本发明属于医学技术领域，尤其涉及一种提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法及系统。
背景技术：
已有文献表明猪繁殖与呼吸综合征病毒prrsv在体内和体外都可引起细胞凋亡，而此种细胞凋亡主要由囊膜糖蛋白gp5引起。存在的缺陷是prrsvgp5诱导的细胞凋亡能力比较差，特定位点对诱导细胞凋亡的作用尚不清楚。
综上所述，现有技术存在的问题是：
现有技术中，prrsvgp5诱导的细胞凋亡能力比较差；不能降低prrsv的复制能力。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡能力的方法。
本发明是这样实现的，一种提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法，包括：
根据prrsvorf5的基因序列，将第30位天冬酰胺的密码子突变为编码甘氨酸的aag；第34位和第35位天冬酰胺的密码子分别突变为编码谷氨酸和精氨酸的密码子gaa、aga；第44位天冬酰胺的密码子aac突变为编码精氨酸的密码子aga、第51位的密码子aat突变为编码赖氨酸的密码子aaa；
进行定点突变：进行pcr反应、bluntingkination反应、ligation反应；
进行流式细胞术分析：转染前一天将293t细胞以每孔1×105～2×105接种6孔板，待细胞长至70％～80％融合时，将测序正确的重组质粒pvax1-n30a、pvax1-n34a、pvax1-n35a、pvax1-n44a、pvax1-n51a进行纯化后分别转染至培养的293t细胞；进行分析。
进一步，所述根据prrsvorf5的基因序列，将第30位天冬酰胺的密码子突变为编码甘氨酸的aag；具体包括：
pvax1-gp5-n30突变：
根据prrsvorf5的基因序列，设计两对引物，利用overlappcr将prrsvgp5n端第30位天冬酰胺n突变为甘氨酸g；
所述两对引物为：
a1：5-ctcaagcttaccatggccttggggaagtgctt；
a2：5-ttgttgctggctccggcgagcacagcaaaatagaa；
b1：5-ttctattttgctgtgctcgccggagccagcaa；
b2：5-tagtggatccctagagacgaccccattgttcc。
进一步，所述第34位和第35位天冬酰胺的密码子分别突变为编码谷氨酸和精氨酸的密码子gaa、aga；
具体包括：
pvax1-gp5-n34突变：
f:5’-agcaacgaaaacagctctcatattc-3’；
r:5’-ggcgttggcgagcacagc-3’；
pvax1-gp5-n34突变的引物把orf5原序列的34位aa由天冬酰胺aac变为谷氨酸gaa；
pvax1-gp5-n35突变：
f:5’-aacaacagaagctctcatattcagt-3’；
r:5’-gctggcgttggcgagcac-3’；
pvax1-gp5-n35突变的引物把orf5原序列的35位aa由天冬酰胺aac变为精氨酸aga。
进一步，所述第44位天冬酰胺的密码子aac突变为编码精氨酸的密码子aga，具体包括：
pvax1-gp5-n44突变：
f:5’-atttatagattaacgctatgtgagc-3’；
r:5’-caactgaatatgagagctgttgtt-3’；
pvax1-gp5-n44突变的引物把orf5原序列的44位aa由天冬酰胺aac变为精氨酸aga。
进一步，所述第51位的密码子aat突变为编码赖氨酸的密码子aaa，具体包括：
pvax1-gp5-n51突变：
f:5’-gagctgaaaggcacagattgg-3’；
r:5’-acatagcgttaagttataaatcaact-3’；
pvax1-gp5-n51突变的引物把orf5原序列的51位aa由天冬酰胺aat变为赖氨酸aaa。
进一步，所述pcr反应包括：
pyrobestdnapolymerase0.25μl，10×pyorbestbufferⅱ5μl，dntpmixture4μl，primer1、2(20μm)各1μl，template0.01-1ng，灭菌蒸馏水upto50μl，按下列反应条件进行pcr反应：94℃，30sec、55℃，30sec、72℃，5min；
对pcr反应液进行1％agarose凝胶电泳；切胶回收目的dna片段。
进一步，所述bluntingkination反应，包括：
配制反应液：dnafragment1pmol，10×bluntingkinationbuffer2μl，bluntingkinationenzymemix1μl，ddh2oupto20μl；
37℃反应10分钟；
70℃反应10分钟。
进一步，所述ligation反应，包括：
取0.25pmol的溶液于新的微量离心管中；
加入5μl的ligationsolutioni，均匀混合；
16℃反应1小时；
反应液全量转化至100μl的感受态细胞中；
