一株产乙酸乙酯的异常毕赤酵母及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中，一株产乙酸乙酯的异常毕赤酵母及其应用。

背景技术：

白酒中微量的风味成分是构成不同白酒香味和风格的主要物质，主要包括醇类、醛类、酸类、酯类、内酯类、酮类等，其中酯类物质是白酒中重要的呈香成分，如乙酸乙酯是清香型白酒的主要香气成分。产酯酵母作为白酒产香的重要菌种，在长期的培养和驯化下，能够在酯酶作用下将乙酸和乙醇转化成乙酸乙酯和其他的酸酯。产酯酵母也叫生香酵母，是可以生成较多酯类物质的酵母的统称，不是分类学上的名词，汉逊酵母属、异常毕赤酵母、产朊酵母属、假丝酵母属、球拟酵母属和酒香酵母属等都有部分酵母属于产酯酵母。产酯酵母在发酵的过程中会产生醇类、酸类、醛类等多种物质，这些物质共同构成了丰富的发酵香气，因此产酯酵母对白酒成品中呈香物质的产生有很大的影响。

经过千百年的发展，生产工艺不断改进，但传统自然发酵技术在白酒生产中仍然占据重要地位，造就了白酒特有的发酵工艺以及独特的风味。然而，开放式自然发酵工艺易受温度、湿度、原料、地理位置等环境因素的影响，从而影响产品的品质稳定性，因此对白酒风味及品质改善的相关研究成为目前研究的热点。徐丽萍从泸型大曲中筛选的汉逊酵母在适宜的培养条件下产酯量最高达1.479g/l。杨强等人所筛选的产酯酵母发酵液中乙酸乙酯的含量最高为1.042g/l。肖冬光等人通过基因重组构建的高产酯低产高级醇酿酒酵母菌株发酵蒸馏后乙酸酯的总量为1.3036g/l(专利申请号cn201511017931.3)。杨强等人所筛选的产酯酵母和大曲混合进行固态发酵，蒸馏后酒中的总酯约为2.4g/l(杨强，酿酒科技，2016)。

目前所获得的产酯酵母主要采用液态纯种发酵方式测定其产酯能力，而目前白酒主要采用传统固态发酵，菌株在纯种液态发酵中的产酯作用未经过多菌种混合固态发酵的验证，而且采用分子生物学方法构建的菌株在实际应用中受到一定的限制。白酒发酵过程中会积累大量的有机酸和乙醇，发酵后期微生物的丰度下降，产酯酵母的生长会受到抑制。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种可用于发酵的异常毕赤酵母(pichiaanomala)。

本发明提供的异常毕赤酵母(pichiaanomala)为异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为cgmccno.14381。

本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂的活性成分为所述异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6。

本发明还提供了发酵食品的制备方法，所述方法包括：利用所述异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6进行发酵，制备得到发酵食品。

上述发酵食品的制备方法中，所述发酵食品可为白酒。

所述发酵食品为白酒时，所述方法具体可包括利用所述异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6进行对所述高粱醪液培养基发酵，制备得到所述发酵食品。

所述高粱醪液培养基具体可为由高粱淀粉制备得到的培养基。所述高粱醪液培养基的制备具体可包括：配制料液比0.25(即高粱淀粉与水的质量比为0.25:1)的高粱淀粉浆，将其在65℃下糊化30min后，按15u/g初始淀粉加入糖化酶，然后于95℃液化100min，冷却后用0.1m盐酸溶液调节ph至5.0左右，之后按150u/g初始淀粉加入糖化酶，再于55℃糖化4h，用纱布过滤，收集滤汁后分装，在115℃下高压灭菌20min，得到所述高粱醪液培养基。

上述发酵食品的制备方法中，所述方法还可包括对发酵后的物质进行蒸馏。

本发明还提供了酯的制备方法，所述方法包括：利用所述异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6进行发酵，制备得到酯。

上述方法中，所述酯可为乙酸乙酯、乳酸乙酯、辛二酸二乙酯、二乙基庚二酸酯、壬二酸二乙酯、乙酸异戊酯、2-甲基-丙酸-乙酯、硬脂酸乙酯、苯甲酸乙酯、丁二酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸异丁酯、9-十六碳烯酸乙酯、棕榈酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乳酸异戊酯、戊酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸乙酯或2-甲基-丁酸-乙酯。

所述异常毕赤酵母(pichiaanomala)p6在制备发酵食品中的应用，也属于本发明的保护范围。

所述菌剂在制备发酵食品中的应用，也属于本发明的保护范围。

本发明筛选得到的具有产酯功能的异常毕赤酵母p6，具有较高的耐受性，能够耐受12％的乙醇，并能够在ph为2的环境中生长良好。异常毕赤酵母p6在高粱醪液中发酵产乙酸乙酯的量达到2350.41mg/l，将异常毕赤酵母p6进行进一步的强化发酵，与不添加该菌株的对照相比，添加了异常毕赤酵母p6得到的强化发酵酒醅中乙酸乙酯的含量比对照提高了32.69％，酒醅中总酯的含量提高了28.22％，蒸馏酒原酒中总酯的含量提高了53.5％。表明，本发明的异常毕赤酵母p6可广泛应用于白酒等对酯类风味物质有需求的发酵食品工业，具有一定的应用前景。

