本发明涉及9位取代的娃儿藤碱衍生物及其制备和在抗植物烟草花叶病毒病方面的应用。
背景技术：
1935年，第一个菲并吲哚里西啶生物碱——娃儿藤碱(tylophorine)被分离鉴定出来(indianj.med.res.，1935，22，433-441)，由于其独特的化学结构、显著的生物活性，受到国内外化学家的广泛关注。本课题组首次发现该类生物碱对危害极大的烟草花叶病毒(tmv)具有非常好的抑制活性，并以此为基础开展了广泛的结构修饰和改造，优化出了高效的植物病毒病防治药剂nk-007。虽然菲并吲哚里西啶生物碱具有非常好的生物活性，但是也存在中枢神经系统毒性较大、水溶性差、对光和热不稳定的缺点，影响它的实际应用。因此对该类生物碱进行进一步的结构衍生具有重要的意义。
cn101348483公开了菲并吲哚里西啶生物碱衍生物的制备。cn103626763a公开了菲并吲哚里西啶生物碱衍生物的制备及抗植物病毒活性应用。cn103509012a公开了菲并吲哚里西啶生物碱c14位胺化衍生物的制备及抗植物病毒活性应用。cn105130985a公开了菲并吲哚里西啶生物碱季铵盐衍生物及其制备和抗植物病毒应用。然而对于菲并吲哚里西啶生物碱9位取代基对其生物活性的影响一直没有文献报道。菲并吲哚里西啶生物碱9位具有特殊的性质，c-h键较为活泼，因此在其9位引入取代基可能会对其生物活性产生较大的影响。
技术实现要素：
本发明的内容是关于通式i所示的9位取代的娃儿藤碱衍生物及其制备和在抗烟草花叶病毒病方面的应用。
本发明所述的通式i中，r代表脂肪基：各种烷烃、烯烃、二烯烃、炔烃，芳香基：苯、联苯、稠芳环、芳香杂环、各种给电子和吸电子芳环，羧基，酯基，氰基等。
本发明优选如下化学结构式的9位取代的娃儿藤碱衍生物(i)。
本发明中的9位取代的娃儿藤碱衍生物(i)可以按以下方法制备：
本发明通式i所述的9位取代的娃儿藤碱衍生物化合物1-9，可以通过方法一制备：中间体1通过酰胺化反应得到中间体2，然后通过bischler-napieralski反应与硼氢化钠还原反应得到化合物1-9。
本发明通式i所述的9位取代的娃儿藤碱衍生物化合物10可以通过方法二制备：化合物4在碱性条件下发生sn2反应得到化合物10，
本发明通式i所述的9位取代的娃儿藤碱衍生物化合物11和化合物12可以通过方法三制备：中间体1通过pictet-spengler反应得到化合物11和化合物12，
本发明通式i所述的9位取代的娃儿藤碱衍生物化合物13可以通过方法四制备：化合物12通过lialh4还原反应得到化合物13，
本发明通式i所述的9位取代的娃儿藤碱衍生物化合物14可以通过方法五制备：中间体1通过微波辅助的甲酰化反应得到中间体3，然后通过bischler-napieralski反应得到中间体4，最后用tmscn对中间体4进行亲核加成反应得到化合物14，
本发明通式i所述的化合物具有优异的抗植物病毒活性，部分化合物的抗tmv活性优于商品化品种病毒唑，可有效的防治烟草，水稻，辣椒，番茄，甘薯，瓜类，玉米等植物的病毒病，尤其适合防治烟草花叶病毒病。
本化合物能够作为抗烟草花叶病毒制剂直接使用，也可以加载体使用，还可以作为抗烟草花叶病毒剂和其他的抗烟草花叶病毒制剂，如苯并噻二唑(bth)，噻酰菌胺(tdl)，4-甲基-1，2，3-噻二唑-5-甲酸(tdla)，d或l-β-氨基丁二酸，病毒唑，宁南霉素，联三唑类化合物xy-13和xy-30，病毒a，水杨酸，氨基寡糖，多聚寡糖形成互作组合物使用。这些组合物表现出增强或者叠加作用。
具体实施方式
实施例19-甲基娃儿藤碱(化合物1)的合成(方法一)
100ml的反应瓶中加入中间体10.76g(1.99mmol)，无水二氯甲烷30ml，乙酰氯0.3g(3.82mmol)，三乙胺0.4g(3.95mmol)，4-(n，n-二甲胺基)吡啶0.05g(0.41mmol)，室温搅拌反应6h，反应液经水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，常压柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1洗脱)得白色固体0.42g，产率：49％；将得到的中间体20.1g(0.24mmol)加入到100ml的反应瓶中，然后加入无水甲苯30ml，室温搅拌下加入三氯氧磷1ml(10.92mmol)，加热回流反应1h，旋转蒸发除去溶剂，加入