本发明属于生物工程技术领域中的微生物发酵方法，涉及一种em菌（产朊假丝酵母菌与植物乳杆菌）的简易规模化生产方法。
背景技术：
随着集约化程度不断提高，大量残饵、粪便排入水体，水体日益恶化，同时工业废水和生活污水的排放也加剧了养殖水体污染、养殖病害泛滥。由酵母菌和乳酸菌组成的em菌，不仅可用于拌料提高饲料的转化利用率，减少排放污染，还可直接泼洒，有效降低亚盐、有机质等污染物含量，净化养殖水体，对于偏盐碱水域还有降ph的效果。目前我国生产em菌的企业大多是个体的小企业，生产条件有限，而用上吨的发酵罐生产，不仅大大增加生产成本，而且提高了企业投产的门槛，很多企业为了降低成本，在开放状态下生产em菌，菌种质量没有保障，产品保质期短。因此，在保证菌剂质量的前提下，发明一种em菌的简易规模化生产技术，使企业在低成本的状态下就能生产出高质量的em菌产品，具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的目的是为微生态制剂企业提供一种em菌（产朊假丝酵母菌与植物乳杆菌）的规模生产方法，在保证有效活菌浓度的前提下简化生产工艺，降低生产成本。
为实现上述目的，本发明公开了一种由产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌组成的em菌规模生产方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）按发酵培养基的体积百分比1%接入一级菌种，搅拌转数100rpm，28℃发酵18h作为二级菌种；所述的发酵培养基指的是糖蜜2.5%，酵母膏0.8%，柠檬酸氢二铵0.2%，乙酸钠0.5%，西红柿汁5%，磷酸二氢钾0.2%，硫酸锰0.02%，ph6.0。所述的一级菌种指的是：体积比为1：1的产朊假丝酵母菌cgmcc2.281：植物乳杆菌cgmcc1.511；
（2）将10倍培养基母液在发酵罐中115℃灭菌20min，将二级菌种和培养基母液均以10%量接入塑料桶，向桶中注满过滤后的自来水，塑料桶用带气阀的盖盖紧，室温25-30℃，发酵1-2d；所述10培养基母液由下列组分按质量百分比组成，糖蜜25%，酵母膏8%，乙酸钠5%，柠檬酸氢二铵2%，西红柿汁50%，磷酸二氢钾2%，硫酸锰0.2%；发酵后植物乳杆菌有效活菌浓度大于3.0×109cfu/ml，产朊假丝酵母菌浓度大于2.5×106cfu/ml，ph低于3.70。
本发明优选的由酵母菌和乳酸菌组成的em菌的规模化生产方法：
（1）一级菌种的制备：将产朊假丝酵母菌cgmcc2.281接种到灭菌ypd培养基中，25℃振荡培养24h，将植物乳杆菌cgmcc1.11接种到装有90%mrs灭菌培养基的玻璃瓶中，30℃静置培养30h；
（2）二级菌种的制备：200l发酵罐加入160l培养基，115℃灭菌20min，降至28℃，按培养基的1%接入一级菌种，搅拌转数100rpm，28℃发酵18h作为二级菌种；
（3）10倍培养基母液的制备：培养基由下列组分按质量百分比组成，糖蜜25%，酵母膏8%，乙酸钠5%，柠檬酸氢二铵2%，西红柿汁5%，磷酸二氢钾2%，硫酸锰0.2%，ph6.0，200l罐装液量160l，115℃灭菌20min；
（4）规模发酵：将（2）中的菌种和（3）制备的培养基各2.5l分装到25l塑料桶中，分装64个桶，往桶中注入20l过滤后的自来水，将带气阀的盖盖紧，室温（25-35℃），培养1-2d；
（5）发酵后取样测酵母菌、乳酸菌、杂菌和ph值；所用的ypd培养基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000ml；mrs培养基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000ml。
本发明优选发酵容器为25l塑料桶，选择该规格桶，发酵后可直接往外销售，无需二次包装。