将反应液全量转化至100μl的感受态细胞中，冰浴30min，42℃加热90s，冰浴3min，加入800μl液体lb培养基，在氨苄抗性的培养基中挑取阳性的单克隆菌株提取质粒，鉴定扩增目的片段大小，测序，于-20℃分别大量保存pvax1-n34a、pvax1-n35a、pvax1-n44a、pvax1-n51a重组质粒以备使用。
进一步，所述流式细胞术分析，具体包括：
将1μg质粒溶于50μl无血清的dmem中，充分混匀，制成dna稀释液；
将2μlturbofectreagent溶于50μl无血清的dmem中，充分混匀，制成turbofectreagent稀释液，室温静置5min；
将turbofectreagent稀释液分别加入到dna稀释液中，充分混匀，室温静置15-30min，转染复合物制备完成；
将转染复合物以滴状方式加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，混匀；置于37℃、5％co2培养箱中培养，于24h、36h后收集细胞，进行分析。
本发明的另一目的在于提供一种提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡系统。
本发明的优点及积极效果为：可以有效提高prrsvgp5诱导的细胞凋亡能力，降低prrsv的复制能力。为进一步研究prrsv诱导细胞凋亡与prrsv复制的关系提供了技术支持。
附图说明
图1是本发明实施例提供的提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明可以有效提高prrsvgp5诱导的细胞凋亡能力，降低prrsv的复制能力。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细描述。
如图1所示，本发明实施例提供的提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法，包括：
s101：根据prrsvorf5的基因序列，将第30位天冬酰胺的密码子突变为编码甘氨酸的aag；第34位和第35位天冬酰胺的密码子分别突变为编码谷氨酸和精氨酸的密码子gaa、aga；第44位天冬酰胺的密码子aac突变为编码精氨酸的密码子aga、第51位的密码子aat突变为编码赖氨酸的密码子aaa。
s102：进行定点突变：进行pcr反应、bluntingkination反应、ligation反应。
s103：进行流式细胞术分析：转染前一天将293t细胞以每孔1×105～2×105接种6孔板，待细胞长至70％～80％融合时，将测序正确的重组质粒pvax1-n30a、pvax1-n34a、pvax1-n35a、pvax1-n44a、pvax1-n51a进行纯化后分别转染至培养的293t细胞；进行分析。
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
本发明实施例提供的提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法，具体包括：
1.基因突变
根据prrsvorf5的基因序列，将第30位天冬酰胺的密码子突变为编码甘氨酸的aag；第34位和第35位天冬酰胺的密码子分别突变为编码谷氨酸和精氨酸的密码子gaa、aga；第44位天冬酰胺的密码子aac突变为编码精氨酸的密码子aga、第51位的密码子aat突变为编码赖氨酸的密码子aaa。
①pvax1-gp5-n30突变
根据prrsvorf5的基因序列，设计两对引物，利用overlappcr将prrsvgp5n端第30位天冬酰胺n(aac)突变为甘氨酸g(gga)。
seqidno.1，a1：5-ctcaagcttaccatggccttggggaagtgctt；
seqidno.2，a2：5-ttgttgctggctccggcgagcacagcaaaatagaa；
seqidno.3，b1：5-ttctattttgctgtgctcgccggagccagcaa；
seqidno.4，b2：5-tagtggatccctagagacgaccccattgttcc；
②pvax1-gp5-n34突变
seqidno.5，f:5’-agcaacgaaaacagctctcatattc-3’(导入突变引物)；
seqidno.6，r:5’-ggcgttggcgagcacagc-3’；
以上引物把orf5原序列的34位aa(100-102bp)由天冬酰胺(aac)变为谷氨酸(gaa)。
③pvax1-gp5-n35突变
seqidno.7，f:5’-aacaacagaagctctcatattcagt-3’(导入突变引物)；
seqidno.8，r:5’-gctggcgttggcgagcac-3’；
以上引物把orf5原序列的35位aa(103-105bp)由天冬酰胺(aac)变为精氨酸(aga)
④pvax1-gp5-n44突变
seqidno.9，f:5’-atttatagattaacgctatgtgagc-3’(导入突变引物)；
seqidno.10，r:5’-caactgaatatgagagctgttgtt-3’；
以上引物把orf5原序列的44位aa(130-132bp)由天冬酰胺(aac)变为精氨酸(aga)。
