本发明涉及转基因品种领域，尤其涉及一种纯合转基因油菜的制备方法。
背景技术：
目前获得纯合转基因油菜主要有两种途径，一是直接以二倍体油菜为对象，对种子或愈伤组织进行农杆菌侵染转基因，之后对转基因第一代植株进行自交，收获转基因第二代植株，进而不断筛选出纯合转基因植株；二是先通过小孢子培养技术获得单倍体油菜，再对单倍体植株进行转基因，之后通过秋水仙素等化学加倍法对单倍体进行染色体加倍即通过人工染色体加倍，从而获得纯合的转基因植株(如图1所示)。第一种方法耗费大量的时间，至少需要2个世代才能获得目标植株，有些甚至需要多自交几个世代才能获得目标转基因的纯合后代，第二种方法首先需要得到单倍体，而小孢子培养技术操作复杂、费时费力，且成功率较低，秋水仙素等加倍剂毒性大且容易导致嵌合体的产生。
因而，现有的获得转基因纯合后代普遍存在的问题是：方法操作繁琐，不能够一步到位。主要原因有：转基因对象多为杂合二倍体，转入的基因常为单拷贝且为杂合状态，需要至少经过1个世代的自交才能得到纯合转基因后代，且自交得到纯合转基因植株的效率不能达100％，想要得到数量较多的目标转基因个体则至少还需要增加一个生育期，这就导致了试验效率大大降低。或者，小孢子培养操作复杂，单倍体获得率低，染色体加倍剂毒性大，化学加倍率不高，容易得到倍性嵌合体。
因此，急需提供一种新的操作简便、周期短、诱导率高，毒性低的纯合转基因油菜的制备方法，以解决上述问题。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种制备纯合转基因油菜的方法，其制备操作简便、周期短、诱导率高。
为实现上述目的，本发明提供了一种纯合转基因油菜的制备方法，其制备过程包括下述步骤：
供体油菜的选择；
花序浸染法浸染供体油菜；
双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合；
种子收集；
转基因油菜筛选。
本发明通过花序浸染法对供体浸染，将目标转基因转到供体的雌配子中(即仅含有卵细胞)而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，再利用双单倍体诱导系技术，通过受精后诱导系染色体组丢失和母本雌配子染色体组自发加倍，从而获得纯合的双单倍体，即将转基因和基因纯合紧密联系在一起，通过双单倍体诱导系的刺激，使被转基因的母本雌配子基因组发生自发加倍，省去了耗时的自交时间，避免了组织培养及化学加倍等环节，大大加快了育种进程，并通过一系列的转基因油菜筛选步骤确保转基因后代的纯合性和血统的纯正。
进一步的，供体油菜的选择步骤包括选择初花期前的油菜。选择健壮植株上的主花序和第一次分株，选择3-5天后即将开放的花蕾，此发育时期的油菜浸染转化成功率较高，因为大量研究表明农杆菌是在心皮闭合之前进入子房室的。
进一步的，所述花序浸染法浸染供体油菜步骤包括将供体油菜的花序浸染在农杆菌菌液中。具体为将油菜花序浸染在农杆菌菌液中2～5min，套袋保持24小时的避光，连续浸染3～4次，每次间隔24小时。根据油菜花序发育情况，在农杆菌浸染前后进行去雄处理，用人工去雄或者机械化去雄仅留有雌蕊油菜进行后续花粉授粉。
进一步的，所述双单倍体诱导系技术对供体油菜进行后代诱导纯合步骤包括收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，并进行套袋处理。具体为收集双单倍体诱导系的油菜花粉，将油菜花粉涂抹在所述花序浸染法浸染供体油菜的柱头上，授粉后套袋处理，防止与其他花粉交叉污染。重复授粉3～4次，以保证诱导充分获得纯合双单倍体。待花期结束后，去掉花粉纸袋。双单倍体诱导系技术可采用八倍体供体给四倍体授粉、四倍体对二倍体授粉、二倍体对单倍体授粉，优选为八倍体对四倍体授粉，其能得到只含有母本基因组的纯合后代。
