一种多酚多糖植物RNA的提取方法与流程

本发明涉及分子生物技术领域，具体是指一种多酚多糖植物rna的提取方法。

背景技术：

rna的提取是分子生物学的基本内容之一，高质量的rna是进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。rt-pcr、northern、real-timepcr、cdna文库构建等分子生物学研究的展开首先必须获得纯度高、完整性好的总rna。植物组织特别是高等植物组织细胞内外组成成分的复杂多样性，使得植物组织rna的提取比其他生物材料更加困难。对于梨属、柑橘属、中草药的多种植物而言，分离纯化组织中的rna难度较大，因此严重阻碍了其分子生物学研究的进展。而富含酚类化合物和多糖类物质、含有大量已知和尚未确定的次生代谢产物以及内源rnase含量较高是这些植物rna提取的主要障碍。许多含有大量多酚和多糖的植物，在匀浆时酚类化合物极易氧化成醌类物质，与rna不可逆的结合，从而影响rna的分离纯化。多糖的许多理化性质与rna相似，在提取过程中与rna共沉淀，也使其难以分离。

目前，已经发展了许多rna提取的方法，如胍盐法、sds法、苯酚法和十六烷基三甲基溴化胺法等。这些方法的核心试剂为异硫氰酸胍、sds、ctab等。异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，作为强变性剂使核酸-蛋白结构发生变化，并有效解离蛋白和核酸的复合体，最终释放出核酸。sds是一种离子去污剂，能从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖。ctab作为离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使rna游离出来。各种提取rna的方法相似，首先彻底破碎植物细胞的细胞壁，接着使核蛋白复合体中的蛋白质充分变性，实现核蛋白与核酸的分离；同时抑制内源和外源rna酶的活性，防止rna受污染而降解，然后将rna与dna、蛋白质、多酚、多糖等物质分离，最后检测rna的质量。因此，能否有效去除多糖、酚类化合物的干扰是提取高质量植物rna成败的关键。

但是，上述的各项提取方法所需的操作都较为繁琐，提取的时间长，且提取的rna的完整性不高；同时，上述的各项方法采用了酚、氯仿等有毒刺激性试剂，对操作人员的操作安全存在这隐患，不利于保护操作人员的人身安全。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述问题，提供了一种多酚多糖植物rna的提取方法，不需使用酚、氯仿等有毒的刺激性试剂，更好的保护了操作人员的安全，而且操作简单，提取时间短，提取的rna完整性好，大大提高了rna的提取速度与提取质量。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种多酚多糖植物rna的提取方法，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.3-0.7倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

作为优选，步骤(1)中植物组织的重量为50-100mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入500-1000μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置10min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

作为优选，步骤(2)中所述的bufferb的添加量为500-1000μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为8-10次，且离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为6-10min。

作为优选，步骤(3)中的离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为1min。

作为优选，步骤(4)中加入的bufferc的量为200-400μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为0.5-1min。

作为优选，步骤(5)中的dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

作为优选，步骤(7)中bufferd的添加量为500-700μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为0.5-1min。

作为优选，步骤(9)中滴入的rnase-freeddh2o量为30-50μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为2min。

本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：

本发明不需使用酚、氯仿等有毒的刺激性试剂，更好的保护了操作人员的安全，而且操作简单，提取时间短，提取的rna完整性好，大大提高了rna的提取速度与提取质量。

附图说明

图1为本发明所提取红叶李花药的rna的电泳条带图。

图2为本发明所提取樟树叶的rna的电泳条带图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一种多酚多糖植物rna的提取方法，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

植物组织的重量为50mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入500μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置10min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

所述的bufferb的添加量为500μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为8次，且离心的转速为10000rpm，离心时间为6min。

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.3倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

离心的转速为10000rpm，离心时间为1min。

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

加入的bufferc的量为200μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

bufferd的添加量为500μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

滴入的rnase-freeddh2o量为30μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为2min。

通过上述方法得到的rna溶液，需要在-20℃的温度环境下进行保存备用。

实施例2

一种多酚多糖植物rna的提取方法，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

植物组织的重量为100mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入1000μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置10min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

所述的bufferb的添加量为1000μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为10次，且离心的转速为12000rpm，离心时间为6-10min。

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.7倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

离心的转速为12000rpm，离心时间为1min。

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

加入的bufferc的量为400μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为12000rpm，离心时间为0.5-1min。

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

bufferd的添加量为700μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为12000rpm，离心时间为1min。

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

滴入的rnase-freeddh2o量为50μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为2min。

