一种与烤烟品种TT7白粉病抗性紧密连锁的分子标记及其用途的制作方法

本发明涉及一种与烤烟品种tt7(台烟7号)白粉病抗性紧密连锁的分子标记及其用途，属于农业生物技术领域。

背景技术：

烟草白粉病俗称“上灰”、“下霜”、“上硝”，该病多危害成熟老叶，由下向上发展。叶片发病，初为近圆形的黄褐色小斑，后斑上现白色粉状小点，使病斑呈毯状，斑块扩大，白粉布满整个叶片，病叶先褪绿变褐，后枯死。严重时为害嫩茎，病茎上也布满白粉。病叶烘烤后薄如纸，色暗锈褐色，丧失经济价值。白粉病在中国各烟区均有发生，其中以华南、西南和华中烟区最为普遍，危害也较重。目前烟草白粉病的防治主要以化学防治为主，极易造成农药残留，是当前烟叶农残超标的主要因素。

培育抗病烟草新品系是防治烟草白粉病最经济、安全和有效的方法。由于传统育种对抗白粉病性状的选择主要依靠田间自然发病和人工接种，这样的选育方法不仅受植株生长发育阶段和环境条件的影响，而且耗时、耗力。此外，目前烟草白粉病仅依赖于接种后抗性鉴定和经验育种，抗性很容易丢失，没有高效的分子辅助选择手段。分子标记是一种快速、简便、成本低廉并可在烟草生长早期进行无损检测的一种技术,但目前还没有对白粉病抗性基因特异性共显性分子标记的报道。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是：提供一种与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记，可在苗期白粉病未发病前对烟草育种后代材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，可明确后代单株基因型，有效区分纯合单株和杂合单株，无需自交一代，显著提高育种效率，缩短育种周期，快速、简便、成本低廉并可在烟草生长早期进行无损检测烟草白粉病的一种技术，填补了烟草白粉病分子标记辅助选择育种技术的空白。

本发明的技术方案是：一种与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记，所述的分子标记序列为seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4。

扩增与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记对应的引物对，所述的引物对为s1-f1/1-r、r1-f1/1-r、s2-f1/2-r和r2-f1/2-r，其中，s1-f1的序列为：5’-aattaactttggtccaaactag-3’，r1-f1的序列为：5’-aattaactttggtccaaactta-3’,1-r的序列为：5’-ttagatgtgtgatagggtcagttag-3’,s2-f1的序列为：5’-ggtgctgctctggatagtcag-3’，r2-f1的序列为：5’-ggtgctgctctggatagtctc-3’，2-r的序列为：5’-acaatctaaaagtgtagtttggtgg-3’。

一种与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记，所述的分子标记是由上述的引物对以烟草白粉病抗性烟草基因组或烟草白粉病感病烟草基因组dna为模板经pcr扩增得到。

由上述引物对扩增得到的分子标记含有seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3或seqidno.4所示序列。

一种载体，含有本发明的分子标记。所述的重组载体是插入有本发明的分子标记的表达载体或者克隆载体。含有前述重组载体的重组细胞。

一种与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记的检测方法，根据所述的分子标记的核苷酸序列设计引物，以被检测烟草基因组dna为模板进行扩增，并判断扩增产物中是否存在该分子标记。

鉴定后代抗病性的结果，seqidno.2和seqidno.4同时出现特异性扩增片段，而seqidno.1和seqidno.3没有条带，2个抗白粉病基因同时存在且纯合，该后代植株具有白粉病抗性；seqidno.1和seqidno.3中有一个或者同时出现特异性扩增片段，则该后代植株感白粉病。