油菜种类包括甘蓝型油菜，白菜型油菜和芥菜型油菜，优选采用甘蓝型油菜作为授粉对象，因为甘蓝型油菜的花序中间花蕾着生位置高于开放花朵，开花时花药一般内向开裂或半内向开裂，在进行花序浸染时，比较容易将目标转基因转到供体的雌配子中而非易产生不育的雄配子或受精后的合子中，同时甘蓝型油菜自交亲和性强，自交结实率高，更加激发了双单倍体诱导系效果，大大加快了育种进程。
进一步的，所述转基因油菜筛选步骤包括抗生素鉴定、pcr鉴定、倍性鉴定、分子纯合性鉴定而进行油菜植株筛选。
所述抗生素鉴定步骤包括将收集到的种子播种于抗生素培养基中，通过光照培养筛选出正常的油菜植株，具体的为将收获的种子播种于抗生素培养基中，在室温下光照10～20小时/天，观察植株的抗药性从而筛选出长势正常的油菜植株。
所述pcr鉴定步骤包括采用ctab法提取植株的dna，设计引物，进行pcr检测，筛选出阳性的油菜植株。
所述倍性鉴定步骤包括利用流式细胞仪分析油菜植株的倍性，筛选出正常倍性的油菜植株，具体的为采用流式细胞仪技术对经过pcr鉴定出的阳性转基因植株进行细胞倍性鉴定，筛选出正常倍性的油菜植株。
进一步的，所述pcr鉴定步骤之后还包括表型鉴定步骤，将阳性的油菜植株进行抗生素或病菌接种处理，筛选出具有良好抗药性且正常的油菜植株。
所述分子纯合性鉴定步骤包括将第一代植株进行自交得到第二代植株，对所述第二代植株进行多种性状鉴定，通过观察性状分离现象推测转基因第一代植株的分子纯合性。所述性状鉴定包括抗生素鉴定、表型鉴定、病菌接种鉴定的一种或几种。所述抗生素鉴定和表型鉴定同前述第一代植株的抗生物鉴定和表型鉴定。所述病菌接种鉴定为通过对第二代植株进行病菌接种，通过观察第二代植株是否存在性状分离现象以推测第一代植株的分子纯合性。
本发明提供的一种纯合转基因油菜的制备方法，通过花序浸染法和双单倍体诱导系技术的结合，诱导转基因雌配子的染色体组自发加倍，从而获得纯合双单倍体，大大加快育种进程并通过一系列的转基因油菜筛选步骤确保转基因后代的纯合性和血统的纯正。
附图说明
图1为现有技术采用秋水仙素处理获得转基因植株的制备过程示意图。
图2为本发明采用花序浸染和双单倍体系诱导技术获得转基因植株的制备过程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但不构成对本发明的任何限制。
实验材料：
农杆菌菌株lba4404(质粒为含有bar基因的pcambia1300-bar，北京鼎国昌盛生物技术公司)；
农杆菌菌株eha105(biovector公司)；
大肠杆菌菌株dh5(biovector公司)；
草铵膦(拜耳作物科学公司)；
除草剂basta(拜耳作物科学公司)
转化甘蓝型油菜“3108”和“3221”(成都市农林科学院)；
质粒p1y46(载体为pzp211-rpw8.1，含有外源基因rpw8.1)；
rpw8基因(高亢白粉病的拟南芥中克隆而来)；
转化甘蓝型油菜材料“zx09”(成都市农林科学院)
实施例1
1.1农杆菌悬浮液制备
1.1.1农杆菌感受态的制备
取新鲜的农杆菌株lba4404到lb固体培养基上活化，28℃培养36h后，挑取单菌落接种于10ml的lb液体培养基中，28℃条件下200r/min摇菌，培养至od值为0.5-0.6。将培养好的菌液经过冰浴-离心-加入nacl两次循环后，加入甘油混匀，在-80℃冰箱中保存备用。
1.1.2冻融法转化农杆菌
取感受态农杆菌lba4404解冻，加入质粒pcambia1300-bar，冰浴后迅速取出，在液氮中冷冻，再水浴加入已灭菌的lb液体培养基，震荡培养3-4h。之后离心去上清液，剩余的菌液在lb固体培养基上涂板培养48h，获得被质粒化的lba4404农杆菌菌株。
1.1.3制备农杆菌悬浮液
