新的抗DR5抗体的制作方法

本申请是2011年10月27日提交的题为“新的抗dr5抗体”的国家申请号为201180063500.4(pct/jp2011/074866)的发明专利申请的分案申请。

[技术领域]

本发明涉及与参与细胞凋亡诱导的细胞表面受体结合并可用作肿瘤治疗剂和/或预防剂的抗体，并且还涉及使用抗体治疗和/或预防癌症、自身免疫病或炎性疾病的方法。

[

背景技术：
]

细胞凋亡是体内除去不必要的细胞或受损细胞并保持正常细胞数的生理过程所必不可少的一种现象。由于对细胞凋亡的调节机制在癌症或免疫性疾病中常常受损的事实的阐述，及同样对细胞凋亡的调节途径的阐述的进展，因此可用于治疗癌症或免疫性疾病的新的细胞凋亡诱导剂的开发也受到促进。特别预期对参与细胞凋亡诱导(特征在于死亡受体)的细胞表面受体的配体有结合亲和力的抗体或对所述死亡受体有结合亲和力的抗体对这些疾病具有治疗作用(参见例如非专利文献1)。已知作为死亡受体之一的死亡受体5(dr5)(有时亦称killer、trick2a、trail-r2、trickb或cd262)和众多在细胞中诱导细胞凋亡的激动性抗体(参见例如非专利文献2或3，或专利文献1-6)。在临床试验中作为候选治疗剂的一些抗体目前正在开发中，并预期具有治疗作用使得抗体以激动性方式特异性地作用于表达所述受体的细胞(癌细胞或免疫性疾病相关细胞)以杀死该细胞。为了使这类抗体具有抗肿瘤作用，必要的是细胞表达dr5，然而，已经揭示在临床前试验中，所述作用与dr5表达水平之间没有相关性(非专利文献4)。这被认为是因为细胞反应受许多因素调节，例如参与细胞凋亡途径的胞内信号转导分子(例如胱天蛋白酶-8或bcl-2)的表达水平(非专利文献5)。

[现有技术文献]

[专利文献1]：wo98/51793

[专利文献2]：wo2001/83560

[专利文献3]：wo2002/94880

[专利文献4]：wo2003/54216

[专利文献5]：wo2006/83971

[专利文献6]：wo2007/22157

[非专利文献1]：celldeathanddifferentiation,10:66-75(2003)

[非专利文献2]：journalofimmunology，162:2597-2605(1999)

[非专利文献3]：naturemedicine，7(8):954-960(2001)

[非专利文献4]：celldeathanddifferentiation,10:66-75(2003)

[非专利文献5]：journalofclinicaloncology，26:3621-3630(2008)

[发明概述]

[发明要解决的问题]

本发明的目的是提供抗体或该抗体的功能性片段以用于对癌症具有治疗作用的药物中，以及编码抗体或该抗体的功能性片段的多核苷酸。

[解决问题的方法]

本发明人为了实现上述目的进行了深入研究，结果他们发现了在细胞中显示有效细胞凋亡诱导活性的抗体，从而完成了本发明。这亦在现有可获得的抗体对其无法实现有效治疗作用的患者中产生有效的治疗作用。

即本发明包括以下发明。

(1)抗体或抗体的功能性片段，其特征在于：

重链序列含有具有cdrh1、cdrh2和cdrh3的可变区，且cdrh1包含seqidno:82所示氨基酸序列，cdrh2包含seqidno:83和89所示氨基酸序列的任一个，cdrh3包含seqidno:84所示氨基酸序列；和

轻链序列含有具有cdrl1、cdrl2和cdrl3的可变区，且cdrl1包含seqidno:79、85、86、87和88所示氨基酸序列的任一个，cdrl2包含seqidno:80所示氨基酸序列，cdrl3包含seqidno:81所示氨基酸序列。

(2)(1)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:20所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区和包含seqidno:16所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变序列。

(3)(1)或(2)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于抗体是嵌合抗体。

(4)(3)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:20所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:16所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(5)(1)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于抗体是人源化的。

(6)(5)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有：

(a)选自以下氨基酸序列的重链可变区序列：

a1)包含seqidno:42所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的氨基酸序列；

a2)包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的氨基酸序列；

a3)与选自a1)和a2)的氨基酸序列具有至少95％同源性的氨基酸序列；

a4)与选自a1)和a2)的氨基酸序列具有至少99％同源性的氨基酸序列；和

a5)在选自a1)和a2)的氨基酸序列的任一个中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列；和

(b)选自以下氨基酸序列的轻链可变区序列：

b1)包含seqidno:28所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的氨基酸序列；

b2)包含seqidno:52所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的氨基酸序列；

b3)包含seqidno:58所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的氨基酸序列；

b4)包含seqidno:62所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的氨基酸序列；

b5)包含seqidno:66所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的氨基酸序列；

b6)与选自b1)-b5)的氨基酸序列的任一个具有至少95％同源性的氨基酸序列；

b7)与选自b1)-b5)的氨基酸序列的任一个具有至少99％同源性的氨基酸序列；和

b8)在选自b1)-b5)的氨基酸序列的任一个中包括一个至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列。