生物材料保藏说明

生物材料的分类命名：异常毕赤酵母(pichiaanomala)

生物材料的菌株编号：p6

生物材料的保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

生物材料的保藏单位简称：cgmcc

生物材料的保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101

生物材料的保藏日期：2017年7月4日

生物材料的保藏中心登记入册编号：cgmccno.14381

附图说明

图1为异常毕赤酵母p6乙醇耐受性检测结果。

图2为异常毕赤酵母p6酸耐受性检测结果。

图3为强化发酵原酒和对照原酒中总酯的含量。其中，对照组表示对照原酒，强化发酵组表示强化发酵原酒。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、异常毕赤酵母p6的筛选与鉴定

本发明的发明人采用高粱醪液培养基筛选得到一株具有酵母形态特征的高产乙酸乙酯酵母菌，利用26srrna的引物对对该酵母基因组进行pcr扩增，检测其26srrna的序列，pcr产物的序列为序列表中序列1，将该序列在genbank中进行blast比对，与序列1一致性最高的为异常毕赤酵母(pichiaanomala)的26srrna，一致性达99％，因此，将该酵母菌鉴定为异常毕赤酵母(pichiaanomala)，将该酵母菌命名为异常毕赤酵母p6。

异常毕赤酵母p6已于2017年7月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为cgmccno.14381。

实施例2、异常毕赤酵母p6产酯能力的检测

高粱醪液培养基的制备：配制料液比0.25(即高粱淀粉与水的质量比为0.25:1)的高粱淀粉浆，将其在65℃下糊化30min后，按15u/g初始淀粉加入糖化酶，然后于95℃液化100min，冷却后用0.1m盐酸溶液调节ph至5.0左右，之后按150u/g初始淀粉加入糖化酶，再于55℃糖化4h，用纱布过滤，收集滤汁后分装，在115℃下高压灭菌20min，得到高粱醪液培养基。

将异常毕赤酵母p6以1％的接种量接种到制备好的高粱醪液培养基中于28℃恒温培养箱中静置发酵7d，设置三个平行实验。将发酵7d后得到的发酵液震荡混匀，吸取2ml，于13400×g离心5min后，吸取上清液，通过0.22μm无菌有机系滤膜过滤上清液，得到高粱醪液发酵液，采用气相色谱法测定高粱醪液发酵液中主要风味物质乙醛、乙酸乙酯、异戊醇及乳酸乙酯的含量。具体检测方法如下：采用色谱柱：db-wax熔融石英毛细管，色谱柱规格为30m×0.32mm×0.25μm，其色谱程序为：进样口温度：230℃，检测器(fid)温度：250℃，升温程序：初始温度为35℃，保持5min；以8℃/min升温至125℃；以40℃/min升至230℃，保持2min；载气：氮气；分流比：1:30；氢气流速：40ml/min；空气流速：400ml/min；尾吹气流速：30ml/min；进样量：1μl。

表1发酵高粱醪液中主要风味物质的含量(mg/l)

结果显示，高粱醪液发酵液中乙酸乙酯的含量达到2350.41mg/l，乳酸乙酯的含量为74.61mg/l。表明，利用异常毕赤酵母p6可以得到大量的乙酸乙酯和乳酸乙酯。

实施例3、异常毕赤酵母p6的耐受性的检测

1、乙醇耐受性测定

采用ypd液体培养基(ypd液体培养基含有酵母浸粉10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l，115℃高压灭菌20min)。在灭菌后的ypd液体培养基中加入无水乙醇，分别得到乙醇体积百分比分别为0％、4％、8％、12％、16％的培养基。将异常毕赤酵母p6以0.1％的接种量接至上述各培养基中，于28℃的条件下150r/min摇床振荡培养20h，得到不同乙醇浓度处理下的发酵液，测定各发酵液在od600处的吸光值。

结果如图1所示，当培养基中乙醇体积百分比为4％和8％时，异常毕赤酵母p6可以生长良好；当乙醇体积百分比为12％时，异常毕赤酵母p6并未完全受到抑制，仍能缓慢生长；当乙醇体积百分比达到16％时，其生长几乎被完全抑制。白酒传统发酵过程中，发酵结束时酒醅中乙醇的含量为10-12％，因此异常毕赤酵母p6可以耐受乙醇含量相对较高的发酵过程，甚至是白酒的发酵过程。

2、酸耐受性测定

将ypd液体培养基用1mol/l的盐酸调节ph，分别得到ph为2、3、4和5的培养基。将异常毕赤酵母p6以0.1％的接种量接至上述各培养基中，于28℃的条件下150r/min摇床振荡培养20h，得到不同ph处理下的发酵液，测定各发酵液在od600处的吸光值。