本发明中酵母菌为产朊假丝酵母是好氧型真菌，乳酸菌为植物乳杆菌是兼性厌氧细菌，利用菌株生长繁殖的特点，将混合菌种同时接种到塑料中，产朊假丝酵母菌生长繁殖消耗罐中余氧为植物乳杆菌生长形成一个厌氧环境，使植物乳杆菌快速繁殖，乳酸菌繁殖产酸又能抑制杂菌生长，这就使得酵母菌和乳酸菌在桶中发酵不易污染。
本发明重点考察了em菌（产朊假丝酵母菌和植物乳杆菌）的简易、规模生产方法，主要解决了降低成本、减少能耗、避免胀气等问题。
本发明公开的em菌（产朊假丝酵母菌与植物乳杆菌）的简易、规模生产方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：
（1）本发明将培养基原料以10倍母液灭菌，以干净的塑料桶为发酵容器室温发酵，大大降低了能耗成本，简化了生产工艺。
（2）本发明的方法用带气阀的塑料桶，解决了em菌在发酵和运输过程中的胀桶问题。
具体实施方式
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中产朊假丝酵母菌（中国普通微生物菌种保藏管理中心：cgmcc2.281），植物乳杆菌（中国普通微生物菌种保藏管理中心：cgmcc1.11），菌种处于公开状态，科学工作者可以向保藏机构索取。所用到的其他试剂均有市售。
实施例1
（a）一级菌种制备：将产朊假丝酵母菌cgmcc2.281接种到灭菌ypd培养基中，25℃振荡培养24h，将植物乳杆菌cgmcc1.11接种到装有90%mrs灭菌培养基的玻璃瓶中，30℃静置培养30h。所用的ypd培养基指的是：酵母膏10.0g、蛋白胨20.0g、葡萄糖20.0g、蒸馏水1000ml；mrs培养基指的是：蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母菌5.0g、葡萄糖5.0g、吐温801.0ml、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、蒸馏水1000ml。
（b）二级菌种的制备：200l发酵罐加入160l培养基，115℃灭菌20min，降至28℃，按培养基的1%接入一级菌种，搅拌转数100rpm，28℃发酵18h作为二级菌种；
（c）10倍培养基母液的制备：培养基由下列组分按质量百分比组成，糖蜜25%，酵母膏8%，乙酸钠5%，柠檬酸氢二铵2%，西红柿汁50%，磷酸二氢钾2%，硫酸锰0.2%，ph6.0，200l罐装液量160l，115℃灭菌20min。
（d）规模发酵：将（b）中的菌种和（c）制备培养基各2.5l分装到25l塑料桶中，分装64个桶，往桶中注入20l过滤后的自来水，将带气阀的盖盖紧，室温培养1-2d。
（e）发酵后取样测酵母菌、乳酸菌、杂菌和ph值，共进行了5个批次试验，结果如表1。
表1em规模发酵各项指标
实施例2
（a）一级菌种制备：将产朊假丝酵母菌cgmcc2.281接种到灭菌ypd培养基中，25℃振荡培养24h，将植物乳杆菌cgmcc1.11接种到装有90%mrs灭菌培养基的玻璃瓶中，30℃静置培养30h。
（b）二级菌种的制备：200l发酵罐加入160l培养基，115℃灭菌20min，降至28℃，按培养基的1%接入一级菌种，搅拌转数100rpm，28℃发酵18h作为二级菌种；
（c）10倍培养基母液的制备：培养基由下列组分按质量百分比组成，糖蜜25%，酵母膏8%，乙酸钠5%，柠檬酸氢二铵2%，西红柿汁50%，磷酸二氢钾2%，硫酸锰0.2%，ph6.0，200l罐装液量160l，115℃灭菌20min。
（d）塑料桶规模发酵：将（b）中的菌种和（c）制备培养基各2.5l分装到25l塑料桶中，分装64个桶，往桶中注入20l过滤后的自来水，将带气阀的盖盖紧，室温培养24h。
（e）发酵罐规模发酵：将（b）中的菌种接种到更大容量的发酵罐中，发酵罐中培养基成分含量为（c）中1/10，28℃发酵24h。
表125l塑料桶和发酵罐发酵结果
结论：
（1）本发明的方法较现有方法每吨节约能耗成本约743元，节约能耗90%以上。
（2）本发明的方法有效活菌浓度与现有方法比较接近，均在十亿级每毫升。
（3）本发明的方法不会出现胀桶现象，而现有方法发酵灌装后，经常出现胀桶现象。