无水甲醇30ml，冰水浴下加入硼氢化钠0.1g(2.64mmol)，室温搅拌1h，析出大量白色固体，抽滤得白色固体0.25g，产率86％；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，1h)，7.80(s，1h)，7.32(s，1h)，7.31(s，1h)，4.27-4.19(m，1h)，4.11(s，6h)，4.05(s，3h)，4.05(s，3h)，3.70-3.62(m，1h)，3.26(d，j＝14.8hz，1h)，2.92(dd，j＝14.8，10.8hz，1h)，2.65-2.55(m，1h)，2.48(dd，j＝17.2，8.8hz，1h)，2.20-2.11(m，1h)，2.11-2.01(m，1h)，2.00-1.87(m，1h)，1.85-1.74(m，1h)，1.59(d，j＝6.0hz，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.9，148.7，148.1，147.9，132.0，127.4，126.0，124.2，124.2，123.4，105.6，104.2，103.6，103.3，59.00，58.98，56.11，56.05，55.92，53.7，34.4，30.9，23.3，21.8；hrms(esi)calcdforc25h30no4+(m+h)+408.2169，found408.2178.
实施例2
9位取代的娃儿藤碱衍生物(化合物2-9)参照实施例1的操作步骤来完成
化合物2，白色固体，产率95％；熔点：164-165℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.82(s，1h)，7.81(s，1h)，7.34(s，2h)，4.33-4.25(m，1h)，4.11(s，6h)，4.06(s，3h)，4.05(s，3h)，3.57(t，j＝7.2hz，1h)，3.25(d，j＝14.8hz，1h)，2.89-2.76(m，1h)，2.61-2.51(m，1h)，2.46(dd，j＝16.8，8.4hz，1h)，2.16-1.97(m，3h)，1.97-1.82(m，2h)，1.79-1.65(m，2h)，1.49-1.35(m，1h)，1.16-0.95(m，4h)，0.71(t，j＝6.8hz，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.7，148.5，148.0，147.9，130.7，128.9，125.8，124.4，124.0，123.3，105.3，104.2，103.5，103.2，62.9，59.0，56.1，56.0，55.9，53.9，35.6，34.3，32.3，30.9，24.6，22.5，22.0，14.1；hrms(esi)calcdforc29h38no4+(m+h)+464.2795，found464.2804.
化合物3，淡黄色固体，产率18％；熔点：210-211℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，1h)，7.79(s，1h)，7.53(s，1h)，7.35(s，1h)，4.44(s，1h)，4.12(s，3h)，4.11(s，3h)，4.07(s，3h)，4.06(s，3h)，3.51(t，j＝8.4hz，1h)，3.22(d，j＝13.2hz，1h)，2.80(dd，j＝14.8，11.1hz，1h)，2.59(q，j＝8.4hz，1h)，2.44-2.35(m，1h)，2.04-1.92(m，1h)，1.92-1.83(m，1h)，1.82-1.71(m，1h)，1.67-1.55(m，1h)，0.78(s，9h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.8，148.6，148.0，147.4，132.5，130.3，126.9，125.8，123.2，123.1，106.6，104.2，103.1，103.1，66.9，61.9，56.1，56.0，55.8，55.8，41.4，33.2，29.7，28.6，22.4；hrms(esi)calcdforc28h36no4+(m+h)+450.2639，found450.2644.