(7)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:42所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区序列和包含seqidno:28所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变区序列。

(8)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区序列和包含seqidno:52所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变区序列。

(9)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区序列和包含seqidno:58所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变区序列。

(10)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区序列和包含seqidno:62所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变区序列。

(11)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-141的重链可变区序列和包含seqidno:66所示氨基酸序列的氨基酸残基21-134的轻链可变区序列。

(12)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:42所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:28所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(13)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:52所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(14)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:58所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(15)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:62所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(16)(6)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于含有包含seqidno:70所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:66所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列。

(17)(1)-(16)任一个的抗体的功能性片段，其选自fab、f(ab’)2、fab’和fv。

(18)一种药物组合物，其特征在于包含(1)-(17)的至少一种抗体或所述抗体的功能性片段。

(19)(18)的药物组合物，其特征在于是用于治疗和/或预防癌症的药物组合物。

(20)一种用于治疗和/或预防癌症的药物组合物，其特征在于包含(1)-(17)的至少一种抗体或所述抗体的功能性片段和选自紫杉醇、卡铂、cpt-11和长春碱的至少一个成员。

(21)(19)或(20)的药物组合物，其中癌症选自肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌、黑素瘤、纤维肉瘤、成胶质细胞瘤和血细胞癌。

(22)一种治疗和/或预防癌症的方法，其特征在于给予(1)-(17)的至少一种抗体或所述抗体的功能性片段。

(23)一种治疗和/或预防癌症的方法，其特征在于同时或序贯给予(1)-(17)的至少一种抗体或所述抗体的功能性片段和选自紫杉醇、卡铂、cpt-11、长春碱和5-fu的至少一个成员。

(24)(22)或(23)的治疗和/或预防方法，其中癌症选自肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、子宫癌、黑素瘤、成胶质细胞瘤和血细胞癌。

(25)一种多核苷酸，其编码(2)、(4)和(6)-(16)中任一个的抗体。

(26)(25)的多核苷酸，其特征在于含有包含seqidno:19所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列和包含seqidno:15所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列。

(27)(25)的多核苷酸，其特征在于含有包含seqidno:19所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列和包含seqidno:15所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列。

(28)(25)的多核苷酸，其特征在于含有：

(a)选自以下核苷酸序列的多核苷酸：

a1)包含seqidno:41所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列；

a2)包含seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列；

a3)与包含与选自a1)和a2)的核苷酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和

a4)在选自a1)和a2)的核苷酸序列中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列；和

(b)选自以下核苷酸序列的多核苷酸：

b1)包含seqidno:27所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；

b2)包含seqidno:51所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；

b3)包含seqidno:57所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；

b4)包含seqidno:61所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；

b5)包含seqidno:65所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列；

b6)与包含与选自b1)-a5)的核苷酸序列的任一个互补的核苷酸序列的多核苷酸在严格条件下杂交的多核苷酸的核苷酸序列；和

b7)在选自b1)-b5)的核苷酸序列的任一个中包括一个至几个核苷酸的取代、缺失或添加的核苷酸序列。

(29)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:41所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:27所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。

(30)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:51所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。

(31)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:57所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。

(32)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:61所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。

(33)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-423的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:65所示核苷酸序列的核苷酸61-402的核苷酸序列的多核苷酸。

(34)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:41所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:27所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。

(35)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:51所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。

(36)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:57所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。

(37)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:61所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。

(38)28)的多核苷酸，其特征在于含有：包含含有seqidno:69所示核苷酸序列的核苷酸58-1413的核苷酸序列的多核苷酸和包含含有seqidno:65所示核苷酸序列的核苷酸61-717的核苷酸序列的多核苷酸。

(39)一种载体，其包含(25)-(38)的多核苷酸的任一种。

(40)一种转化宿主细胞，其包含(25)-(38)的多核苷酸的任一种。

(41)一种转化宿主细胞，其包含(39)的载体。

(42)一种产生(2)、(4)和(6)-(16)中任一个的抗体的方法，所述方法包括培养(40)或(41)的宿主细胞和从所得培养产物中纯化抗体的步骤。

(43)一种抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于与含有包含seqidno:20所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:16所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列的抗体相同的表位结合。

