一种靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物及其制备与应用的制作方法

本发明涉及香豆素类化合物，尤其是涉及一种靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物及其制备与应用。

背景技术：

脑内β-淀粉样蛋白((β-amyloidprotein,aβ))来源于其前体物质β淀粉样前体蛋白(amyloidprecursorprotein,app)。已经确认aβ来源于基因编码的app，分子量约为4kd，均为跨膜糖蛋白，并且在三维结构中呈β折叠，故称“β淀粉样蛋白”。aβ由app细胞膜外28个氨基酸和跨膜部分的12个氨基酸组成，位于app的疏水部分。具有很强的聚集性，易形成极难溶解的沉淀。aβ是老年斑的主要成分，是神经病理学标志(glennergg.wongcw.alzheimer'sdisease:initialreportofthepurificationandcharacterizationofanovelcerebrovascularamyloidprotein[j].biochembiophysrescommun,1984,120(3):855-900.toreillesf,touchonj.pathogenictheoriesandintrathecalanalysisofthesporadicformofalzheimer'sdisease[j].progneurobiol,2002,66(3):191-203.lambertmp,barlowak,chromyba,etal.diffusible,nonfibrillarligandsderivedfromabeta1-42arepotentcentralnervoussystemneurotoxins[j].pronatlacadsciusa,1998,95(11):6448-6453.)。阿尔茨海默症(alzheimer'sdisease,ad)的发病机制有多种学说，其中hardy等提出了ad的aβ级联假说最受关注，该学说认为aβ的聚集在ad发生、发展过程中起核心作用，aβ导致了神经细胞功能紊乱和死亡，最终引起痴呆(hardyj,selkoedj.theamyloidhypothesisofalzheimer'sdisease:progressandproblemsontheroadtotherapeutics[j].science,2002,297(5580):353-356.)。

利用靶向aβ的特异性分子探针进行正电子断层显像(positronemissiontomograph,pet)是最适宜的ad早期确诊手段。全球各大制药公司一直都在研发特异性靶向aβ的pet显像剂，直到2012年，礼来(elililly)公司的产品，¹⁸f-florbetapir(us7687052/us8506929)获得美国fda批准；之后，美国fda又相继批准了两个药品上市，通用电气医疗公司(gehealthcare)的¹⁸f-flutemetamol(us7270800/us7351401/us8236282/us8691185/us8916131)和piramalimaging公司的¹⁸f-florbetaben(us7807135)。目前国内尚无靶向aβ的pet显像剂获得批准上市，国内对ad早期确诊和疗效评估是无药可用的局面，研发新型的靶向aβ的pet显像药物能够填补我国生物医药产业在该领域的空白。

香豆素(coumarin)，又称双呋喃环和氧杂萘邻酮，为我国南方特有植物黑香豆、香蛇鞭菊等的有效成分。本发明创新型的对香豆素衍生物进行f-18标记，发展一种特异性的pet显像探针，对于ad的早期确诊和疗效评估，具有十分重要的应用前景。

技术实现要素：

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种高纯度靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物及其制备与应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物，其特征在于，其结构式如下：

其中，r1为ch3或cf3；r2为c2h4或c3h6的直链烷基。

上述靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物的制备方法，其特征在于，将化合物b为标记前体，与¹⁸f^-进行亲核取代反应，即可，所述的化合物b的结构式如下：

其中，r1为ch3或cf3；r2为c2h4或c3h6的直链烷基，tso为十八烷基三氯硅烷基。

所述的方法具体包括以下步骤：在有机溶剂中，惰性气体保护下，在含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合物的作用下与化合物b进行亲核取代反应，反应温度40℃～120℃，反应时间5-30min，即得靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物。

所得靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物进行后处理，后处理方法为：选用放射性hplc将靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物分离纯化，然后用纯水稀释，过硅胶柱富集，用含45％乙醇的生理盐水溶液淋洗，收集于生理盐水西林瓶中，最终制备成含10％乙醇的生理盐水溶液，经无菌滤膜过滤，得到¹⁸f标记香豆素化合物制剂。用放射性hplc分离纯化之前，也可先用sep-pakc18柱对产物进行纯化。

所述的有机溶剂包括无水乙腈、无水四氢呋喃、无水dmf(n,n-二甲基甲酰胺)、无水dmso(二甲基亚砜)中的一种或多种，优选无水dmf。

所述的钾盐为碳酸钾或碳酸氢钾；

所述的相转移催化剂为环状冠醚类催化剂，所述的环状冠醚类催化剂选自4,7,13,16,21,24-六氧-1,10-二氮双环[8.8.8]二十六烷(k222)。

所述的惰性气体为氮气和/或氩气和/或氦气。

所述的含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合物中各组分的物质的量的比为：相转移催化剂：钾盐＝1：3.5～7.5：1，¹⁸f^-的活度为40μci～2ci。所述化合物b在反应溶液中的浓度为0.01～2mol/l；相转移催化剂和化合物b的质量比为1：1～7.5：1其中¹⁸f^-选自用回旋加速器轰击h2¹⁸o靶所得。

