本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种与大豆胞囊线虫抗性相关的caps标记检测方法及引物。
背景技术：
：大豆胞囊线虫(soybeancystnematode，scn)是一种根内必须性静态寄生线虫，对大豆生产造成了巨大的损失。仅在美国，从1996年到2014年，大豆上的各种病害中由大豆胞囊线虫造成的损害，约达到了36％。培育抗性材料及结合作物轮作是控制病害的一个主要方法。由于scn抗性基因在遗传上的复杂性和大豆胞囊线虫生理小种的多样性，利用传统育种方法培育抗大豆胞囊线虫的品种不但需要花费很长的时间，而且难于成功，不能应对线虫的毒性变异，不能够满足当前抗线育种的发展，急需一种更为准确、高效的鉴定scn的方法。随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选择(molecularmarker-assistedselection，mas)成为可以节约人力、物力和加速育种进程的有效方法。mas的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因而鉴定出抗性植株，能增加育种工作的效率和速度。技术实现要素：本发明的第一个目的是提供大豆基因组(glyma.wm82.a2)中如下snp位点的单核苷酸多态性或用于检测大豆基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定大豆胞囊线虫抗性中的应用。所述snp位点在大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位；所述snp位点处的核苷酸为g或t。本发明的第二个目的是提供一种用于鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫的抗性的试剂。本发明所提供的用于鉴定或辅助鉴定大豆对大豆胞囊线虫的抗性的试剂，是用于检测大豆基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质；所述snp位点在大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位；所述snp位点处的核苷酸为g或t。具体的，所述“用于检测大豆基因组中如下snp位点的单核苷酸多态性的物质”可为如下a)或b)：a)引物对a，为如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列2和序列3所示的两条单链dna组成的引物对；(a2)由将序列表中序列2和序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对。b)所述引物对a和限制性内切酶acii或其同裂酶。所述引物对a中，序列表中序列2所示的单链dna和序列表中序列3所示的单链dna的摩尔比可为1:1。所述引物对a中，两条单链dna可独立包装，也可按照摩尔比1:1混合包装。含有所述试剂的试剂盒也属于本发明的保护范围。所述试剂或所述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测大豆对大豆胞囊线虫的抗性中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的第三个目的是提供如下两种鉴定大豆对大豆胞囊线虫的抗性的方法。方法i：一种鉴定或辅助鉴定待测大豆是否抗大豆胞囊线虫的方法，具体可包括如下步骤：检测待测大豆的基因组中如下snp位点处的核苷酸，以确定所述待测大豆的基因型；根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测大豆是否抗大豆胞囊线虫：若所述待测大豆为t:t基因型，则所述待测大豆抗或候选抗大豆胞囊线虫；若所述待测大豆为g:g基因型，则所述待测大豆不抗或候选不抗大豆胞囊线虫。方法ii：一种鉴定或辅助鉴定待测大豆对大豆胞囊线虫的抗性的强弱的方法，具体可包括如下步骤：检测待测大豆的基因组中如下snp位点处的核苷酸，以确定所述待测大豆的基因型；根据所述待测大豆的基因型按照如下确定所述待测大豆对大豆胞囊线虫的抗性的强弱：t:t基因型的所述待测大豆对大豆胞囊线虫的抗性强于或候选强于g:g基因型的所述待测大豆。在上述两种方法中，所述snp位点在大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位；所述snp位点处的核苷酸为g或t。所述t:t基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位为t的纯合型。所述g:g基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位为g的纯合型。在上述两种方法中，所述“检测待测大豆的基因组中如下snp位点处的核苷酸”的方法具体可包括如下两个步骤：pcr扩增和对所述pcr扩增所得产物采用限制性内切酶acii或其同裂酶进行完全酶切从而确定所述snp位点处的核苷酸；所述pcr扩增所用的引物对满足如下条件：以所述待测大豆的基因组dna为模板进行pcr扩增所得扩增产物的序列含有序列表中序列1。进一步，所述引物对可为前文所述引物对a。更加具体的，所述“检测待测大豆的基因组中如下snp位点处的核苷酸”的方法包括如下步骤：以所述待测大豆的基因组dna为模板，采用所述引物对a进行pcr扩增，得到扩增产物；对所述扩增产物采用限制性内切酶acii进行完全酶切(反应条件可为：37℃条件下酶切反应40分钟)，根据酶切结果按照如下确定所述待测大豆基因组中所述snp位点处的核苷酸：若所得酶切产物为283bp单一dna片段，则所述待测大豆基因组中所述snp位点处的核苷酸为t；若所得酶切产物为112bp和171bp两个dna片段，则所述待测大豆基因组中所述snp位点处的核苷酸为g。