本发明的有益效果：

本发明中通过两个与烟草白粉病抗性共分离的分子标记。以抗白粉病烟草tt7和感病烟草k326杂交构建f1、f2及bc群体，利用连锁定位在定位区段内开发分子标记s1、r1和s2、r2，与白粉病抗病表型共分离。使用这4对标记对后代进行pcr扩增，可有效区分杂合基因型，属共显性分子标记，可追踪烟草tt7中的抗白粉病基因在后代中的遗传情况，明确后代的基因型，并可用于白粉病抗病后代筛选。在烟草育种过程中，利用本发明公开的4对分子标记，可在苗期白粉病未发病前对烟草育种后代材料中的抗白粉病基因进行分子标记辅助选择，可明确后代单株基因型，有效区分纯合单株和杂合单株，无需自交一代，显著提高育种效率，缩短育种周期。

1.鉴定结果准确、稳定，可重复性高。

传统育种对抗白粉病性状的选择主要依靠田间自然发病和人工接种，这样的选育方法不仅受植株生长发育阶段和环境条件的影响，而且耗时、耗力。利用本发明的分子标记方法,在苗期就可通过引物扩增的特异条带,预测烟草的白粉病抗性，相比接种鉴定方法，其检测方便快速,不受环境影响，可重复性高。

2.可显著提高选择效率,缩短育种进程。

由于白粉病抗性由两对隐性基因控制，在后代选择过程中必须为隐性纯合才能表现出抗性，且其后代分离比例为感：抗的比率15:1，以此在常规育种过程中其抗性极易丢失。利用该发明提供的共显性分子标记可有效区分杂合基因型，无需自交一代，可显著选择效率，缩短育种进程。

通过检测与白粉病抗性基因连锁的分子标记,即可以预测烟草植株的白粉病抗性,用于烟草品种/品系或杂交/回交后代的基因型检测,以判断该品种/品系或杂交/回交后代是否具有白粉病抗性基因型,进而快速筛选抗白粉病品种/品系或杂交/回交后代用于烟草育种,大大提高抗白粉病烟草的选择效率,获得含有白粉病抗性基因的烟草材料。

附图说明

图1为以不同的正向引物和反向引物组合对抗病和感病材料的基因组dna进行pcr扩增的结果；

图2为tt7与k326杂交f2代部分单株的基因型鉴定，第1泳道为100bpladdermarker，第2泳道为感病亲本k326，第3泳道为抗病亲本tt7，第4-25泳道为f2代部分感病单株；

图3为tt7与k326杂交f2代部分单株的基因型鉴定，第1泳道为100bpladdermarker，第2-17泳道为f2代部分感病单株，第18-23泳道为f2代部分抗病单株。

图4为抗病亲本和感病亲本(以tt7和nc82为例)常规回交改良育种(a)和分子标记辅助回交改良(b)过程图。

具体实施方式

一、分子标记引物设计

以抗白粉病烟草tt7和感病烟草k326杂交构建f1、f2及bc群体，利用连锁定位在定位区段内开发分子标记s1、r1和s2、r2，与白粉病抗病表型共分离。

根据抗感材料中分子标记s1、r1和s2、r2之间的差异设计引物，反向引物固定为1-r和2-r，正向引物分别为s1-f1、f2、f3，r1-f1、f2、f3和s2-f1、f2、f3，r2-f1、f2、f3引物的脱氧核糖核苷酸序列、退火温度及扩增片段长度见下表：

二、烟草dna提取

用常规ctab法分别提取烟草基因组dna,方法为:

(1)称取烟草叶片100mg左右置于2ml离心管中,加液氮用特制研棒研磨至粉末状；

(2)加入900μl预热到65℃的2×ctab缓冲液(2％ctab，100mmtris-hclph8.0，20mmedtaph8.0,1.4mnacl),65℃水浴20分钟后取出冷却；