所述的含有k222、碳酸钾和¹⁸f^-的混合物可通过下述方法制得：用k222溶液淋洗富集¹⁸f^-的qma柱，蒸干溶剂，即可。

上述靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物的应用，其特征在于，其作为一种特异性阿尔茨海默症pet显像探针，用于对ad的早期诊断和疗效评估。

本发明中所用到的标记前体化合物b购自上海如絮生物科技有限公司，其余所用到的试剂均为商品化试剂。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

1、本发明得到的¹⁸f标记香豆素化合物能特异性靶向脑内β-淀粉样蛋白，脑内β-淀粉样蛋白的聚集是导致ad产生的原因之一，而¹⁸f标记香豆素化合物能通过pet来显像表征其在脑内的浓聚程度，从而表征β-淀粉样蛋白的聚集程度来进行ad的早期诊断。

2、本发明制备方法简单，适合放射药物临床应用，制备得到的¹⁸f标记香豆素化合物放射化学纯度大于95％。

3、本发明能够填补我国利用放射性药物对ad进行早期诊断和疗效评估领域的空白。

附图说明

图1本发明制备所得产品的hplc检测图；

图2本发明制备所得产品的分析hplc检测图；

图3本发明制备所得产品应用于pet显像探针进行ad模型鼠实验micro-pet显像图，其中a为app/ps1双转基因ad模型大鼠micro-pet30min静态显像图，b为正常大鼠micro-pet30min静态显像图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

化合物a(r1为ch3；r2为c2h4)香豆素化合物的制备

取k222(10-12mg)和碳酸钾(1-2mg)的乙腈溶液过富集[¹⁸f]f^-的qma柱(2mci)，收集至反应瓶中，反应瓶置在90℃，通入氮气(1ml/min)吹干，再加入无水乙腈溶剂蒸发至干，重复三次，加入0.6ml无水dmf。反应瓶中加入0.3ml含2mg前体化合物b(r1为ch3；r2为c2h4)的无水dmf溶液，于120℃下密闭反应30min，反应结束后冷却至室温。

反应产物加入5ml纯水预先经过sep-pakc18柱，然后用半制备c18柱进行分离纯化，如图1所示，t＝8.1min的峰为未反应的¹⁸f^-的特征峰，t＝25.5min的峰为产品峰，收集25-27min的产品，收集到的产品用100ml纯水稀释，过硅胶柱富集，再用2ml含45％乙醇的生理盐水溶液淋洗，收集于含8ml生理盐水西林瓶中，最终制备成含10％乙醇的生理盐水溶液，经无菌滤膜过滤，得到¹⁸f标记香豆素化合物制剂，经活度计测量，得到未经校正的放化产率为10％，经hplc检测，hplc条件：分析柱为agilentzorbaxeclipsexdbc18column(4.6mm×250mm)；流动相为添加了0.1％三氟乙酸的水(a)和乙腈(b)，梯度条件为：0-60min，30％→50％b；流速为1.0ml/min；uv(220nm)检测和放射性检测。得到¹⁸f标记香豆素化合物制剂的放化纯度>98％。

参比化合物结构c如下所示：

其中，r1为ch3或cf3；r2为c2h4或c3h6的直链烷基。参比化合物c的合成方法采用与本发明相同的方法，f元素为¹⁸f的稳定同位素。

取上述制剂a(hot)(r1为ch3；r2为c2h4)与其参比化合物c(cold)(r1为ch3；r2为c2h4)共同进样的hplc检查图谱如图2所示，hplc条件同上。得到上述制剂a的保留时间为7.51min，参比化合物c的保留时间为7.63min。

参比化合物c(r1为ch3；r2为c2h4)经¹hnmr和ms鉴定，其结构鉴定结果如下所示：

¹hnmr(dmso-d6):δ7.92(d,3jhh＝8.4hz,2h,ar-h),7.86(s,1h,ar-h),7.75(d,3jhh＝8.4hz,2h,ar-h),7.59(s,1h,ar-h),7.40(d,3jhh＝1.6hz,8.0hz,2h,ar-h),6.72(d,3jhh＝1.6hz,8.8hz,2h,ar-h),6.38(s,1h,ar-h),4.14-4.11(t,3jhh＝5.2hz,2h,ch2),3.47-3.45(t,3jhh＝4.4hz,2h,ch2),2.54(s,ch3),2.34(s,ch3)

tof-esi-ms：m(c19h16fn3o2)＝337.12(m/z),338.2(m+1)+

本制备方法中的原料，前体化合物b为上海如絮生物科技有限公司产品，其余化学试剂均为国药化学试剂公司产品，[¹⁸f]f^-是由c-30回旋加速器小体积¹⁸o-h2o靶发生¹⁸o(p,n)¹⁸f核反应获得。

