一种促进金盏菊开花的乳酸菌制剂的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体而言，涉及一种复合乳酸菌制剂，尤其涉及一种促进金盏菊开花的复合乳酸菌制剂及其应用。

背景技术：

金盏菊为菊科金盏菊属植物，最早出现于欧洲南部、埃及等附近地区(孙曼,赵兵,姚默等.金盏花药学研究概况[j].安徽农业科学,2011,39(34):20982-20983)，现在已经在全国各地广泛栽培。金盏菊不仅在城市园林绿化中应用较多，而且在医学和植物学史上也起到了重要的作用，金盏菊中含有多种次生物质，例如齐墩果酸等，有利于人类的身体健康，具有抑制肿瘤细胞生长和放射治疗的作用(szakiela,annag,paulinad,etal.biosynthesisofoleanolicacidanditsglycosidesincalendulaoffcinalissuspensionculture[j].plantphysiologyandbiochemistry,2003,41:271-275)。近几年，金盏菊的栽培应用非常广泛，但是，因为对花卉的肥料缺乏深入研究，市场上没有固定的专用肥，所以金盏菊的培育一直存在不合理施肥的现象(蒋志平,鲁剑巍,李文西等.盆栽金盏菊氮磷钾肥料配方的研究.园艺学报,2007,35(2):269-276)。虽然施肥在一定程度上促进了植物的生长，延长了花期，提高了观赏效果，但施用化学肥料不仅会影响环境质量，还会造成土壤板结、土地质量下降、土壤肥力降低，耕地退化等现象。随着人们环保意识的逐步加强，探索新技术，新肥源的热情日益高涨，以生物肥源代替化肥的施用，引起了大家的普遍关注。

目前，世界上近半数的国家包括美国、英国、日本、法国等主要发达国家及印度、中国、巴基斯坦等发展中国家，都在进行微生物肥料的开发与利用。管鹏等人用pgpr(plantgrowthpromotingrhizobacteria,pgpr)菌株筛选制成的s.marcescensljl-11和a.beijerinckiiljl-12菌肥进行浸种及根灌施肥处理，研究菌肥对大田环境下苜蓿生长和生产品质的影响。结果表明，施用菌肥的苜蓿株高、分枝数和单位产量、含磷量和粗蛋白质含量均得到提高，这说明在试验处理条件下，该菌肥可以促进有效磷的合成以供给自身生长，提高激素分泌能力以提高其产量和品质(管鹏,周璇,刘佳莉等.两种菌肥对大田苜蓿生长和品质的影响.中国草地学报,2014,36(4):60-64)。姚国强通过筛选抑制致致病真菌特性良好的菌株，采用低温混合发酵获得乳酸菌及其代谢产物，他以100倍稀释的乳酸菌及其代谢产物喷施于随机分组的黄瓜和小白菜的根部及叶面。试验组施用乳酸菌及其代谢产物七天一次，而对照组施以清水，其他条件均相同。结果发现乳酸菌及其代谢产物能抑制黄瓜的病害，减缓植株病害的发生，对黄瓜有一定的保护作用；且乳酸菌及其代谢产物能够促进植株生长，提高小白菜的产量(姚国强,高鹏飞,包维臣等.乳酸菌及其代谢产物对植物病害防治和增产的试验研究.第九届乳酸菌与健康国际研讨会,2014.)。韩文星利用优良pgpr菌株研制植物根际促生菌肥，测定并且分析了该菌肥对大田中燕麦的促生效果，结果发现此菌肥对燕麦生长有明显的促进效果(韩文星.pgpr菌肥研制及其对燕麦生长和品质影响的研究.兰州:甘肃农业大学,2007)。hortencia等研究表明，施用pgpr可以积极影响番茄果实的质地和大小(hortenciag.m,victoro.alterationoftomatofruitqualitybyrootinoculationwithplantgrowth-promotingrhizobacteria(pgpr):bacillussubtilisbeb-13bs.scihortic.2007,113(1):103-106)。

然而，近年来对微生物肥料的研究方面主要集中在农业种植和农产品安全领域，在植物观赏品质方面研究甚少。通过检索国内外文献，目前尚未见促进金盏菊生长且提高其观赏性的乳酸菌制剂。

技术实现要素：

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种促进金盏菊开花的复合乳酸菌制剂及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明人结合多年对各类乳酸菌的研究经验，创造性地获得了以短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28组成的复合菌剂，其显著增大了金盏菊的冠幅，延长了花期，提高了金盏菊的观赏性，进而可以减少化肥的施用量、降低环境污染。