将含有目标载体的菌种在lb固体培养基平板上划线培养3d，活化菌种。然后将被质粒化的lba4404农杆菌菌株接种于lb液体培养基中，28℃条件下，200r/min震荡培养至od值在1-2，4000r/min离心10min，收集菌体至悬浮液。
1.2农杆菌介导花序浸染法转基因
将油菜种子播种于实验基地，每个材料至少留20株，保证水肥供给并做好病虫害防治，在自然条件下生长，待油菜抽薹快至初花期前进行浸花遗传转化。
选择初花期前的油菜，选择健壮植株上的主花絮和第一次分株，选择3-5天后即将开放的花蕾。浸花前一天给试验油菜浇透水。将油菜花序倒置，使花蕾朝下浸润在农杆菌悬浮液中，保持1-2min，取出悬浮液中花序，然后用硫酸纸袋套住花序保湿。配置新的悬浮液，24h后将纸袋打开进行进行第2次侵染，套袋。24h后进行第3次浸染，套袋24h后去掉纸袋。根据油菜花序发育情况，在农杆菌浸染前后进行人工去雄。浸染后悉心照料油菜，保持水分充足。同时以不去雄的油菜为对照，按相同的方法和时间进行花序浸染处理，并套袋自交，并收获种子，用于统计花序浸染法转基因对甘蓝型油菜“3108”和“3221”的转化率。
1.3诱导纯合后代
取新鲜的油菜双单倍体诱导系花朵，将花粉均匀涂抹在农杆菌浸染过的油菜花柱头上，授粉后套袋，防止田间其他花粉污染。重复授粉3-4次。待花期结束，角果长出后及时去掉硫酸纸袋，成熟期收到种子，获得转化第一代。保证获得的第一代种子至少有1000粒。
该双单倍体诱导系为自主培育的八倍体油菜，前期大量研究证明，用该八倍体油菜给四倍体甘蓝型油菜授粉，能得到只含有母本基因组的纯合后代，即产生了双单倍体后代。经诱导系授粉后的甘蓝型油菜结实率较低，通常在20％-30％，而诱导率则较高，受母本基因型影响，纯合后代的诱导率一般在40％-99％。
1.4抗生素鉴定
分别从甘蓝型油菜“3108”和“3221”植株上收获3865和3547颗第一代种子。在除草剂basta的最低致死浓度下0.5mg/l的草铵膦对第一代种子进行抗生素筛选。对油菜种子进行表面消毒处理播种于含有0.5mg/l草铵膦的ms培养基上，培养条件为25℃、光照16h/d。将存活的幼苗移栽至温室中进行培养。待植株长至4-5片真叶时，用含有1000mg/l草铵膦的basta进行大田喷洒试验，检测第一代植株对除草剂的抗生素。结果发现未转化对照和阴性植株的叶片皱缩、枯萎，正常转基因植株表现正常，叶片没有明显变化。通过抗生素筛选共获得22株阳性“3108”第一代植株和15株阳性“3221”第一代植株。
1.5pcr鉴定
采用ctab法提取阳性第一代植株的基因组dna，以质粒pcambia1300-bar为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，利用pcr检测阳性植株中bar基因。根据pc1300-bar载体序列设计引物，引物序列为：
引物1(上游)：5’-ccttcgcaagacccttcctc-3’
引物2(下游)：5’-aaacccacgtcatgccagtt-3’
pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分析。结果发现22株“3108”第一代1植株中有15株扩增出594bp大小的目的片段，而阴性对照及其余7株未扩增出相应片段；15株“3221”t1植株中有12株扩增出了目的片段，阴性对照和其余3株未扩增出相应片段；表明bar基因已经进入到这些阳性植株的基因组中。
1.6倍性鉴定
为了检测八倍体油菜给四倍体甘蓝型油菜授粉产生的后代为正常四倍体甘蓝型油菜，采用流式细胞仪技术对经过pcr鉴定出的阳性转基因植株进行细胞倍性鉴定。以母本油菜为参考，筛选出正常四倍体的植株。流式细胞仪操作通过制备细胞核悬浮液，细胞核悬液dna特异性染色，核悬液的上机测定，由随机配套的accuricsoftware软件进行分析。根据测定结果，主峰峰值为480000道左右的单株鉴定为正常四倍体甘蓝型油菜，主峰峰值为960000道左右的鉴定为八倍体油菜。