(3)加入200μl氯仿-异戊醇混合液(24:1)摇匀，4℃，7500rpm离心10min后转移上清至1.5mlep管；

(4)再次加入200μl氯仿-异戊醇混合液(24:1)摇匀，4℃，7500rpm离心10min；

(5)取出上清置于新的ep管中,加入1/10体积3mph5.2醋酸钠和等体积异丙醇,摇匀后4℃离心20min(12000rpm)；

(6)弃上清,用75％乙醇洗涤两次后,置于超净工作台中干燥,用含rnase的te缓冲液融解,放置-20℃保存备用。

(7)取2μldna样品在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，120v电压电泳20分钟，检测dna的质量；取1μl样品用nanodrop检测dna浓度和od值。

三、pcr扩增

pcr反应体系20ul：

pcr反应循环程序为：

72℃延伸10min；(4)pcr产物用2％的琼脂糖凝胶，在120v电压下电泳25min，并在凝胶电泳成像系统下观察条带的情况。

四、分子标记pcr扩增及片段测序

对上述扩增到的320bp的片段和354bp的片段，分别连接到puc18载体中，获得重组载体。将该重组载体转化到大肠杆菌dh5α中，挑单克隆，培养获得重组细胞。从重组细胞中提取质粒，所述质粒即重组载体，采用m13通用引物对克隆片段进行测序，结果显示，s1-f1/1-r标记在感病材料中扩增到的序列为(seqidno.1)，r1-f1/1-r标记在抗病病材料中扩增到的序列为(seqidno.2)，s2-f1/2-r标记在感病材料中扩增到的序列为(seqidno.3)，r2-f1/2-r标记在抗病病材料中克隆到的序列为(seqidno.4)。上述克隆、转化、培养、质粒提取等步骤参考《分子克隆实验指南第三版》，黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版。

引物筛选实验

分别以抗病烤烟材料tt7和感病烤烟材料k326的dna为模板，以不同的正向引物和反向引物组合，进行pcr扩增，结果如图1。由图中扩增条带可以看出，12对引物在抗感材料中条带特异，可以准确区分鉴定抗病和感病材料，选择引物对r1-f1/1-r、s1-f1/1-r、r2-f1/2-r、s2-f1/2-r继续后续实验。

f2代群体白粉病抗性鉴定：

苗期采用沉降法对tt7和k326构建的包含580个单株的f2群体进行白粉病表型鉴定，接种10天后单株调查抗性情况，经鉴定群体内感病单株为545株，抗病单株为35株，符合15:1的分离比率，证明tt7材料的白粉病抗性受双隐性基因控制(分别以a基因和b基因表示)。

利用分子标记鉴定f2代群体单株基因型：

使用r1(r1-f1/1-r)、s1(s1-f1/1-r)、r2(r2-f1/2-r)、s2(s2-f1/2-r)引物对群体内不同单株的dna进行pcr扩增，结果如图3，s1引物扩增a基因型，r1引物扩增a基因型，s2引物扩增b基因型，r2引物扩增b基因型。抗感病材料杂交后，f1代基因型为aabb，用四对引物均能扩增出特异条带。f2群体中抗病材料只有一种基因型aabb，扩增条带情况为r1和r2有特异性条带，s1和s2无条带。感病材料有8种基因型：aabb，扩增条带情况为s1和s2有特异性条带，r1和r2无条带；aabb，扩增条带情况为s1、r1和s2有特异性条带，r2无条带；aabb，扩增条带情况为r1和s2有特异性条带，s1和r2无条带；aabb，扩增条带情况为s1、r2和s2有特异性条带，r1无条带；aabb，s1、r1、s2和r2都有特异性条带；aabb，扩增条带情况为r1、s2和r2有特异性条带，s1无条带；aabb，扩增条带情况为s1和r2有特异性条带，r1和s2无条带；aabb，扩增条带情况为s1、r1和r2有特异性条带，s2无条带。