其中，所述283bp单一dna片段为序列表中序列1所示dna片段(序列1的第113位为t)。所述112bp和171bp两个dna片段分别为序列表中序列1的第1-112位和第113-283位所示的两个dna片段(序列1的第113位为g)。所述试剂或所述试剂盒或所述方法在大豆育种中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的第四个目的是提供培育抗大豆胞囊线虫大豆新品种的方法。本发明所提供的培育抗大豆胞囊线虫大豆品种的方法，具体可包括选择t:t基因型的大豆作为亲本进行育种的步骤；所述t:t基因型为大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位为t的纯合型。在本发明中，所述大豆胞囊线虫具体为大豆胞囊线虫3号生理小种。实验证明，本发明检测出抗病基因glyma.11g234500上存在的snp位点，开发为caps标记，通过检测其基因型可选择出携带该基因抗病等位变异的材料，可避免耗时耗力的表型鉴定，通过基因型对育种材料进行大豆胞囊线虫3号生理小种抗性筛选，极大提高了育种过程中抗病品种的选择效率、缩短育种时间，对于抗大豆胞囊线虫品种的培育效果显著。附图说明图1为引物对a扩增产物的酶切后琼脂糖凝胶电泳检测的示意图。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。大豆胞囊线虫3号生理小种：记载于“史学晖,李英慧,于佰双等.大豆胞囊线虫主效抗病基因rhg4(gmshmt)的caps/dcaps标记开发和利用.作物学报,2015,41(10):1463-1471”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。实施例1、抗大豆胞囊线虫相关caps标记的开发及应用一、引物设计及标记开发从phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载glyma.11g234500基因序列，基因glyma.11g234500和其同源基因glyma.18g022500在核苷酸序列上具有很高的相似性，因此为了保证引物序列的特异性，先进行两个基因的序列比对，在差异位点处设计引物。利用primer5.0软件设计引物对a。利用在线软件dcapsfinder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)将snp开发为caps标记(本发明所选取的标记位点信息如表1所示)，选用酶acii(北京百灵克生物公司，货号：r0551s)进行酶切分析。引物对a的pcr扩增产物预计长度为283bp(如序列表中序列1所示)。本发明所选取的snp位点在大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第113位；所述snp位点处的核苷酸为g或t。当所述snp位点处的核苷酸为g(对应表1中的等位变异基因型gg)时，引物对a的pcr扩增产物经acii酶切后理论上可获得171bp和112bp两个片段。当所述snp位点处的核苷酸为t(对应表1中的等位变异基因型tt)时，引物对a的pcr扩增产物不能被acii酶切，产物大小为283bp。引物对a：f：5’-caacttcttgtgactggacagctta-3’(序列2)；r：5’-ctagtgaatcagcaaacaaaatagt-3’(序列3)。表1标记位点信息标记类型变异类型(snp)所在基因染色体等位变异基因型capst/gglyma.11g23450011号染色体tt、gg二、利用已知大豆胞囊线虫抗性的大豆品种建立利用caps标记检测大豆胞囊线虫抗性的方法供试待测大豆：5份已知大豆胞囊线虫抗性的大豆品种，中黄13(感病)、中品03-5373(抗病)、灰皮支黑豆(抗病)、lee(感病)和peking(抗病)。1、提取基因组dna按照快速dna提取试剂盒(mbifermentas公司，货号：k0512)的操作指南提取大豆叶片dna，提取待测大豆基因组dna。2、pcr扩增以各待测大豆基因组dna为模板，用引物对a进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。上述pcr反应体系为20μl，包括60ng基因组dna、10×pcrbuffer2μl，2mmol·l-1dntps1.5μl，2mmol·l-1引物2μl和1utaq聚合酶0.2μl(全式金生物技术有限公司，货号：ap112)，用ddh2o补足体积到20μl。上述pcr扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，优化退火温度57℃30s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存。上述pcr反应在abi(appliedbiosystems，美国)公司的pcr扩增热循环仪上进行扩增。上述引物对a对应的pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，5份已知基因型中黄13、中品03-5373、灰皮支黑豆、lee和peking大豆品种的dna进行pcr扩增，所有5份材料均获得了283bp的与目标片段长度大小相近的单一pcr产物。3、酶切分析引物对a得到的pcr产物经acii内切酶完全酶切(酶足量)。上述酶切反应体系10μl，pcr产物5μl、0.2μlacii内切酶、1.5μlnebbuffer，用ddh2o补足体积到10μl。酶切反应体系放入37℃保温箱或水浴锅中，酶切40min后取出，得到酶切产物。将acii酶切产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。若酶切产物为283bp目的条带，则待测大豆携带tt等位基因，若酶切产物为171bp和112bp的两个目的条带(测序检测大小)，则待测大豆携带gg等位基因。