液转移到另一个1.5ml离心管中，加入其0.6倍体积异丙醇或两倍体积无水乙醇，混匀，12000转/分离心12min，去上清，用0.5ml70％的乙醇漂洗两次，风干，溶于20μldepc水中；（3）取1μlrna用于pcr反转录反应，反转录cdna第一链的合成（15μl），反应体系为：dnase处理后的总rna1μl、oligodt（10μmol/l）1μl、depc水补足15μl；该反应体系于65℃保温5min，冰上冷却3min，之后利用表1所述的体系，在42℃条件下反应1h，65℃加热10min终止反应，放入-20℃冰箱中备用。表15×第一链反应缓冲液5μldntps(10μmol/l)1μl反转录酶(200u/μl)1μlrna酶抑制剂1μldepcddh2o17μl总体积25μl2、pcr扩增和基因检测（一）具体操作如下：a.pcr反应体系包括无菌水16.2µl，10×buffer2µl，10µmol/l上下游引物（引物序列如seqidno：3和seqidno：4所示或者引物序列如seqidno：5和seqidno：6）各0.2µl，2.5mmol/ldntps0.2µl，5u/µltaqdna聚合酶0.2µl，50ng/µl模板dna1µl，反应体系的总体积为20μl。pcr的反应条件为：（i）94℃预变性5min，（ii）94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；（iii）72℃延伸5min。扩增得到的中花11的pcr产物长度分别为0.18kb和0.2kb；其核苷酸序列包含在seqidno：1所示序列内。参照ncbi网站上获得的水稻中花11的orf序列，设计特异性pcr引物，引物序列如seqidno：7和seqidno：8所示。seqidno：7：5’-atggcgtccgggcagcag-3’seqidno：8：5’-ctaggacttggtcttgtac-3’对提取的正常水稻中花11植株cdna进行扩增，其目的片段长度为288bp，并进行测序。将测序得到的dna序列即编码序列利用dnastar软件翻译成氨基酸序列如seqidno：2所示。（二）检测影响水稻愈伤分化能力相关基因emp的表达情况，具体操作如下：1、引物设计：seqidno：9：5’-cacattccagcagatgtgga-3’seqidno：10：5’-accacaggtagcaataggta-3’seqidno：11：5’-tcatatggtgatgcgtgctt-3’seqidno：12：5’-aagaagctagcagctgctg-3seqidno：9和seqidno：10引物为实时定量rt-pcr内参基因osactin1扩增引物，seqidno：11和seqidno：12引物为实时定量rt-pcr目标基因emp扩增引物。2、pcr反应体系：2×sybrgreen染料定量pcr反应液10μl，无菌水8.6µl，10µmol/l上下游引物各0.2µl，模板为1µl中花11或rna干涉突变体总rna的rt产物，反应体系的总体积为20μl。在realtimepcr仪上设定反应条件为：（i）94℃预变性5min；（ii）94℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，45个循环；（iii）72℃延伸5min。经测序序列长度为0.2kb，其核苷酸序列包含在seqidno：1所示序列内。其实时定量pcr结果分析如图1所示：无论是否加入诱导剂雌激素，中花11愈伤在预分化培养基上随着培养时间的增加，emp表达水平迅速提高，与empi愈伤在不含诱导剂雌激素的预分化培养基上类似。而empi愈伤在含有诱导剂雌激素的预分化培养基上时，emp基因表达水平没有提高，说明在雌激素诱导emp基因的rna干涉结构的作用下，emp表达水平被下调。同时，本实施例按照上述方法提取了几个不同水稻品种的总rna，反转成cdna，然后用上述实时定量rt-pcr的反应引物、反应体系和程序进行emp基因表达水平的检测，于此同此，用现有方法测定这几个水稻品种愈伤分化能力；结果显示，emp基因的表达量与水稻愈伤分化能力呈正相关，其反映出的水稻品种愈伤分化能力与现有的测试结果一致；因此，可通过检测水稻emp基因的表达量来快速鉴定水稻品种的水稻愈伤分化能力。实施例3影响水稻愈伤分化能力相关基因的功能验证采用雌激素诱导表达rna干涉产物并破坏水稻中seqidno：1的基因序列。经实时定量rt-pcr检测，其mrna表达水平下降，雌激素处理rnai干涉突变体预分化能力显著下降。影响水稻愈伤分化能力相关基因的功能验证包括以下步骤：（1）利用雌激素诱导表达载体构建影响水稻愈伤分化能力相关基因rna干涉载体，并通过农杆菌介导转化中花11并鉴定获得纯合转基因t2代材料。（2）将中花11和影响水稻愈伤分化能力相关基因rna干涉转基因材料种子进行诱导愈伤，并转入正常预分化培养基和加入雌激素的预分化培养基培养。（3）统计预分化成功率与雌激素诱导表达rnai干涉造成的稻愈伤分化能力相关基因表达下降的相关性，结果表明该基因表达水平下调影响了水稻中花11的愈伤分化能力，如图2。实施例4过表达emp基因的转基因水稻植株通过选用常用的植物表达载体，构建emp基因的过表达载体，然后通过农杆菌介导转化中花11并鉴定获得纯合转基因t2代材料；将获得的转基因材料和中花11在相同条件下进行诱导愈伤，结果显示，过表达emp基因的转基因植株的愈伤组织分化能力要显著高于中花11；同时提取该转基因水稻植株和普通中花11的rna，进行定量pcr检测，显示emp基因在转基因水稻植株中的表达量要显著高于中花11。sequencelisting<110>华南农业大学<120>emp基因在水稻愈伤分化发育中的应用<130>2017<160>12<170>patentinversion3.3<210>1<211>395<212>dna<213>emp基因<400>1atggcgtccgggcagcagcagcagggcaggtcggagctggaccgcatggccagggagggc60cagaccgtcgtccccggcggcaccggcggcaagagcctcgaggcccaggagaacctcgcc120gagggtatgcaaaataatactgaaacttttgatagatcaaacttgccatttcattcggta180tttcggttgaagtacgtaactaatatgcgtacgtgtgcatcgatcgatcagggcgcagcc240gcggggggcagacgaggaaggagcagatgggggaggaagggtaccgcgagatggggcgca300agggcggcctcagcaccggcgacgagtccggcggcgagcgcgccgcccgcgagggcatcg360acatcgacgagtccaagtacaagaccaagtcctag395<210>2<211>95<212>prt<213>emp蛋白<400>2metalaserglyglnglnglnglnglyargsergluleuaspargmet151015alaarggluglyglnthrvalvalproglyglythrglyglylysser202530leuglualaglngluasnleualagluglyargserargglyglygln354045thrarglysgluglnmetglyglugluglytyrargglumetglyarg505560lysglyglyleuserthrglyaspgluserglyglygluargalaala65707580arggluglyileaspileaspgluserlystyrlysthrlysser859095<210>3<211>39<212>dna<213>人工序列<400>3ctagtcgactctagcctcgagatggcgtccgggcagcag39<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<400>4atctgctccttcctcgtct19<210>5<211>38<212>dna<213>人工序列<400>5ggaggcctggatcgactagtatggcgtccgggcagcag38<210>6<211>37<212>dna<213>人工序列<400>6agacgaggaaggagcagatctcggcgaggttctcctg37<210>7<211>18<212>dna<213>人工序列<400>7atggcgtccgggcagcag18<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8ctaggacttggtcttgtac19<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列<400>9cacattccagcagatgtgga20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列<400>10accacaggtagcaataggta20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列<400>11tcatatggtgatgcgtgctt20<210>12<211>19<212>dna<213>人工序列<400>12aagaagctagcagctgctg19当前第1页12