利用分子标记鉴定f2代单株抗病性：

鉴定后代抗病性的结果分析，使用4个分子标记同时对烟草植株dna进行扩增，抗病对照tt7只有r1和r2出现特异性扩增片段，而s1和s2没有条带，感病亲本只有s1和s2出现特异性扩增片段，而r1和r2没有条带，表明pcr扩增正常，然后按如下标准判断烟草f2单株的白粉病抗性：只有r1和r2出现特异性扩增片段，而s1和s2没有条带，说明2个抗白粉病基因同时存在且纯合，该后代植株具有白粉病抗性。只要s1或者s2中有一个能扩增出条带或者同时出现扩增条带，都说明该后代植株是感白粉病病。

分子标记在烟草白粉病抗性回交改良中的用途

对抗感白粉病的亲本配制的回交后代(如bc1f1、bc2f1、bcnf1)种子,常规方法育苗,烟苗5-6片叶时,采用ctab等方法提取基因组dna,以已知抗白粉病的烟草品种tt7和已知感白粉病的烟草品种k326为对照采用分子标记r1(r1-f1/1-r)、r2(r2-f1/2-r)引物对,进行的pcr扩增,pcr反应体系和pcr反应程序同实施例1，对pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳,照胶并记录。

抗病对照r1引物有320bp特异扩增条带,且r2引物有354bp特异扩增条带；感病对照r1引物和r2引物均无扩增条带，表明pcr扩增正常。然后按照如下的标准判断烟草bcnf1后代是否携带白粉病抗性基因:r1引物有320bp特异扩增条带,且r2引物有354bp特异扩增条带,初步判断该单株携带2个抗白粉病基因；r1或者r2引物只有一个有特异扩增条带，或者两个引物都没有扩增条带，初步判断该单株不完全携带或不携带抗白粉病基因。结果表明:抗白粉病的烟草品种tt7r1引物有320bp特异扩增条带,且r2引物有354bp特异扩增条带；感白粉病的烟草品种k326r1引物和r2引物均无扩增条带，筛选出的同时携带2个抗白粉病基因的单株可与k326继续回交或供进一步育种利用，表明该分子标记可用于烟草白粉病抗性回交改良。与常规回交改良育种(图4,以tt7和nc82为例)相比，分子标记辅助选择育种(图4,以tt7和nc82为例)可利用分子标记直接对bcnf1单株进行基因型鉴定，选择同时携带2个白粉病抗性基因的单株，不需自交一代，改良进度可缩短一倍，且省去了自交后代单株白粉病接种鉴定工作。利用分子标记鉴定抗性具有以下优点:可显著缩短育种进程；检测准确率达100％；减少人为接种病害对其他实验材料的污染；减少人为接种病害对温室条件的需求；同一个后代单株的dna,可用于其他分子标记的检测,可用于其他性状的分子标记辅助选择。

序列表

<110>贵州省烟草科学研究院

<120>一种与烤烟品种tt7白粉病抗性紧密连锁的分子标记及其用途

<160>18

<210>1

<211>320

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>1

aattaactttggtccaaaccaggcacatttaactccacagaatcaggaaaattttgattt60

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<210>2

<211>320

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>2

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<210>3

<211>354

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>3

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<210>4

<211>352

<212>dna

<213>烟草(nicotianatabacuml.)

<400>4

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ccttatgtagattttgaacccccttgaccaccaaactacacttttagattgt352

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>5

ttagatgtgtgatagggtcagttag25

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>6

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<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>7

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<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>8

aattaactttggtccaaaccag22

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>9

aattaactttggtccaaactta22

<210>10

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>10

aattaactttggtccaaacgta22

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>11

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<210>12

<211>25

<212>dna

<213>人工合成

<400>12

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<210>13

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<400>13

ggtgctgctctggatagtcag21

<210>14

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>14

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<210>15

<211>22

<212>dna

<213>人工合成

<400>15

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<210>16

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<212>dna

<213>人工合成

<400>16

ggtgctgctctggatagtctc21

<210>17

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<212>dna

<213>人工合成

<400>17

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<210>18

<211>21

<212>dna

<213>人工合成

<400>18

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