【技术领域】
本发明属于农业害虫防治领域，具体涉及一种啶虫脒偶联的bt杀虫毒素及其制备方法与应用。
背景技术：
近些年，农业科学的快速发展，农药防治起一定程度的促进作用。农药可以有效的防治农业病、虫、草、鼠等有害生物，保证了农业增产丰收这一重要环节。但病害抗药性的产生，是无论化学农药还是生物农药都不能避免的难题；害虫对农药抗药性就是克服农药位点作用，使之失效、钝化。在实际应用中，农药轮换施用、农药混配施用、增加农药对害虫的接触面积、培育害虫的敏感品系、增加生态多样性以增加害虫的多样性等等，实质上是使农药作用位点保持足够的敏感性，寻求克服抗性的手段。生物偶联是利用生物偶联技术将两种毒素偶联形成新的毒素，对保持农药位点的敏感性等具有重要的意义。
苏云金杆菌(bacilusthuringiensis，简称bt)是目前世界上生产量最大、应用最为广泛的一类微生物杀虫剂，其晶体蛋白对570余种鳞翅目害虫及双翅目、膜翅目和鞘翅目等数十种害虫有杀虫毒力。一般认为，昆虫在取食晶体蛋白后，通过自身的中肠蛋白酶将其酶解为活性的毒素蛋白，毒素蛋白再和中肠上皮细胞刷状缘膜(bbmvs)上的受体结合，并进一步插入膜内，形成孔洞或离子通道，引起离子渗漏，破坏肠壁上皮细胞，使肠道内溶物渗入血腔，引起败血症，致使昆虫死亡；但昆虫的抗药性使得现有的bt毒素的防效急剧下降，因此，对bt毒素进行改造，提供一种具有较强毒力的bt毒素是从业人员所迫切希望地。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题在于提供一种啶虫脒偶联的bt杀虫毒素及其制备方法与应用。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：
一种啶虫脒偶联的bt杀虫毒素，该bt杀虫毒素的化学结构式如下：
同时揭露了上述啶虫脒偶联的bt杀虫毒素的制备方法，该制备方法的具体操作如下：按1:1.5:1.5的摩尔比分别称取羧基啶虫脒、edc和nhs，且溶于dmso溶剂内，以对羧基啶虫脒的羧基进行活化，得活化后的羧基啶虫脒，待用；取btcry2ab杀虫蛋白配置含5mmol/lbtcry2ab杀虫蛋白的na2co3/nahco3缓冲液，即btcry2ab杀虫蛋白溶液，待用；分别量取配制好的活化后的羧基啶虫脒与所述btcry2ab杀虫蛋白溶液，搅拌1小时进行偶联反应，获得bt杀虫毒素。
进一步地，所述btcry2ab杀虫蛋白的制备步骤如下：
(1)将cry2ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将其接种至lb固体培养基上，将lb固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；
(2)将活化后的大肠杆菌工程菌菌种接种于lb液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180r/min，待菌液od600到达0.5后，将温度调整为25℃，180r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000r/min条件下离心10min，离心结束后取沉淀重悬于na2co3裂解液，于4℃下超声裂解30min，裂解后的溶液4℃、10000r/min离心30min，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液过ida-ni亲和层析柱，并先采用ni50缓冲液除去杂蛋白，后采用ni500缓冲液洗脱目的蛋白；洗脱所得目的蛋白经脱盐柱pd-10脱盐则得到btcry2ab杀虫蛋白，将btcry2ab杀虫蛋白置于-20℃下保存，备用。
进一步地，所述ni50缓冲液的配方为nacl300mm、nah2po450mm、咪唑50mm；ni500缓冲液的配方为nacl300mm、nah2po450mm、咪唑500mm。
进一步地，所述羧基啶虫脒制备过程为：将巯基丙酸、氢氧化钾及啶虫脒按质量比1:1:2的比例溶于有机溶剂dmso中，并于100℃恒温下反应2h；反应结束后待反应体系冷却至室温，倒入盛有二次蒸馏水的洁净烧杯中，用12mol·l-1hc1将反应液的ph调至3；接着反应液用二氯甲烷多次萃取，收集有机相；然后将有机相进行减压浓缩得粗产物，粗产物经硅胶柱层析分离即得所述羧基啶虫脒。
本发明还揭露了所述bt杀虫毒素作为农业杀虫剂的应用。
本发明的有益效果在于：提供一种啶虫脒偶联的bt杀虫毒素，该bt杀虫毒素具有较强的毒力，其对小菜蛾具有更好的杀虫效果，能够作为农业杀虫剂，即对防治农业害虫具有更好的应用前景；且同时揭露了该bt杀虫毒素的制备方法，该制备方法过程简单便捷、可操作性强。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1是本发明中实施例4sds-page检测的图谱。
【具体实施方式】
为了更好地理解本发明，下面结合实施例和应用例进一步地阐述说明本发明的内容，但这些实施例与应用例仅是示例性的，并不用于限制本发明的范围。
实施例1
羧基啶虫脒的制备