采用dna指数计算染色体数目，di在0.99～1.01之间的植株即为四倍体，此处对照为母本四倍体甘蓝型油菜。di计算公式为(其中g0/g1表示细胞间期)：
结果发现15株“3108”第一代植株中发现1株混倍体，其余14株均为正常四倍体，12株阳性“3221”第一代植株全部为四倍体。
1.7纯合性鉴定
对第一代植株进行自交，收获第二代种子。按株系收种，按株系播种，取新鲜幼嫩叶片提取基因组dna，进行pcr扩增，检测单株中是否存在bar基因，具体操作如步骤1.5。同时喷施含1000mg/lppt的basta除草剂，4天后第二次喷施相同剂量的药液，喷药后4-7天内统计抗除草剂植株和感除草剂植株数。抗生素植株能正常生长，阴性植株则会表现出失水皱缩或枯黄色。如果第二代出现性状分离现象，则表明其亲本第一代为杂合植株，如未发生性分离则为纯合转基因后代。
通过分析发现14株“3108”的t1代中有2株的t2代发生抗生素分离，另12株后代均表现为抗草铵膦；12株“3221”的t1代中有2株发生抗生素分离，另10株后代均表现为抗草铵膦。结果表明，通过本发明分别得到12株纯合稳定的转bar基因“3108”植株，和10株纯合稳定的转bar基因“3221”植株。
通过以上鉴定表明，成功获得了纯合转bar基因的甘蓝型油菜后代，转化率分别为0.31％(“3108”)和0.28％(“3221”)。虽然转化率不是特别高，但该发明操作简单，节约人力物力，不需要繁琐的组织培养和继代培养，且大大缩短育种进程，只需要1-2代即可得到纯合转基因植株。
实施例2
1.1农杆菌悬浮液制备
1.1.1农杆菌感受态的制备
取新鲜的农杆菌eha105饱和菌液到lb固体培养基上活化，28℃培养36h后，挑取单菌落接种于10ml的lb液体培养基中，28℃条件下200r/min摇菌，培养至od值为0.5-0.6。将培养好的菌液经过冰浴-离心-加入nacl两次循环后。
1.1.2冻融法转化农杆菌
取感受态农杆菌eha105解冻，加入质粒p1y46，冰浴后迅速取出，在液氮中冷冻，再水浴加入已灭菌的lb液体培养基，震荡表达3-4h。之后离心去上清液，剩余的菌液在lb固体培养基上涂板培养48h，获得被质粒化的eha105农杆菌菌株。
1.1.3制备农杆菌悬浮液
将含有目标载体的菌种在lb固体培养基平板上划线培养活化菌种。然后将农杆菌单克隆接种于lb液体培养基中，28℃条件下，200r/min震荡培养至od值在1-2。4000r/min离心10min，收集菌体至悬浮液
1.2农杆菌介导花序浸染法转基因
将油菜种子播种于实验基地，至少保留20株，保证水肥供给并做好病虫害防治，在自然条件下生长，待油菜抽薹快至初花期前进行浸花遗传转化。
选择初花期前的油菜，选择健壮植株上的主花絮和第一次分株，选择3-5天后即将开放的花蕾。浸花前一天给试验油菜浇透水。将油菜花序倒置，使花蕾朝下浸润在农杆菌悬浮液中，保持1-2min，取出悬浮液中花序，然后用硫酸纸袋套住花序保湿。配置新的悬浮液，24h后将纸袋打开进行进行第2次侵染，套袋。24h后进行第3次浸染，套袋24h后去掉纸袋，根据油菜长势看是否进行授粉。根据油菜花序发育情况，在农杆菌浸染前后进行人工去雄。浸染后悉心照料油菜，保持水分充足。同时以不去雄的油菜为对照，按相同的方法和时间进行花序浸染处理，并套袋自交，并收获种子，用于统计花序浸染法转基因对甘蓝型油菜“zx09”的转化率。
1.3诱导纯合后代
取新鲜油菜双单倍体诱导系的花朵，将花粉均匀涂抹在农杆菌浸染过的油菜花柱头上，授粉后套袋，防止田间其他花粉污染。重复授粉3-4次。待花期结束，角果长出后及时去掉硫酸纸袋，成熟期收到种子，获得转化第一代。保证获得的第一代种子至少有1000粒。