(44)一种抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于与含有包含seqidno:20所示氨基酸序列的氨基酸残基20-471的重链序列和包含seqidno:16所示氨基酸序列的氨基酸残基21-239的轻链序列的抗体竞争。

(45)(43)或(44)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于通过木瓜蛋白酶消化制备的抗体的fab片段，当结合seqidno:23所示重组蛋白时，以或更小的距离位于seqidno:23所示重组蛋白的以下残基附近：26位的甘氨酸残基、34位的异亮氨酸残基、36位的谷氨酸残基、37位的天冬氨酸残基、38位的甘氨酸残基、56位的天冬氨酸残基、57位的亮氨酸残基、58位的亮氨酸残基、59位的苯丙氨酸残基、61位的亮氨酸残基和62位的精氨酸残基。

(46)(45)的抗体或所述抗体的功能性片段，其特征在于利用x射线衍射数据，通过复合体结构分析来确定构成seqidno:23所示重组蛋白的各个氨基酸残基与fab片段之间的距离。

[发明益处]

按照本发明，可获得用于癌症的治疗剂，其作用机制主要通过细胞中的细胞凋亡诱导。

附图简述

[图1]

图1是显示小鼠b273抗体的杀细胞作用的图示。

[图2]

图2是显示cb273抗体和strail与dr5胞外域蛋白质的结合活性的图示。

[图3]

图3是显示采用biacore的cb273抗体与人dr5的结合活性的图示。上边的图显示测量图，其中纵坐标表示共振单位(ru)，横坐标表示时间(秒)。下边的图显示利用分析软件计算的cb273抗体的kon、koff和kd值。

[图4]

图4是显示cb273抗体对人癌细胞系的体外杀细胞作用的图示。a)显示人卵巢癌细胞系的结果，b)显示人结肠癌细胞系的结果，c)显示人肺癌细胞系的结果，和d)显示人乳腺癌细胞系的结果。

[图5]

图5是显示cb273抗体对人癌细胞系的体外杀细胞作用的图示。a)显示人胰腺癌细胞系的结果，b)显示人黑素瘤细胞系的结果，c)显示人成胶质细胞瘤细胞系的结果，和d)显示人子宫内膜癌细胞系的结果。

[图6]

图6是显示dr5-cb273fab复合体结构的视图。

[图7]

图7是显示dr5和cb273fab的h链或l链之间相互作用的视图。a)是说明作为棒状模型位于距dr5为或更小距离的cb273fab的h链氨基酸残基和反之亦然的视图。图左侧所示ile34、glu36、asp37、gly38、asp56、leu57、leu58、phe59、leu61和arg62是来源于dr5的氨基酸残基，相应的氨基酸残基编号对应于序列表中seqidno:23所示氨基酸序列的编号。此外，图右侧的phe33、arg50、asn52、tyr54、asn55、phe59、tyr101、tyr102、phe103和asp104是来源于cb273重链的氨基酸残基，相应的氨基酸残基编号通过使用序列表中seqidno:20的20位谷氨酸残基作为起始点给出。b)是说明位于距dr5为或更小距离的cb273fab的l链氨基酸残基和反之亦然的视图，其中一些为棒状模型，其它作为带状模型。图左侧的gly26、glu36、asp37和gly38是来源于dr5的氨基酸残基，相应的氨基酸残基编号对应于序列表中seqidno:23所示氨基酸序列的编号。此外，图右侧的his31、asn33、val99和trp101是来源于cb273轻链的氨基酸残基，相应的氨基酸残基编号通过使用序列表中seqidno:16的21位天冬氨酸残基作为起始点给出。位于距cb273的fab片段或更小的dr5的氨基酸残基为序列表中seqidno:23所示氨基酸序列26位的甘氨酸残基、34位的异亮氨酸残基、36位的谷氨酸残基、37位的天冬氨酸残基、38位的甘氨酸残基、56位的天冬氨酸残基、57位的亮氨酸残基、58位的亮氨酸残基、59位的苯丙氨酸残基、61位的亮氨酸残基和62位的精氨酸残基。

[图8-1]

图8-1是显示采用biacore的hb273抗体与人dr5的结合活性的图示，以及显示各个抗体的测量曲线图。

[图8-2]

图8-2是采用biacore的hb273抗体与人dr5的结合活性的表格，并显示利用分析软件计算的各个抗体的kon、koff和kd值。顺便提一句，图8-1各曲线图给出的数目对应于图8-2表格中的条目编号。

[图9]

图9是显示hb273抗体针对jurkat细胞的体外杀细胞活性的图示，所述jurkat细胞是人t淋巴瘤衍生细胞系。

[图10-1]

图10-1是显示采用biacore的hb273抗体与人dr5的结合活性的图示，并显示各个抗体的测量曲线图。

[图10-2]