于三口烧瓶中用15mldmso溶解啶虫脒(2.26g)，并加入koh(1.13g)，另在搅拌下用恒压漏斗滴加10mldmso溶解的β-巯基丙酸(1.13g)，之后逐渐升温至100℃，反应2h；反应结束后待反应体系冷却至室温，倒入盛有二次蒸馏水的洁净烧杯中，用12mol·l-1hc1将反应液的ph调至3；接着反应液用二氯甲烷多次萃取，收集有机相，有机相减压浓缩得粗产物，粗产物经硅胶柱层析分离得羧基啶虫脒。
通过ms和nmr技术鉴定羧基啶虫脒的结构：
13cnmr(100mhz,dmso)：δ173.05,157.91,157.43,149.18,136.70,128.16,122.19,118.16,50.47,38.01,34.59,25.10,19.52；
hr-esi-ms:c13h15n4o2s([m-h]-):291.0975。
从而确定了该羧基啶虫脒的化学结构，则该实施例所涉及的反应化学式为：
实施例2
苏云金芽胞杆菌的杀虫蛋白即btcry2ab杀虫蛋白的制备
(1)将cry2ab基因通过热击法转化至大肠杆菌工程菌以获得含有cry2ab基因的大肠杆菌工程菌，之后将该含有cry2ab基因的大肠杆菌工程菌接种至lb固体培养基上，将lb固体培养基置于30℃下恒温培养24h进行菌种活化；
(2)将活化后的大肠杆菌工程菌菌种接种于lb液体培养基中，并置于摇瓶中37℃发酵培养，转速设定为180r/min，待菌液od600到达0.5后，将温度调整为25℃，180r/min继续培养24h；接着将发酵培养所得发酵液置于4℃、10000r/min条件下离心10min，离心结束后取沉淀重悬于na2co3裂解液，于4℃下超声裂解30min，裂解后的溶液4℃、10000r/min离心30min，取上清液；
(3)将步骤(2)所得上清液过ida-ni亲和层析柱，先采用ni50缓冲液(nacl300mm、nah2po450mm、咪唑50mm)除去杂蛋白；后采用ni500缓冲液(nacl300mm、nah2po450mm、咪唑500mm)洗脱目的蛋白；洗脱所得目的蛋白经脱盐柱pd-10脱盐则得到btcry2ab杀虫蛋白，将btcry2ab杀虫蛋白置于-20℃下保存，备用。
实施例3
bt杀虫毒素的制备
取实施例1制备所得的羧基啶虫脒(0.5mmol)，用1mldmso溶解，加入edc(0.75mmol)和nhs(0.75mmol)，室温搅拌2h，对羧基啶虫脒的羧基进行活化，得活化后的羧基啶虫脒，待用；取实施例2制备所得的btcry2ab杀虫蛋白配置含5mmol/lbtcry2ab杀虫蛋白的na2co3/nahco3缓冲液，即btcry2ab杀虫蛋白溶液，待用；之后在4℃条件下，将100μl活化后的羧基啶虫脒加入所述btcry2ab杀虫蛋白溶液1ml，搅拌1小时进行偶联反应，获得bt杀虫毒素。
实施例4
sds-page检测偶联效果
通过sds-page检测实施例3中偶联反应过程的偶联效果，检测结果如图1所示(图1中，m：marker；10:偶联10min后取样；20：偶联20min后取样；30：偶联30min后取样；40：偶联40min后取样；50：偶联50min后取样；c：偶联前btcry2ab杀虫蛋白)；由图1可以看出，在偶联开始50min后btcry2ab蛋白已经和活化后的羧基啶虫脒发生明显的偶联，偶联前后分子量增大1kd左右，即偶联成功。
应用例1
bt杀虫毒素的杀虫活性分析
(1)小菜蛾的准备
采集室内种群的小菜蛾蛹，羽化，收集成虫产卵，每24小时收集一次小菜蛾卵，收集的同批的小菜蛾卵在人工气候箱内以同样条件饲养以备lc50测定，该人工气候箱的条件为：温度25℃、相对湿度70％、光周期16：8(l：d)。
(2)验证方法与结果
采用24孔平板饲喂法测定btcry2ab杀虫蛋白、啶虫脒与实施例3制备所得的bt杀虫毒素对小菜蛾二龄幼虫的死亡率，同时设置实验组和两对照组(分别为对照组之一和对照组之二)。具体实验方法为，实验组：将bt杀虫毒素进行稀释，得到不同浓度的bt杀虫毒素溶液；接着在无菌环境下，吸取1ml的饲料分装于24孔板中并自然晾干，之后分别吸取100μl配置好的不同浓度的bt杀虫毒素溶液并均匀的涂布于饲料表面，以100μlna2co3/nahco3缓冲液作为空白对照，各组做好标记、自然状态下晾干；二龄小菜蛾接种到24孔板(每孔5-7只)，每个浓度梯度4孔重复，48小时测定后小菜蛾的死亡率(虫的死亡以用毛笔轻触小菜蛾不动为准)，得出lc50。在对照组之一，与实验组的唯一区别在于以btcry2ab杀虫蛋白作为效应物。在对照组之二，与实验组的唯一区别在于以啶虫脒作为效应物。试验结果见下表1。
表1bt杀虫毒素的杀虫效果
经由表1并利用spss软件的回归模型进行分析，得出：对照组之一即btcry2ab杀虫蛋白对二龄小菜蛾的lc50为23.825μg/ml，实验组即本发明bt杀虫毒素对二龄小菜蛾的lc50为9.881μg/ml，杀虫毒力大概提高了2.41倍；对照组之二啶虫脒对二龄小菜蛾的lc50为276.53μg/ml。这个结果表明本发明bt杀虫毒素确实能够提高对小菜蛾的杀虫毒力。
综上所述，本发明通过偶联而形成的bt杀虫毒素具有较强的毒力，本发明bt杀虫毒素对小菜蛾具有更好的杀虫效果，换而言之，其能够作为农业杀虫剂用于杀害小菜蛾，对防治农业害虫具有更好的应用前景。