该双单倍体诱导系为本单位自主培育的八倍体油菜，前期大量研究证明，用该八倍体油菜给四倍体甘蓝型油菜授粉，能得到只含有母本基因组的纯合后代，即产生了双单倍体后代。经诱导系授粉后的甘蓝型油菜结实率较低，通常在20％-30％，而诱导率则较高，受母本基因型影响，纯合后代的诱导率一般在40％-99％。
1.4抗生素鉴定
(1)配置含有50mg/l、100mg/l、150mg/l、200mg/l、250mg/l、300mg/l、350mg/l和400mg/l的卡那霉素溶液，用来筛选野生型油菜种子的最低致死浓度。筛选出的适宜浓度为250mg/l卡那霉素溶液。
(2)从zx09植株上收获经过浸染诱导的种子共4081颗，将种子播种在卡那霉素溶液中，至种子露白后移出并清洗干净，在25℃、正常光照条件下生长，40h筛选出具有绿色叶片的幼苗，移栽至营养土中生长。共得到13株成活的叶片绿色的油菜幼苗。
1.5pcr鉴定
取成活的叶片绿色的油菜幼苗，用ctab法提取基因组dna，以质粒p1y46为阳性对照，以未转化植株为阴性对照，进行基因特异的pcr扩增，进一步筛选阳性转基因油菜株系。pcr扩增引物序列为：
引物1(上游)：5’-caggatccatgccgattggtgagcttgcgata-3’
引物2(下游)：5’-cgcggatccagctcttattttactacaagcaga-3’
pcr产物采用1％琼脂糖凝胶电泳分析。最终得到10个含有外源基因的转基因油菜植株。
1.6表型鉴定
对筛选出的转基因植株进行接种油菜霜霉菌处理，将油菜霜霉病真菌稀释至一定浓度，对油菜叶片进行喷菌处理，接菌后置于20℃正常光照条件下生长，保持土壤湿度，在接菌后8天内对油菜植株进行表型观察鉴定，统计转基因植株对霜霉菌的反应情况。结果发现非转基因甘蓝型油菜叶面出现黄色病斑，呈蔓延趋势，叶背出现白色的菌丝；而转基因植株发病情况比对照要好些，其中有8株表现出良好的抗生素，叶片上未观察到霜霉病的发生，有2株油菜叶面出现少量黄色病斑，进一步证明rpw8.1基因成功转入油菜基因组中。
1.7倍性鉴定
为了检测八倍体油菜给四倍体甘蓝型油菜授粉产生的后代为正常四倍体甘蓝型油菜，采用流式细胞仪技术对经过pcr鉴定出的阳性转基因植株进行细胞倍性鉴定。以母本油菜为参考，筛选出正常四倍体的植株。流式细胞仪操作通过制备细胞核悬浮液，细胞核悬液dna特异性染色，核悬液的上机测定，由随机配套的accuricsoftware软件进行分析。根据测定结果，主峰峰值为480000道左右的单株鉴定为正常四倍体甘蓝型油菜，主峰峰值为960000道左右的鉴定为八倍体油菜。
采用dna指数计算染色体数目，di在0.99～1.01之间的植株即为四倍体，此处对照为母本四倍体甘蓝型油菜。di计算公式为(其中g0/g1表示细胞间期)：
结果发现此处对照为母本四倍体甘蓝型油菜结果发现10株阳性转基因植株全部为四倍体。
1.8纯合性鉴定
对t1代植株进行自交，收获t2代种子。按株系收种，按株系播种，观察株系内植株长势是否一致，在4-5叶期进行霜霉菌接种，观察株系内抗生素是否一致。同时，提取幼嫩油菜叶片的基因组dna，进行pcr特异基因扩增，检测株系内每个单株中是否含有转基因，具体实施方法同步骤1.5。通过以上鉴定发现有1个株系发生了性状分离，另9个株系未发生性状分离，株系内植株长势一致、均具有抗油菜霜霉菌的能力，且pcr扩增结果表明其基因组中含有被转基因。
综上所述，通过本方法，从4081颗油菜种子成功获得9株纯合转基因油菜，转化率为0.22％。虽然转化率不是特别高，但该发明操作简单，节约人力物力，不需要繁琐的组织培养和继代培养，且大大缩短育种进程，只需要1-2代即可得到纯合转基因植株。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细的说明，但本发明并不局限于以上揭示的实施例，而应当涵盖各种根据本发明的本质进行的修改、等效组合。