⑤pvax1-gp5-n51突变
seqidno.11，f:5’-gagctgaaaggcacagattgg-3’(导入突变引物)；
seqidno.12，r:5’-acatagcgttaagttataaatcaact-3’；
以上引物把orf5原序列的51位aa(151-153bp)由天冬酰胺(aat)变为赖氨酸(aaa)。
2.定点突变方法
2.1pcr反应
设计合成变异导入primer和对应的pcr用primer。对应pcr用primer的5’端碱基的互补碱基必须和变异导入primer的5’端碱基相邻接。
pyrobestdnapolymerase0.25μl，10×pyorbestbufferⅱ5μl，dntpmixture4μl，primer1、2(20μm)各1μl，template0.01～1ng，灭菌蒸馏水upto50μl。按下列反应条件进行pcr反应：94℃，30sec、55℃，30sec、72℃，5min。
对pcr反应液进行1％agarose凝胶电泳。
切胶回收目的dna片段(dnafragment)。
2.2bluntingkination反应
①配制反应液：dnafragment约1pmol，10×bluntingkinationbuffer2μl，bluntingkinationenzymemix1μl，ddh2oupto20μl。
②37℃反应10分钟。
③70℃反应10分钟。
2.3ligation反应：
①取约0.25pmol(5μl)上记3.的溶液于新的微量离心管中。
②加入5μl的ligationsolutioni，均匀混合。
③16℃反应1小时。
④反应液全量转化至100μl的感受态细胞中。
将上述步骤3的反应液全量转化至100μl的感受态细胞中，冰浴30min，42℃加热90s，冰浴3min，加入800μl液体lb培养基，在氨苄抗性的培养基中挑取阳性的单克隆菌株提取质粒。鉴定扩增目的片段大小，测序结果正确。于-20℃分别大量保存pvax1-n34a、pvax1-n35a、pvax1-n44a、pvax1-n51a重组质粒以备使用。
3.流式细胞术分析
转染前一天将293t细胞以每孔1×105～2×105接种6孔板，待细胞长至70％～80％融合时，将测序正确的重组质粒pvax1-n30a、pvax1-n34a、pvax1-n35a、pvax1-n44a、pvax1-n51a进行纯化后分别转染至培养的293t细胞，转染按invitrogen公司的脂质体转染试剂盒说明书进行，方法如下：
1)将1μg质粒溶于50μl无血清的dmem中，充分混匀，制成dna稀释液；
2)将2μlturbofectreagent溶于50μl无血清的dmem中，充分混匀，制成turbofectreagent稀释液，室温静置5min；
3)将turbofectreagent稀释液分别加入到dna稀释液中，充分混匀(可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上)，室温静置15-30min，转染复合物制备完成。
4)将转染复合物以滴状方式加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。置于37℃、5％co2培养箱中培养，于24h、36h后收集细胞。按上述细胞流式技术操作方法准备试剂进行流式细胞分析。
分析结果是：
表1不同突变体转染293t细胞24h后细胞凋亡比率及统计分析
注：每个样品做三个重复，
表2不同突变体转染293t细胞24h后细胞凋亡比率及统计分析
注：每个样品做三个重复，
运用spss20进行统计学分析，结果表明：
原序列pvax1-gp5转染293t细胞引起细胞凋亡，与空白对照比较，p<0.05，显示prrsvgp5引起明显的细胞凋亡。
突变序列pvax1-gp5-n30a、pvax1-gp5-n44a、pvax1-gp5-n51a转染293t细胞24h与原序列pvax1-gp5相比较，p>0.05表示细胞早期凋亡没有显著性差异。
突变序列pvax1-gp5-n34a、pvax1-gp5-n35a转染293t细胞24h与原序列pvax1-gp5相比较，p<0.05，显示n34、n35两个氨基酸位点突变后prrsvgp5(a)引起的细胞凋亡显著高于原序列prssvgp5。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>申请人名称山东农业大学
<120>提高prrsvgp5体外诱导细胞凋亡方法及系统
<160>12
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>32
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<220>
<221>cds
<400>1
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
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