图10-2是显示采用biacore的hb273抗体与人dr5的结合活性的表格，并显示利用分析软件计算的各个抗体的kon、koff和kd值。顺便提一句，图10-1各曲线图给出的数目对应于图10-2表格中的条目编号。

[图11]

图11是显示hb273抗体针对jurkat细胞的体外杀细胞活性的图示，所述jurkat细胞是人t淋巴瘤衍生细胞系。

[图12-1]

图12-1是显示采用biacore的cdr修饰的hb273抗体与人dr5的结合活性的视图，并显示各个抗体的测量曲线图。

[图12-2]

图12-2是显示采用biacore的cdr修饰的hb273抗体与人dr5的结合活性的表格，并显示利用分析软件计算的各个抗体的kon、koff和kd值。顺便提一句，图12-1中各曲线图给出的数目对应于图12-2表中的条目编号。

[图13-1]

图13-1是显示采用示差扫描量热法(dsc)评价cdr修饰的hb273抗体的热稳定性的图示，并显示各个抗体的测量曲线图。

[图13-2]

图13-2是显示采用示差扫描量热法(dsc)评价cdr修饰的hb273抗体的热稳定性的图示，并显示各个抗体的测量曲线图。

[图13-3]

图13-3显示自图13-1和13-2所示曲线图计算的各个抗体的tm值。顺便提一句，图13-1和13-2中各曲线图给出的数字对应于图13-3中的条目编号。

[图14]

图14是显示cdr修饰的hb273抗体针对jurkat细胞的体外杀细胞活性的图示，所述jurkat细胞为人t淋巴瘤衍生细胞系。

[图15]

图15是显示hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体对人癌细胞系的胱天蛋白酶-3/7活化作用和体外杀细胞活性的视图。a)显示人结肠癌细胞系hct-15的结果，b)显示人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg的结果。

[图16]

图16是显示植入人结肠癌细胞系colo205的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示。

[图17]

图17是显示植入人胰腺癌细胞系miapaca-2的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示。

[图18]

图18是显示植入人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示。

[图19]

图19是显示植入人肺癌细胞系nci-h2122的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与紫杉醇和卡铂组合)。

[图20]

图20是显示植入人肺癌细胞系nci-h460的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与紫杉醇和卡铂组合)。

[图21]

图21是显示植入人结肠癌细胞系dld-1的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与cpt-11组合)。

[图22]

图22是显示植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与cpt-11组合)。

[图23]

图23是显示植入人结肠癌细胞系hct-116的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与cpt-11组合)。

[图24]

图24是显示植入人黑素瘤细胞系a375的裸小鼠中cb273抗体的体内抗肿瘤活性的图示(与长春碱组合)。

[图25]

图25是显示植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠中cb273抗体和可那木单抗(conatumumab)之间体内抗肿瘤活性的比较的图示。

[图26]

图26是显示植入人肺癌细胞系nci-h1975的裸小鼠中cb273抗体和可那木单抗之间体内抗肿瘤活性的比较的图示。

[图27]

图27是显示植入人结肠癌细胞colo205的裸小鼠中hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体(图中标为“hb273”)的体内抗肿瘤活性的图示。

[图28]

图28是显示编码小鼠抗体b273重链的cdna的核苷酸序列和小鼠抗体b273重链的氨基酸序列的图示。

[图29]

图29是显示编码小鼠抗体b273轻链的cdna的核苷酸序列和小鼠抗体b273轻链的氨基酸序列的图示。

[图30]

图30是显示编码b273嵌合型轻链的核苷酸序列和b273嵌合型轻链的氨基酸序列的图示。

[图31]

图31是显示编码b273嵌合型重链的核苷酸序列和b273嵌合型重链的氨基酸序列的图示。

[图32]

图32是显示编码hb273_l1型轻链的核苷酸序列和hb273_l1型轻链的氨基酸序列的图示。

[图33]

图33是显示编码hb273_l2型轻链的核苷酸序列和hb273_l2型轻链的氨基酸序列的图示。

[图34]

图34是显示编码hb273_l3型轻链的核苷酸序列和hb273_l3型轻链的氨基酸序列的图示。

[图35]

图35是显示编码hb273_h1型重链的核苷酸序列和hb273_h1型重链的氨基酸序列的图示。

[图36]

图36是显示编码hb273_h2型重链的核苷酸序列和hb273_h2型重链的氨基酸序列的图示。

[图37]

图37是显示编码hb273_h3型重链的核苷酸序列和hb273_h3型重链的氨基酸序列的图示。

[图38]

图38是显示编码hb273_h1-1型重链的核苷酸序列和hb273_h1-1型重链的氨基酸序列的图示。

[图39]