具体地，本发明提供了如下技术方案：一种促进金盏菊开花的乳酸菌制剂，该乳酸菌制剂中的活性菌由短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28组成。

需要说明的是，本发明所采用的短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715菌株筛选自传统乳制品，为现有菌株，已于2012年10月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.6683，分类命名为短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715。另外，本发明所采用的植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28菌株筛选自市场上的豆干食品，为现有菌株，已于2009年10月19日寄存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmccno.3346。

优选地，如上所述促进金盏菊开花的乳酸菌制剂，该乳酸菌制剂由短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28按(2.5-3.2)：(0.8-1.2)的活菌数比例组成。

另外需要说明的是，本发明人在筛选抑制金盏菊病原菌的拮抗菌时意外发现，含有短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28的复合菌液对病原菌没有明显抑制作用，但对金盏菊的生长代谢有明显的影响，即对金盏菊的株高、茎粗、冠幅、最大单叶面积、花期均有促进作用，尤其对金盏菊株高的影响较空白对照组平均提高了0.91cm，茎粗较空白对照提高了0.87cm，单叶最大面积较对照提高了1.80cm²，花期延长了6.7天。基于此发现，本发明人通过接种于mrs培养液中培养发酵，将这两种乳酸菌制备成了复合乳酸菌制剂。因此，本发明提供了上述复合菌剂的应用，即：上述的乳酸菌制剂在促进金盏菊开花性状中的应用。其中，所述的金盏菊生长性状选自如下的一种或多种：株高、茎粗、冠幅、单叶最大面积、花期。

本发明涉及的乳酸菌制剂可以采用如下方法制备：

(1)将所述短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28各3％～7％的接种量分别接种于mrs液体培养基中，在35±1℃条件下培养24～35小时，经离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％-12％灭菌脱脂牛乳液，并调整其菌数为1.9～2.3×10¹⁰cfu/ml，混匀后倾注培养；

(2)将步骤(1)得到的菌株培养物分别接种于mrs培养液，在35±1℃条件下培养30～36小时，再分别接种10％～12％的灭菌脱脂牛乳液，在36±1℃条件下培养10～18小时，并加入50ml/l的椰汁，调整活菌数为2.8～3.4×10⁹cfu/ml，ph值为6.5～7.0。

与现有技术相比，本发明涉及的乳酸菌制剂由短乳杆菌(lactobacillusbrevis)jld715和植物乳酸杆菌(lactobacillusplantarum)lp28组成，这两种菌作为乳酸菌制剂施用后对金盏菊的生长代谢有明显的影响，即对金盏菊的株高、茎粗、冠幅、花期均有促进作用，不但能对金盏菊的生长性状产生有益的影响，还能延长花期，提高金盏菊的观赏特性。

附图说明

图1为各处理组在不同时间对金盏菊株高指标的影响；

图2为各处理组在不同时间对金盏菊茎粗指标的影响；

图3为各处理组在不同时间对金盏菊冠幅指标的影响；

图4为各处理组在不同时间对金盏菊单叶最大面积指标的影响；

图5为各处理组在不同时间对金盏菊开花指标的影响。

具体实施方式

以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。另外，下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1：乳酸菌对金盏菊生长和开花的影响试验

一、试验方法

本试验以金盏菊为研究对象，盆栽，生长状态相对一致的植株幼苗75盆，分为5个试验组，微酸性土壤，每隔3天浇一次乳酸菌菌液或清水(空白)，每组每次浇水500ml。

试验地点：青岛市城阳区青岛农业大学实验基地

试验组别：短乳杆菌组、植物乳杆菌组、复合菌a组、复合菌b组和空白对照组，每个试验组各15盆；

空白对照组：施用清水；

短乳杆菌组：施用短乳杆菌jld715菌液，菌液中活菌总数含量2.3-2.5×10⁹cfu/ml；

植物乳杆菌组：施用植物乳酸杆菌lp28菌液，菌液中活菌总数含量2.3-2.5×10⁹cfu/ml；

复合菌a组：施用短乳杆菌jld715和植物乳酸杆菌lp28的混合菌液，菌液中短乳杆菌jld715和植物乳酸杆菌lp28的活菌数比为3:1，活菌总数含量2.3-2.5×10⁹cfu/ml；