5份已鉴定材料用引物对a扩增及酶切后的结果如图1所示；抗大豆胞囊线虫的中品03-5373酶切产物283bp(即携带tt等位基因)；不抗大豆胞囊线虫的中黄13酶切产物为171bp和112bp(即携带gg等位基因)；不抗大豆胞囊线虫的lee酶切产物为171bp和112bp(即携带gg等位基因)；抗大豆胞囊线虫的peking酶切产物为283bp(即携带tt等位基因)；抗大豆胞囊线虫的灰皮支黑豆酶切产物为283bp(即携带tt等位基因)。由以上结果可得出结论如下：若所述待测大豆携带tt等位基因，则所述待测大豆抗大豆胞囊线虫；若所述待测大豆携带gg等位基因，则所述待测大豆不抗或候选不抗大豆胞囊线虫。三、caps标记检测大豆胞囊线虫抗性的具体应用实例1、田间抗性试验表2中的大豆品种均在感染大豆胞囊线虫3号生理小种的黑龙江农业科学院哈尔滨地区田间病圃和温室盆栽病土中鉴定大豆胞囊线虫抗性。在田间采用完全随机区组试验设计方案，重复三次。田间种植行宽0.65米，行长1.5米，株间距0.05米。温室采用盆栽鉴定，每个品种种植3盆，每盆种植5株。出苗30天后，对田间和温室的每份材料均随机选择长势相同10株进行鉴定，数每株胞囊数，计算每个鉴定品种的平均胞囊数。为了检测胞囊指数(femaleindex，fi)差异，每隔40行以中品03-5373(张姗姗等.优良品系中品03-5373系谱的遗传解析及抗大豆胞囊线虫病相关标记鉴定.作物学报,2013,39(10):1746-1753)作为抗病对照，中黄13(zdd23876)作为感病对照。以基于胞囊指数划分的抗病等级评估每个品种的抗性。胞囊指数的计算公式为fi＝(鉴定品种每株平均胞囊数/感病对照品种的平均胞囊数)×100％，每份材料以离其最近的中黄13为感病对照品种。抗感分级标准如下，fi＝0-9为抗病(resistant,r)；fi＝10-29为中抗(moderatelyresistant,mr)；fi＝30-59为中感(moderatelysusceptible,ms)；fi＝60+为感病(susceptible,s)。具体参见“史学晖等.大豆胞囊线虫主效抗病基因rhg4(gmshmt)的caps/dcaps标记开发和利用.作物学报,2015,41(10):1463-1471”。2、本发明caps标记检测采用步骤一和步骤二的方法对表2中的大豆品种分别进行pcr扩增和酶切试验。3、结果采用步骤一和步骤二的方法对表2中的大豆品种分别进行pcr扩增和酶切试验，酶切结果如表2所示。采用步骤三对表2中的各大豆品种分别进行大豆胞囊线虫抗性试验，抗性结果如表2所示。结果进一步表明，可以用本发明的引物对a和方法对待测大豆进行大豆胞囊线虫抗性检测，鉴定准确。表2大豆品种snp位点基因型上述表2涉及的品种均记载在如下文献中：王国勋.中国大豆品种资源目录.北京:中国农业出版社,1982；常汝镇,孙建英.中国大豆品种资源目录:续编一.北京:农业出版社,1991；常汝镇,孙建英,邱丽娟,陈一舞.中国大豆品种资源目录:续编二.北京:中国农业出版社,1996；张姗姗，李英慧，李金英，邱丽娟.优良品系中品03-5373系谱的遗传解析及抗大豆胞囊线虫病相关标记鉴定.作物学报,2013,39(10):1746-1753.chen,y.,d.wang,p.arelli,m.ebrahimiandr.l.nelson.2006.molecularmarkerdiversityofscn-resistantsourcesinsoybean.genome49:938-949.liyh,shixh,lihh,reifjc,wangjj,liuzx,etal.dissectingthegeneticbasisofresistancetosoybeancystnematodecombininglinkageandassociationmapping.plantgenome.2016；9(2).表2结果显示，60个大豆抗病品种中57个品种的目标扩增产物酶切后，只有一个283bp的片段，等位基因基因型为tt；14个大豆感病(包括中感)品种中12个品种酶切产物为171和112两个片段，等位基因基因型为gg。计算表2中抗病品种或品系鉴定效率(携带tt等位基因的抗病品种/所有的抗病品种)，抗病品种或品系鉴定效率为95％。计算表2中感病品种或品系鉴定效率(携带gg等位基因的感病品种/所有的感病品种)，感病品种鉴定效率为85.7％。上述方法可以用于鉴定待测大豆对大豆胞囊线虫的抗性。<110>中国农业科学院作物科学研究所<120>抗大豆胞囊线虫相关caps标记检测方法及引物<130>gncln171457<160>3<170>patentinversion3.5<210>1<211>283<212>dna<213>人工序列<220><221>misc_feature<222>(113)..(113)<223>k为g或t<400>1caacttcttgtgactggacagcttatttgttgctcaattatttagatatgtttttatttt60gcaggaactggatccaacattttcgggaacacgtgaatatagatttttggcgktaggtca120ctagttttggtatttcgttattatttttttatttccaagtaaattggattagaatatttg180aacttcttggttgctgtctcctgggtcataatgttttattatattttggtattagcatag240cattgtgatagcactattactattttgtttgctgattcactag283<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2caacttcttgtgactggacagctta25<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3ctagtgaatcagcaaacaaaatagt25当前第1页12