图39是显示编码hb273_h2-1型重链的核苷酸序列和hb273_h2-1型重链的氨基酸序列的图示。

[图40]

图40是显示编码hb273_h2-2型重链的核苷酸序列和hb273_h2-2型重链的氨基酸序列的图示。

[图41]

图41是显示编码hb273_h2-3型重链的核苷酸序列和hb273_h2-3型重链的氨基酸序列的图示。

[图42]

图42是显示编码hb273_h2-4型重链的核苷酸序列和hb273_h2-4型重链的氨基酸序列的显示。

[图43]

图43是显示编码hb273_h2-5型重链的核苷酸序列和hb273_h2-5型重链的氨基酸序列的图示。

[图44]

图44是显示编码hb273_l1-ne型轻链的核苷酸序列和hb273_l1-ne型轻链的氨基酸序列的图示。

[图45]

图45是显示编码hb273_l1-nf型轻链的核苷酸序列和hb273_l1-nf型轻链的氨基酸序列的图示。

[图46]

图46是显示编码hb273_l1-nk型轻链的核苷酸序列和hb273_l1-nk型轻链的氨基酸序列的图示。

[图47]

图47是显示编码hb273_l1-nl型轻链的核苷酸序列和hb273_l1-nl型轻链的氨基酸序列的图示。

[图48]

图48是显示编码hb273_h2-1-ne型重链的核苷酸序列和hb273_h2-1-ne型重链的氨基酸序列的图示。

[图49]

图49是显示编码可那木单抗轻链的cdna的核苷酸序列和可那木单抗轻链的氨基酸序列的图示。

[图50]

图50是显示编码可那木单抗重链的cdna的核苷酸序列和可那木单抗重链的氨基酸序列的图示。

[图51]

图51是显示hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体针对人癌细胞系的体外杀细胞活性的图示。a)显示人胃癌细胞系的结果，b)显示人肾癌细胞系的结果，c)显示人肝癌细胞系的结果，d)显示人纤维肉瘤细胞系的结果。

[图52]

图52是显示植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠中与5-fu组合的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体(图中标为“hb273”)的体内抗肿瘤活性及该活性与可那木单抗比较的图示。

[图53]

图53是显示植入人非小细胞肺癌细胞系nci-h1975的裸小鼠中与紫杉醇组合的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体(图中标为“hb273”)的体内抗肿瘤活性及该活性与可那木单抗比较的图示。

[实施本发明的方式]

本文所用术语“癌症”和“肿瘤”以相同含义使用。

本文所用术语“基因”不仅包括dna，而且还包括其mrna、其cdna和crna。

本文所用术语“多核苷酸”按与“核酸”相同的含义使用，且还包括dna、rna、探针、寡核苷酸和引物。

本文所用术语“多肽”和“蛋白质”无差别地使用。

本文所用术语“rna级分”是指含有rna的级分。

本文所用术语“细胞”还包括动物个体和培养细胞中的细胞。

本文所用术语“细胞的恶性转化”是指其中细胞显示异常增殖的状态，例如细胞失去其对接触抑制现象的敏感性、细胞显示贴壁非依赖性增殖等，而显示这类异常增殖的细胞称为“癌细胞”。

本文所用术语“细胞损伤”是指其中在细胞中引起某种形式的病理变化的状态，细胞损伤不限于直接损伤，包括对细胞结构和功能的各种类别的损害，例如dna切割、碱基二聚体形成、染色体切割、细胞分裂机器受损和各种酶活性降低。

本文所用术语“细胞毒性活性”是指引起上述细胞损伤的活性。

本文所用术语“含有死亡结构域的受体”(其包括fas、tnfri、dr3、dr4、dr5和dr6，但不限于此)是指胞内域中具有凋亡信号转导区(称为“死亡结构域”)的受体分子，其与果蝇自杀基因reaper显示同源性。

本文所用术语“抗体的功能性片段”是指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，包括fab、f(ab’)2、scfv等。术语还包括fab’，其是通过在还原条件下处理f(ab’)2而得到的抗体可变区中的单价片段。然而，该术语不限于这些分子，只要片段对抗原具有结合亲和力。此外，这些功能性片段不仅包括通过用合适的酶处理抗体蛋白质的全长分子所得到的片段，而且还包括使用经遗传修饰的抗体基因在合适的宿主细胞中产生的蛋白质。

本文所用术语“fab’”是指通过在上述还原条件下处理f(ab’)2所得到的抗体的可变区中的单价片段。然而，使用经遗传修饰的抗体基因产生的fab’也包括在本发明的fab’中。