化合物4，淡黄色固体，产率71％；熔点：183-184℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.86(s，1h)，7.83(s，1h)，7.36(s，1h)，7.32(s，1h)，4.56-4.49(m，1h)，4.14(s，6h)，4.12(s，3h)，4.10-4.04(m，4h)，3.87(td，j＝8.4，2.0hz，1h)，3.80(dd，j＝11.6，5.2hz，1h)，3.32(d，j＝15.2hz，1h)，2.89(dd，j＝14.8，11.2hz，1h)，2.64(dd，j＝17.2，9.2hz，2h)，2.18-2.03(m，2h)，2.02-1.90(m，1h)，1.82-1.68(m，1h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ149.1，149.0，148.6，148.3，129.7，127.5，125.5，124.1，124.0，123.9，104.5，104.3，103.8，103.2，66.9，59.4，56.1，55.9，54.5，52.3，33.9，30.4，22.2；hrms(esi)calcdforc25h29clno4+(m+h)+442.1780，found442.1788.
化合物5，白色固体，产率76％；熔点：275-276℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.80(s，1h)，7.72(s，1h)，7.42(s，1h)，7.23-7.10(m，5h)，7.00(s，1h)，4.93(s，1h)，4.11(s，3h)，4.09(s，3h)，4.02(s，3h)，3.58(s，3h)，3.45-3.35(m，1h)，3.20-3.12(m，1h)，3.12-3.02(m，1h)，2.77-2.66(m，1h)，2.49(dd，j＝16.8，8.4hz，1h)，2.24-2.12(m，1h)，1.93-1.74(m，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.8，147.7，147.5，145.3，129.6，129.1，128.8，128.4，126.8，125.7，124.3，124.0，107.2，104.4，103.2，102.9，70.2，59.5，56.1，56.0，55.9，55.6，53.6，34.6，31.0，21.3；hrms(esi)calcdforc30h32no4+(m+h)+470.2326，found470.2333.
化合物6，淡黄色固体，产率69％。熔点：253-254℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，1h)，7.74(s，1h)，7.42(s，1h)，7.16(d，j＝7.6hz，2h)，7.10(d，j＝7.6hz，2h)，6.93(s，1h)，4.95(s，1h)，4.13(s，3h)，4.10(s，3h)，4.04(s，3h)，3.63(s，3h)，3.41(d，j＝15.2hz，1h)，3.19-2.96(m，2h)，2.81-2.67(m，1h)，2.49(dd，j＝16.4，7.6hz，1h)，2.27-2.11(m，1h)，1.95-1.72(m，2h)，1.71-1.55(m，1h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ149.0，148.9，147.8，147.6，143.9，132.4，130.1，129.3，129.0，128.5，125.6，124.14，124.08，123.99，106.8，104.4，103.2，103.1，69.3，59.3，56.1，56.0，55.9，55.6，53.5，34.5，31.0，21.45；hrms(esi)calcdforc30h31clno4+(m+h)+504.1936，found504.1947.
化合物7，白色固体，产率93％；熔点：258-259℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.11(s，1h)，8.01(d，j＝7.6hz，1h)，7.80(s，1h)，7.74(s，1h)，7.51-7.40(m，2h)，7.32(t，j＝7.6hz，1h)，6.90(s，1h)，5.08(s，1h)，4.12(s，3h)，4.10(s，3h)，4.02(s，3h)，3.63(s，3h)，3.43(d，j＝15.6hz，1h)，3.13-2.99(m，2h)，2.81-2.71(m，1h)，2.58-2.47(m，1h)，2.25-2.13(m，1h)，1.94-1.66(m，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ149.1，149.0，148.1，147.9，147.8，135.0，129.5，129.3，128.1，125.5，124.3，124.2，123.7，123.6，122.1，106.2，104.4，103.3，103.2，69.3，59.2，56.1，56.0，55.9，55.6，53.2，34.4，31.0，21.4；hrms(esi)calcdforc30h31n2o6+(m+h)+515.2177，found515.2183.