通过上述方法得到的rna溶液，需要在-20℃的温度环境下进行保存备用。

实施例3

一种多酚多糖植物rna的提取方法，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

植物组织的重量为50-100mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入500-1000μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置10min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

所述的bufferb的添加量为500-1000μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为8-10次，且离心的转速为10000-12000rpm，离心时间为6-10min。

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.3-0.7倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

离心的转速为11000rpm，离心时间为1min。

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

加入的bufferc的量为300μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为11000rpm，离心时间为0.5-1min。

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

bufferd的添加量为600μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为11000rpm，离心时间为0.75min。

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

滴入的rnase-freeddh2o量为40μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为11000rpm，离心时间为2min。

通过上述方法得到的rna溶液，需要在-20℃的温度环境下进行保存备用。

实施例4

本实施例是对红叶李花药总rna的提取过程，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

植物组织的重量为50mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入500μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置5min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

所述的bufferb的添加量为500μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为8次，且离心的转速为12000rpm，离心时间为10min。

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.3倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

离心的转速为10000rpm，离心时间为1min。

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

加入的bufferc的量为200μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

bufferd的添加量为500μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

滴入的rnase-freeddh2o量为30μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为2min。

通过上述方法得到的rna溶液，需要在-20℃的温度环境下进行保存备用。

吸取4μlrna溶液进行电泳，结果如图1所示。从图1中可以看出采用本发明所提取的rna电泳条带明亮、清晰，没有因为rna降解而形成的弥散条带。

实施例5

本实施例是对樟树叶片总rna的提取过程，包括以下步骤：

(1)将植物组织碾磨后放入离心管中，向离心管加入buffera进行匀浆处理，得到匀浆液；

植物组织的重量为50mg，该植物组织取出后需要放入液氮中迅速进行碾磨得到植物组织粉末，接着将植物组织粉末放入离心管中并加入700μlbuffera，通过涡旋振荡器进行剧烈振荡以使其混合均匀，最终将混合物在室温中静置5min得到匀浆液；所述buffera的组分包括ph值为8.0的tris-hcl、ph值为8.0的edta、nacl、sds、pvp以及β-巯基乙醇，其中ph值为8.0的tris-hcl的浓度为100mm，ph值为8.0的edta的浓度为50mm，nacl的浓度为500mm，每100ml的buffera中还含有1克sds、2克pvp以及2mlβ-巯基乙醇；所述β-巯基乙醇在buffera使用前加入。

(2)向匀浆液中加入bufferb，并颠倒混匀后对其进行离心；

所述的bufferb的添加量为500μl，且该bufferb由0.75m的醋酸钾和4m的盐酸胍溶液以3：1的比例调配而成；所述颠倒混匀的次数为8次，且离心的转速为12000rpm，离心时间为10min。

(3)将步骤(2)中的上清液取出并加入新的离心管中，并缓慢加入0.3倍无水乙醇，轻柔混匀后将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱中进行离心，倒掉与该吸附柱配套的收集管中的废液；

离心的转速为12000rpm，离心时间为1min。

(4)向吸附柱中加入bufferc，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

加入的bufferc的量为200μl，该bufferc主要由3m盐酸胍和60％的无水乙醇组成；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(5)向吸附柱中央加入dnasei工作液，并在室温中静置；

dnasei工作液的加入量为80μl，且该dnasei工作液的配制过程为：首先，向新的离心管中分别加入20μldnasei、8μl10×dnaseibuffer以及52μlrnase-freeddh2o，接着将其轻柔混匀即可；所述的静置时间为15min。

(6)再重复步骤(4)一次后进行步骤(7)；

(7)向吸附柱中加入bufferd，并在离心后取出吸附柱，倒掉与该吸附柱匹配的收集管中的废液，再将吸附柱放回收集管中；

bufferd的添加量为500μl，该bufferd为80％的无水乙醇；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为0.5min。

(8)重复步骤(7)一次，接着将吸附柱放置在室温下静置，直至无水乙醇完全挥发；

(9)向吸附柱中吸附膜的中间部位悬空滴加rnase-freeddh2o，在室温中静置后进行离心，即得到rna溶液。

滴入的rnase-freeddh2o量为30μl；所述静置的时间为2min；所述离心的转速为10000rpm，离心时间为2min。

通过上述方法得到的rna溶液，需要在-20℃的温度环境下进行保存备用。

吸取4μlrna溶液进行电泳，结果如图2所示。从图2中可以看出采用本发明所提取的rna电泳条带明亮、清晰，没有因为rna降解而形成的弥散条带。

以上对本发明的具体实施案例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定的实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。