本文所用术语“单链可变片段抗体”按与单链fv(scfv)相同的含义使用。

本文所用术语“表位”是指特异性抗体与之结合的抗原的部分肽或部分三级结构。可通过本领域技术人员熟知的方法(例如免疫测定法)以及例如可采用下列方法，测定其为抗原的部分肽的表位。首先，产生抗原的各种各样的部分结构。在部分结构的产生中，可采用已知的寡肽合成技术。例如，采用本领域技术人员已知的遗传重组技术，产生通过从c端或n端连续缩短抗原而得到的具有适当减短长度的一系列多肽。此后，检查抗体针对这些多肽的反应性，并大致确定识别位点。然后，合成具有较短长度的肽，用这些肽检查反应性，藉此可确定表位。此外，可通过x射线结构分析，通过指定位于抗体附近的抗原的氨基酸残基，来确定其为与特异性抗体结合的抗原的部分三级结构的表位。

本文所用术语“与相同表位结合的抗体”是指与共同表位结合的不同抗体。如果第二抗体与第一抗体与之结合的部分肽或部分三级结构结合，则可确定第一抗体和第二抗体与相同表位结合。此外，通过证实第二抗体与第一抗体竞争结合抗原(即第二抗体抑制第一抗体与抗原的结合)，则可确定第一抗体和第二抗体与相同表位结合，即使未确定具体的表位序列或结构。此外，当第一抗体和第二抗体与相同表位结合，第一抗体还具有特殊作用(例如细胞凋亡诱导活性)时，可以预期第二抗体也具有相同活性。

本文所用术语“cdr”是指互补决定区(cdr)，已知抗体分子的每条重链和轻链具有3个互补决定区(cdr)。cdr亦称为超变结构域，且存在于抗体每条重链和轻链的可变区中。它是在其一级结构中具有极高可变性的部位，在每条多肽重链和轻链的一级结构中有3个单独的cdr。在本说明书中，对于抗体的cdr，重链的cdr用自重链氨基酸序列的氨基末端侧开始的cdrh1、cdrh2和cdrh3表示，轻链的cdr用自轻链氨基酸序列的氨基末端侧开始的cdrl1、cdrl2和cdrl3表示。这些部位在三级结构中彼此接近，并决定抗体与之结合的抗原的特异性。

本文所用术语“第二抗体”是指与抗体分子特异性结合，从而与该抗体分子交联的抗体。

本文所用短语“在严格条件下进行杂交”是指其中在以下条件下进行杂交的过程：可通过在市售杂交溶液expresshybhybridizationsolution(clontech，inc.制造)中于68℃进行杂交，或者通过使用dna固定在之上的滤器(filter)，在0.7-1.0mnacl存在下于68℃进行杂交，接着使用0.1-2xssc溶液(1xssc溶液由150mmnacl和15mm柠檬酸钠组成)于68℃进行洗涤或在其等同条件下，在这样的条件下实现鉴定。

本文在描述“包括一个至几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列”时所用术语“几个氨基酸”是指选自2-10的任意数目的氨基酸残基。更具体地讲，当取代、缺失或添加10个以下氨基酸，5-6个以下氨基酸，或2-3个以下氨基酸时，使用“包括几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列”的描述。

例如，本文所用“具有包含seqidno:34的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区”的描述按与“包含seqidno:34的氨基酸残基20-141的重链可变区序列”的描述相同的含义使用。此外，例如，“具有包含seqidno:34的氨基酸残基20-471的氨基酸序列的重链”的描述按与“包含seqidno:34的氨基酸残基20-471的重链序列”的描述相同的含义使用。

1.有关细胞凋亡相关基因

本发明的抗体需要与特异性抗原结合，并通过抗原显示细胞毒性活性。此外，必需选择特异性地存在于肿瘤细胞中的抗原以防止正常细胞被杀死。这类抗原组的一个实例可包括肿瘤坏死因子(本说明书下文中亦称为“tnf”)相关细胞凋亡诱导配体(本说明书下文中亦称为“trail”)受体组。trail是蛋白质tnf家族的成员，包括fas配体和tnf-α(wileysr等，immunity1995年12月；3(6):673-82)。这些蛋白质是强的细胞凋亡诱导因子。

这些tnf家族蛋白质的受体的特征在于胞外域中富含半胱氨酸的重复序列。这些受体当中，作为fas配体的受体的fas和作为tnfα的受体的tnf受体i(本说明书下文中亦称为“tnfri”)在胞内域内具有凋亡信号转导所必需的区域，称为“死亡结构域”，其是与果蝇自杀基因reaper显示同源性的区域(golstein，p.等(1995)cell.81，185-186；以及white，k等(1994)science264，677-683)，通称为含有死亡结构域的受体。