化合物8，白色固体，产率92％；熔点：137-138℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.73(dd，j＝4.4，1.2hz，2h)，8.28(s，1h)，7.84(s，1h)，7.80(s，1h)，7.47-7.39(m，3h)，7.19(s，1h)，4.77-4.68(m，1h)，4.24(s，3h)，4.18(dd，j＝13.2，2.8hz，1h)，4.14(s，3h)，4.13(s，3h)，4.04(s，3h)，3.56-3.46(m，1h)，3.43-3.34(m，1h)，2.73(dd，j＝12.8，11.2hz，1h)，2.09-2.01(m，1h)，1.99-1.91(m，1h)，1.87-1.76(m，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ167.8，150.3，149.2，149.1，149.0，148.8，144.9，130.7，126.1，125.9，125.5，124.8，124.1，121.2，107.9，106.2，103.1，102.9，57.7，56.8，56.2，56.1，55.9，50.0，37.9，29.5，24.5；hrms(esi)calcdforc29h31n2o4+(m+h)+471.2278，found471.2283.
化合物9，白色固体，产率85％；熔点：232-233℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，1h)，7.74(s，1h)，7.41(s，1h)，7.21(s，1h)，7.08(d，j＝4.0hz，1h)，7.00-6.94(m，1h)，6.88-6.81(m，1h)，5.29(s，1h)，4.12(s，3h)，4.08(s，3h)，4.05(s，3h)，3.69(s，3h)，3.43-3.33(m，2h)，3.11-3.01(m，1h)，2.77-2.67(m，1h)，2.54(dd，j＝17.2，8.4hz，1h)，2.25-2.14(m，1h)，1.99-1.74(m，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ149.8，149.0，148.8，147.8，129.2，128.9，125.9，125.7，125.6，124.61，124.56，124.2，124.0，106.3，104.5，103.2，103.0，64.4，59.3，56.1，56.0，55.9，55.7，54.0，34.4，31.2，21.3；hrms(esi)calcdforc28h30no4s+(m+h)+476.1890，found476.1898.
实施例39-乙氧甲基娃儿藤碱(化合物10)的合成(方法二)
50ml反应瓶中加入化合物40.2g(0.45mmol)，无水乙醇20ml，氢氧化钾0.05g(0.89mmol)，加热回流8h，旋干，加入适量二氯甲烷和水溶解，分液，有机相经水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，减压脱溶得白色固体0.12g，产率61％，熔点155-156℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，1h)，7.80(s，1h)，7.50(s，1h)，7.32(s，1h)，4.35-4.29(m，1h)，4.11(s，6h)，4.05(s，6h)，3.97(d，j＝9.6hz，1h)，3.76(t，j＝8.4hz，1h)，3.60-3.47(m，3h)，3.26(d，j＝15.2hz，1h)，2.94-2.84(m，1h)，2.61-2.50(m，2h)，2.16-1.98(m，2h)，1.97-1.83(m，1h)，1.81-1.67(m，1h)，1.24(t，j＝6.8hz，4h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.82，148.77，148.23，148.18，129.0，128.1，125.8，124.4，124.0，123.7，105.1，104.2，103.4，103.2，79.3，66.3，64.9，59.4，56.1，56.0，55.9，55.8，54.6，34.1，30.3，21.9，15.4；hrms(esi)calcdforc27h34no5+(m+h)+452.2431，found452.2441.