复合菌b组：施用短乳杆菌bdlb0001和植物乳酸杆菌lp28的混合菌液，菌液中短乳杆菌bdlb0001和植物乳酸杆菌lp28的活菌数比为3:1，活菌总数含量2.3-2.5×10⁹cfu/ml；

本试验采用盆栽的方式，将乳酸菌菌液施于金盏菊根部，并设置空白(ck)对照，每个处理选取15盆，随机区组排列，其他管理措施均相同，生长指标的测定时间间隔为7-10天。

二、生长指标的测定

本试验生长指标包括株高、茎粗、冠幅、单叶最大面积、花期的测定。其中，用卷尺测量基部到顶部(主茎顶部)之间的距离即为植物的株高，用游标卡尺在距离根部3cm处测量最粗的枝条直径测得茎粗，用卷尺测量左右两端的最大距离为冠幅，用便携式叶面积仪(yaxin-1241)测定单叶最大单叶面积，同时记录花朵开放的具体日期。

三、试验结果与分析

1、乳酸菌对金盏菊生长指标的影响

(1)对株高的影响

由表1、图1可以看出，在金盏菊生长初期(4月3日)，植物乳杆菌处理组对其株高提高明显，其次为复合菌a组，之后(4月13日)，不同浓度的乳酸菌对株高的影响大小依次为复合菌a组>复合菌b组>植物乳杆菌组>短乳杆菌组>ck。最后(5月7日)，复合菌a组对金盏菊株高的促进效果最为明显，达到16.25cm，较最低的ck组(14.55cm)提高了11.68％。平均综合来看，复合菌a组对株高的影响最为明显，较对照组增加了0.91cm。总之，复合菌a组浇施的金盏菊株高增幅最大，远远高于其他试验组和对照组，这说明施用短乳杆菌jld715和植物乳酸杆菌lp28的混合菌液效果最明显。

表1不同处理组的株高(cm)

与同日ck组比较，^*p＜0.01。

(2)对茎粗的影响

从表2、图2中可以看出，生长初期(4月3日)，短乳杆菌组对金盏菊茎粗促进效果明显，达到了7.57cm，高于其他试验组。但后期促进效果不如复合菌a组对其促进作用显著，后期(5月7日)复合菌a组相对于最初(4月3日)提高了35.47％，对照组相对于最初(4月3日)提高了16.82％。

表2不同处理组的茎粗(mm)

与同日ck组比较，^*p＜0.01。

(3)对冠幅的影响

从表3、图3可以看出，复合菌a组的金盏菊冠幅在后期(5月7日)达到了18.11cm，较试验开始时增长了2.32cm，平均冠幅为16.93cm，而ck对照组仅为17.06cm，较试验开始时增长了2.06cm，平均冠幅仅为16.10cm，植物乳杆菌组和复合菌b组对金盏菊的促进作用相差不大，短乳杆菌组对冠幅没有促进效果甚至表现出一定的抑制作用。

表3不同处理组的冠幅(cm)

与同日ck组比较，^*p＜0.01。

(4)对单叶最大面积的影响

从表4、图4可以得出复合菌a组4月3日单叶最大面积为17.35cm²，5月7日为22.83cm²，增大5.48cm²，增幅最大，且平均为20.17cm²，远远高于ck对照组的18.37cm²。另外，不同处理组对单叶最大面积的影响大小依次为复合菌a组>植物乳杆菌组>复合菌b组>短乳杆菌组>ck。

表4不同处理组的单叶最大面积(cm²)

与同日ck组比较，^*p＜0.01。

(5)对金盏菊开花的影响

由表5、图5可见，不同处理组对金盏菊开花有不同的影响。复合菌a组的植株花蕾出现最早，第1朵花开放时间也最早，其次为复合菌b组，自然生长状态下的植株开花最晚。从孕蕾时间看，复合菌a组的植株孕蕾时间最短(10.6d)，其次是复合菌b组(11.3d)，再次植物乳杆菌组(12.1d)、短乳杆菌组(13.0d)、ck(15.5d)。从提高花期方面来看，复合菌a组相比ck组提高花期为6.7天，延长了近一个周的观赏期，其次为复合菌b组提高花期为4.8天，再次为短乳杆菌组和植物乳杆菌组分别比对照组提高了3.2天和2.7天。

表5不同处理组对开花的影响

与同日ck组比较，^*p＜0.01。

综上可知，在生产中选择适宜金盏菊生长的复合乳酸菌制剂(复合菌a)，能够促进金盏菊的生长，延长花期，有效提高其观赏特性。