结果如图2所示，在ph为2～5的环境中，异常毕赤酵母p6并未受到明显的抑制，仍能保持良好的生长，表明异常毕赤酵母p6菌株对酸也具有一定的耐受性，使其能够在这一特殊环境中保持良好的产酯特性。白酒发酵过程中会积累大量的有机酸，一般酒醅中的ph为3～5，说明，异常毕赤酵母p6也可以用于白酒发酵。

实施例3、异常毕赤酵母p6的强化发酵实验

强化发酵：称取1.5kg粉碎好的高粱，加入0.975kg的热水(85～90℃)润糁，8个小时搅拌一次，润糁20h后，于蒸馏甑中蒸糁60min，蒸熟后加入冷却的无菌水400ml，边加水边搅拌均匀捣碎疙瘩，冷散到17℃后加入150g大曲，充分混合均匀后得到红糁，待用。取稀释到生物量约为10⁷cfu/ml的异常毕赤酵母p6菌液以2％的接种量接种至500g上述红糁中，搅拌均匀后置入1l的蓝盖瓶中密封发酵28d，得到强化发酵酒醅，以未加异常毕赤酵母p6菌液得到的酒醅作为对照，每个处理三个平行。其中，大曲来源于山西杏花村汾酒集团。

采用顶空固相微萃取-气质联用的方法测定酒醅中酯类化合物的含量：称取52g酒醅样品，加入20ml超纯水，超声处理30min，在4℃下以8000×g离心10min。取8ml上清液放入20ml顶空瓶中，并加入nacl(nacl的加入量为3g)和4-甲基-2-戊醇(4-甲基-2-戊醇的加入量满足其浓度为125μg/l)作为内标，得到样品1。将样品1在50℃平衡5min，采用三相萃取头(dvb/car/pdms,50/30μm)在50℃加热搅拌萃取吸附45min，得到待检测样品。检测待检测样品的条件如下，所用标准品为4-甲基-2-戊醇：

色谱柱为hp-innowax(60m×0.25mm×0.25μm)，aglient6890gc和aglient5975ms联用，载气为高纯氦气，流速为2ml/min；进样口和检测器的温度为250℃，热解析5min。柱温箱升温程序为：50℃保持2min，然后以2℃/min的速度升温至85℃保持0.1min，再以5℃/min的速度升温至230℃保持2min。离子源温度为230℃，电离方式为ei，离子能量为70ev，四级杆温度为150℃，质量扫描范围为20～350u。

强化发酵结束后，对酒醅进行固态蒸馏，蒸馏酒原酒中总酯的测定参考gb/t10345中规定的方法。

结果如表3所示：对照酒醅中乙酸乙酯的含量为33.44mg/kg，强化发酵酒醅中乙酸乙酯的含量为44.37mg/kg，与对照相比提高了32.69％；对照酒醅中总酯的含量为74.34mg/kg，强化发酵酒醅中总酯的含量为95.32mg/kg，与对照相比提高了28.22％。表明，强化发酵酒醅中的乙酸乙酯及总酯的含量均有显著增加，说明，异常毕赤酵母p6可以促进酯类的生成。

另外，与对照酒醅相比，强化发酵酒醅中辛二酸二乙酯提高了150.00％，二乙基庚二酸酯提高了100.00％，壬二酸二乙酯提高了78.57％，乙酸异戊酯提高了68.72％，2-甲基-丙酸-乙酯提高了64.29％，硬脂酸乙酯提高了45.45％，苯甲酸乙酯提高了45.45％，丁二酸乙酯提高了41.18％，苯乙酸乙酯提高了33.87％，乙酸异丁酯提高了30.56％，9-十六碳烯酸乙酯提高了28.00％，棕榈酸乙酯提高了26.86％，己酸乙酯提高了22.41％，乳酸乙酯提高了21.74％，琥珀酸二乙酯提高了21.42％，乳酸异戊酯提高了20.93％，戊酸乙酯提高了16.67％，油酸乙酯提高了15.77％，亚油酸乙酯提高了15.13％，2-甲基-丁酸-乙酯提高了9.68％，表明，异常毕赤酵母p6可以促进多种酯类的生成。

表3、酒醅中酯类化合物的含量

表3中，提高百分比是指与对照酒醅相比，强化发酵酒醅中各酯类物质的含量提高的百分比。

将上述各酒醅模拟工厂的蒸馏工艺进行蒸馏，制备强化发酵原酒(蒸馏酒)和对照原酒(蒸馏酒)，操作步骤如下：将发酵28d的酒醅取出，以25％的添加量加入稻壳，翻拌均匀，装甑蒸馏，收集馏出液，即蒸馏原酒。

结果(图3)显示，对照原酒中总酯的平均含量为2.09g/l，强化发酵原酒中总酯的平均含量为3.21g/l，比对照原酒提高了53.5％。

利用本发明的异常毕赤酵母p6得到的固态发酵蒸馏酒中的总酯含量均显著高于相关文献和专利中菌株发酵后蒸馏原酒中总酯的含量。

<110>中国农业大学

<120>一株产乙酸乙酯的异常毕赤酵母及其应用

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<213>异常毕赤酵母

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