实施例4娃儿藤碱-9-甲酸(化合物11)的合成(方法三)
100ml反应瓶中加入中间体10.5g(1.31mmol)，乙腈30ml，乙醛酸1.0g(13.51mmol)，室温搅拌反应24h。减压脱溶，用甲醇重结晶。得灰白色固体0.32g，收率56％，熔点225-226℃；1hnmr(400mhz，dmso-d6)δ8.03(s，2h)，7.51(s，1h)，7.40(s，1h)，5.29(s，1h)，4.04(s，3h)，4.03(s，3h)，3.95(s，3h)，3.89(s，3h)，3.71-3.61(m，1h)，3.07-2.83(m，3h)，2.26-2.09(m，1h)，1.92-1.69(m，2h)，1.59-1.39(m，1h)；13cnmr(100mhz，dmso-d6)δ171.2，149.3，149.1，149.0，148.8，125.2，124.9，124.6，124.2，123.7，104.8，104.7，104.6，62.5，56.4，56.4，55.9，55.8，54.2，51.2，31.3，31.0，22.0.hrms(esi)calcdforc25h28no6+(m+h)+438.1911，found438.1913.
实施例5娃儿藤碱-9-甲酸乙酯(化合物12)参照实施例4的操作步骤来完成
化合物12，黄色固体2.0g，产率82％，熔点227-228℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.81(s，2h)，7.40(s，1h)，7.36(s，1h)，5.33(s，1h)，4.18(dd，j＝14.0，7.2hz，2h)，4.11(s，3h)，4.10(s，3h)，4.06(s，3h)，4.03(s，3h)，3.55-3.45(m，2h)，3.31(td，j＝8.4，2.8hz，1h)，2.85(dd，j＝16.8，10.8hz，1h)，2.68(q，j＝8.4hz，1h)，2.31-2.20(m，1h)，2.05-1.95(m，1h)，1.95-1.84(m，2h)，1.75-1.65(m，1h)，1.24(t，j＝7.2hz，3h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ171.5，148.91，148.86，148.7，148.3，127.6，125.7，124.4，124.3，124.0，123.7，104.2，103.6，103.5，103.2，62.2，60.6，56.0，56.0，55.9，55.8，52.5，50.0，33.0，31.5，21.6，14.6；hrms(esi)calcdforc27h32no6+(m+h)+466.2224，found466.2230.
实施例69-羟甲基娃儿藤碱(化合物13)的合成(方法四)
100ml的反应瓶中加入化合物120.5g(1.07mmol)，四氢呋喃50ml，冰水浴中，加入四氢铝锂1.5g(39.5mmol)，搅拌反应1.5h。加水终止反应，缓慢加入少量3mol/l的稀盐酸酸化至澄清，加入二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗涤一次，加入无水硫酸钠干燥，过滤脱溶，用石油醚洗涤后干燥得到黄色固体0.34g，收率77％，熔点231-232℃；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.85(s，2h)，7.32(s，1h)，7.25(s，1h)，5.36(d，j＝6.8hz，1h)，4.75(s，1h)，4.27-4.19(m，1h)，4.14(s，6h)，4.12(s，3h)，4.08(s，3h)，4.05-3.99(m，2h)，3.55(dd，j＝17.2，6.3hz，1h)，3.20(dd，j＝16.8，4.8hz，1h)，2.98(dd，j＝18.0，8.8hz，1h)，2.78-2.65(m，1h)，2.41-2.27(m，1h)，2.14-2.01(m，2h)，2.00-1.88(m，1h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ149.9，149.6，149.4，125.0，124.4，123.8，123.0，122.8，118.6，103.6，103.4，102.8，63.5，62.8，56.5，56.14，56.09，55.6，53.7，31.1，26.3，21.4，20.6；hrms(esi)calcdforc25h30no5(m+h)+424.2118，found424.2124.