已鉴定出trail的5种受体，其中，2种受体(dr4(trail-r1)和dr5(trail-r2))能够转导凋亡信号，其它3种受体(dcr1(trail-r3)、dcr2(trail-r4)和护骨蛋白(opg))不转导凋亡信号。与fas和tnfri类似，dr4和dr5两者在胞内区段中包括死亡结构域，并通过含有fas相关死亡结构域蛋白(本说明书下文中称为“fadd”)和胱天蛋白酶8的途径转导凋亡信号(chaudharypm等，immunity1997年12月；7(6):813-20；以及schneiderp等，immunity1997年12月；7(6):821-30)。对于上述fas、tnfri、dr4或dr5，已知与这些分子的任一种结合并起激动剂作用的抗体显示针对细胞表面上带有该分子的细胞的凋亡诱导活性(journalofcellularphysiology，209:1221-1028(2006)；leukemia，apl；21(4):805-812(2007)；blood，99:1666-1675(2002)；以及cellularimmunology，jan；153(1):184-193(1994))。上述激动性抗体的药理作用通过与第二抗体或效应子细胞交联而提高(journalofimmunology，149:3166-3173(1992)；以及europeanjournalofimmunology，oct；23(10):2676-2681(1993))。

人dr5(死亡受体5)基因的核苷酸序列及其氨基酸序列在genbank以gi:22547118(登录号:nm_147187)登记。顺便提一句，编码具有在dr5的氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列并还具有相当于dr5的生物活性的蛋白质的核苷酸序列也包括在术语“dr5基因的核苷酸序列”的含义内。此外，具有在dr5的氨基酸序列中包括一个至几个氨基酸的取代、缺失或添加的氨基酸序列并还具有相当于dr5的生物活性的蛋白质也包括在术语“dr5”的含义内。

2.抗dr5抗体的产生

可通过用dr5或选自dr5的氨基酸序列的任意多肽免疫动物，并按照通用程序收集和纯化体内产生的抗体，来获得针对本发明的dr5的抗体。用作抗原的dr5的生物种类不限于人，动物可用来源于非人动物(例如小鼠或大鼠)的dr5免疫。在这种情况下，可通过检查与所获得的异源dr5和人dr5结合的抗体的交叉反应性，选择适用于人类疾病的抗体。

此外，可按照已知方法(例如kohler和milstein，nature，(1975)256，第495-497页，kennet，r.主编,monoclonalantibodies,第365-367页，plenumpress，n.y.(1980))，通过使产生抗dr5抗体的产抗体细胞与骨髓瘤细胞融合以建立杂交瘤，来获得单克隆抗体。

顺便提一句，可通过使宿主细胞表达dr5基因的遗传工程，来获得将用作抗原的dr5。

具体地讲，产生能够表达dr5基因的载体，将所得载体转染至宿主细胞以表达该基因，然后纯化所表达的dr5。在下文中，将具体地描述获得抗dr5抗体的方法。

(1)抗原的制备

用于产生抗dr5抗体的抗原的实例包括dr5、包含含有至少6个dr5的连续氨基酸的部分氨基酸序列的多肽，和通过向其中加入指定氨基酸序列或载体获得的衍生物。

dr5可直接从人肿瘤组织或肿瘤细胞中纯化并使用。此外，可通过体外合成dr5或通过遗传工程使宿主细胞产生dr5，来获得dr5。

就遗传工程而言，具体地讲，将dr5cdna整合到能够表达dr5cdna的载体中，在含有转录和翻译所必需的酶、底物和能量物质的溶液中合成dr5，或者转化另一种原核或真核宿主细胞以表达dr5，籍此可获得抗原。

此外，还可通过使dr5的胞外域(其是一种膜蛋白质)与抗体的恒定区连接而获得的融合蛋白在合适的宿主-载体系统中表达，来获得作为分泌蛋白的抗原。

可通过例如所谓的pcr方法来获得dr5cdna，所述pcr方法使用含有dr5cdna的cdna文库作为模板和特异性扩增dr5cdna的引物进行聚合酶链式反应(下文中称为“pcr”)(参见saiki，r.k.等，science，(1988)239，第487-489页)。

至于用于多肽的体外合成的系统，可例示由rochediagnostics，inc.制造的快速翻译系统(rapidtranslationsystem,rts)，但是不限于此。

原核宿主细胞的实例包括大肠杆菌(escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)。为了用靶基因转化宿主细胞，使用含有复制子(即来源于与宿主相容的物种的复制起点)和调节序列的质粒载体转化宿主细胞。此外，载体优选具有能够赋予转化细胞表型选择性的序列。

真核宿主细胞的实例包括脊椎动物细胞、昆虫细胞和酵母细胞。作为脊椎动物细胞，常使用例如猿猴cos细胞(gluzman,y.,cell,(1981)23,第175-182页,atcccrl-1650)、鼠成纤维细胞nih3t3(atcc号.crl-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞；atcc:ccl-61)的二氢叶酸还原酶缺陷型品系(urlaub,g.和chasin,l.a.,proc.natl.acad.sci.usa(1980)77,第4126-4220页)等，然而，并不限于此。