实施例2pet显像

将上述方法制备的¹⁸f标记香豆素化合物a进行micro-pet显像

ad模型鼠和正常对照鼠尾静脉注射上述方法制备的¹⁸f标记香豆素化合物a，异氟烷吸入麻醉后利用加热模块保持其体温在37℃左右，利用r4micro-pet动态扫描2h，数据采集结束后分帧(前半小时，2分钟/帧；后面每10分钟/帧)，采用osem3d方法进行图像重建，利用inveonresearchworkplace2.2(irw，siemens)软件手动选定脑区各感兴趣区(roi)，计算suv。其显像如图3所示。从图中可见，ad模型大鼠在脑内的对¹⁸f标记香豆素化合物a有明显浓集，对比正常鼠中无浓集。

实施例2

一种靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物，其结构式如下：

其中，r1为ch33；r2为c2h4的直链烷基。

上述靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物通过以下方法制得:将化合物b为标记前体，与¹⁸f^-进行亲核取代反应，即可，所述的化合物b的结构式如下：

其中，r1为ch3；r2为c2h4的直链烷基，tso为十八烷基三氯硅烷基。

上述方法具体来说包括以下步骤：

1.将获得的含¹⁸f^-的h2¹⁸o溶液过qma柱富集¹⁸f^-，使用含相转移催化剂、钾盐的溶液淋洗qma柱得到含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合溶液，所述的含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合物中各组分的物质的量的比为：相转移催化剂：钾盐＝1：3.5，¹⁸f^-的活度为40μci。其中¹⁸f^-选自用回旋加速器轰击h2¹⁸o靶所得。

2.在有机溶剂(无水四氢呋喃)中，惰性气体(氮气)保护下，将含相转移催化剂k222、碳酸钾和¹⁸f^-的h2¹⁸o溶液与化合物b进行亲核取代反应，反应温度40℃，反应时间30min，即得靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物。所述化合物b在反应溶液中的浓度为0.01mol/l；相转移催化剂和化合物b的质量比为1：1。

3.选用放射性hplc将靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物分离纯化，然后用纯水稀释，过硅胶柱富集，用含45％乙醇的生理盐水溶液淋洗，收集于生理盐水西林瓶中，最终制备成含10％乙醇的生理盐水溶液，经无菌滤膜过滤，得到¹⁸f标记香豆素化合物制剂。用放射性hplc分离纯化之前，也可先用sep-pakc18柱对产物进行纯化。

实施例3

一种靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物的制备方法，包括以下步骤：

1.将获得的含¹⁸f^-的h2¹⁸o溶液过qma柱富集¹⁸f^-，使用含相转移催化剂、钾盐的溶液淋洗qma柱得到含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合溶液，所述的含相转移催化剂、钾盐和¹⁸f^-的混合物中各组分的物质的量的比为：相转移催化剂：钾盐＝7.5：1，¹⁸f^-的活度为2ci。其中¹⁸f^-选自用回旋加速器轰击h2¹⁸o靶所得。

2.在有机溶剂(无水四氢呋喃)中，惰性气体(氮气)保护下，将含相转移催化剂k222、碳酸钾和¹⁸f^-的h2¹⁸o溶液与化合物b进行亲核取代反应，反应温度120℃，反应时间5min，即得靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物。所述化合物b在反应溶液中的浓度为2mol/l；相转移催化剂和化合物b的质量比为7.5：1。

3.选用放射性hplc将靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物分离纯化，然后用纯水稀释，过硅胶柱富集，用含45％乙醇的生理盐水溶液淋洗，收集于生理盐水西林瓶中，最终制备成含10％乙醇的生理盐水溶液，经无菌滤膜过滤，得到¹⁸f标记香豆素化合物制剂。用放射性hplc分离纯化之前，也可先用sep-pakc18柱对产物进行纯化。

所得靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物，其结构式如下：

其中，r1为cf3；r2为c3h6的直链烷基。

上述靶向β-淀粉样蛋白的香豆素类化合物通过以下方法制得:将化合物b为标记前体，与¹⁸f^-进行亲核取代反应，即可，所述的化合物b的结构式如下：

其中，r1为cf3；r2为c3h6的直链烷基，tso为十八烷基三氯硅烷基。