实施例7：9-氰基娃儿藤碱(化合物14)的合成(方法五)
35ml的微波反应器中加入中间体10.2g(0.52mmol)，甲酸乙酯20ml，设定t＝100℃，p＝100w，pmax＝250psi，反应1h。减压脱溶，二氯甲烷稀释，3mol/l的盐酸洗涤，水洗，饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，常压柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)，脱溶得白色固体中间体30.2g，收率95％。
50ml的反应瓶中加入中间体30.2g(0.49mmol)，无水甲苯20ml，室温搅拌下加入三氯氧磷0.75g(4.89mmol)，加热回流反应1h，抽滤，滤饼用少量甲醇洗涤，得黄色固体中间体40.2g，收率95％。
100ml的反应瓶中加入中间体40.1g(0.26mmol)，无水二氯甲烷30ml，三甲基氰硅烷0.025g(0.25mmol)，dmap0.04g(0.33mmol)，室温搅拌反应10h至反应液中黄色基本退去。减压脱溶得淡黄色固体，用甲醇洗涤得白色固体0.07g，收率83％；1hnmr(400mhz，cdcl3)δ7.79(s，1h)，7.77(s，1h)，7.26(s，1h)，7.17(s，1h)，5.48(s，1h)，4.12(s，3h)，4.11(s，3h)，4.08(s，3h)，4.05(s，3h)，3.41(dd，j＝15.6，3.6hz，1h)，3.35(td，j＝8.4，3.6hz，1h)，3.04-2.92(m，2h)，2.86(dd，j＝15.6，10.8hz，1h)，2.40-2.30(m，1h)，2.12-1.98(m，2h)，1.86-1.73(m，1h)；13cnmr(100mhz，cdcl3)δ148.2，148.1，147.8，147.7，126.8，124.0，123.6，122.8，121.8，119.9，115.3，102.9，102.5，102.0，101.5，55.00，54.96，54.9，54.7，51.7，50.1，32.4，30.4，20.7.hrms(esi)calcdforc24h26no4(m-cn)+392.1856，found392.1861.
实施例8：常规活体生测法测抗烟草花叶病毒的活性
1、病毒提纯及浓度测定：
病毒提纯及浓度测定参照南开大学元素所生测室编制的烟草花叶病毒sop规范执行。病毒粗提液经2次聚乙二醇离心处理后，测定浓度，4℃冷藏备用。
2、化合物溶液配制：
称量后，原药加入dmf溶解，制得1×105μg/ml母液，后用含1‰吐温80水溶液稀释至所需浓度。
3、活体保护作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。24h后，叶面撒布金刚砂(500目)，用毛笔蘸取病毒液(病毒浓度10μg/ml)，在全叶面沿支脉方向轻擦2次，叶片下方用手掌支撑，接种后用流水冲洗。3d后记录病斑数，计算防效。
4、活体治疗作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，用毛笔全叶接种病毒，病毒浓度为10μg/ml，接种后用流水冲洗。叶面收干后，全株喷雾施药，每处理3次重复，并设1‰吐温80水溶液对照。3d后记录病斑数，计算防效。
5、活体钝化作用：
选长势均匀一致的3-5叶期珊西烟，将药剂与等体积的病毒汁液混合钝化30min后，摩擦接种，病毒浓度20μg/ml，接种后即用流水冲洗，重复3次，设1‰吐温80水溶液对照。3d后数病斑数，计算结果。
6、离体作用：
摩擦接种珊西烟适龄叶片，病毒浓度10μg/ml，接种后用流水冲洗。收干后剪下，沿叶中脉对剖，左右半叶分别浸于1‰吐温水及药剂中，30min后取出，于适宜光照温度下保湿培养，每3片叶为1次重复，重复3次。3d后记录病斑数，计算防效。
抑制率(％)＝[(对照枯斑数-处理枯斑数)/对照枯斑数]×100％
表19位取代的娃儿藤碱衍生物的抗tmv活性
从表1可以看出，9位取代的娃儿藤碱衍生物表现出了优异的抗tmv活性。尤其是9-甲基娃儿藤碱(化合物1)、9-正戊基娃儿藤碱(化合物2)、9-乙氧甲基娃儿藤碱(化合物10)和9-羟甲基娃儿藤碱(化合物13)的抗tmv活性要优于商品化品种病毒唑，其中化合物2和化合物13的活性与娃儿藤碱相当，而化合物10的活性最好，略优于我们课题组创制的高活性品种nk-007，具有极大的开发价值。