可按照通用程序培养如此获得的转化体，并且通过培养转化体，在胞内或胞外产生目标多肽。

用于培养的合适培养基可选自各种常用的培养基，这取决于所采用的宿主细胞。如果使用大肠杆菌，则可使用例如按需要补充抗生素(例如氨苄西林或ipmg)的lb培养基。

可通过利用蛋白质的物理或化学性质的各种已知分离方法中的任一种，来分离并纯化通过这类培养由转化体在胞内或胞外产生的重组蛋白。

所述方法的具体实例包括用普通蛋白质沉淀剂处理、超滤、各种类型的液相层析法例如分子筛层析法(凝胶过滤)、吸附层析法、离子交换层析法和亲和层析法、透析及其组合。

此外，可通过使6个组氨酸残基的标签与待表达的重组蛋白连接，用镍亲和柱有效地纯化蛋白质。或者，可通过使iggfc区与待表达的重组蛋白连接，用a蛋白柱有效地纯化蛋白质。

可通过联合上述方法，以高收率和高纯度容易地产生大量目标多肽。

(2)抗dr5单克隆抗体的产生

与dr5特异性结合的抗体的实例包括与dr5特异性结合的单克隆抗体，获得所述抗体的方法如下所述。

单克隆抗体的产生一般需要以下操作步骤：

(a)纯化待用作抗原的生物聚合物；

(b)通过抗原注射对动物进行免疫，以制备产抗体的细胞，收集血液，测定其抗体效价，以确定何时摘除脾；

(c)制备骨髓瘤细胞(下文中称为“骨髓瘤“)；

(d)使产抗体细胞与骨髓瘤融合；

(e)筛选产生目标抗体的杂交瘤群；

(f)杂交瘤分裂为单一细胞克隆(克隆形成)；

(g)任选培养杂交瘤或饲养植入杂交瘤的动物以产生大量的单克隆抗体；

(h)针对生物活性和结合特异性检查如此产生的单克隆抗体，或针对作为标记的试剂的性质测定所述抗体等。

在下文中，根据上述步骤，将更详细地描述产生单克隆抗体的方法，然而，方法不限于此，例如，可使用脾细胞和骨髓瘤以外的产抗体的细胞。

(a)抗原的纯化

作为抗原，可以使用通过上述方法制备的dr5或其部分肽。

此外，由表达dr5的重组细胞制备的膜级分或表达dr5的重组细胞本身，以及通过本领域技术人员已知方法化学合成的本发明蛋白质的部分肽也可用作抗原。

(b)产抗体细胞的制备

将步骤(a)中获得的抗原与佐剂(例如弗氏完全佐剂或不完全佐剂)或硫酸钾铝混合，使用所得混合物作为免疫原免疫实验动物。作为实验动物，可以使用用于已知杂交瘤产生方法的任何动物而无任何困难。具体地讲，可以使用例如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、马等。然而，从可得到待与提取的产抗体细胞融合的骨髓瘤细胞的容易性而言，优选使用小鼠或大鼠作为待免疫的动物。

此外，待使用的小鼠或大鼠的品系没有特别限制，在小鼠的情况下，可使用例如a、akr、balb/c、bdp、ba、ce、c3h、57bl、c57bl、c57l、dba、fl、hth、ht1、lp、nzb、nzw、rf、riii、sjl、swr、wb和129等各种品系，在大鼠的情况下，可使用例如wistar、low、lewis、sprague、dawley、aci、bn、fischer等。

其中，考虑到与下述骨髓瘤细胞融合的相容性，在小鼠的情况下特别优选balb/c品系，在大鼠的情况下特别优选wistar和low品系，作为待免疫的动物。

此外，考虑到人和小鼠间的抗原同源性，还优选使用生物功能降低以除去自身抗体的小鼠，即患自身免疫病的小鼠。

小鼠或大鼠在免疫时的周龄优选为5-12周龄，更优选6-8周龄。

为了用dr5或其重组蛋白免疫动物，可采用例如详细描述于以下文献的已知方法：例如weir,d.m.,handbookofexperimentalimmunology第i.ii.iii.卷,blackwellscientificpublications,oxford(1987)；kabat,e.a.和mayer,m.m.,experimentalimmunochemistry,charlescthomaspublisherspringfield,illinois(1964)等。

从免疫动物中无菌地取出包括产抗体细胞的脾细胞或淋巴细胞。此时，测量抗体效价，如果抗体效价充分提高的动物用作产抗体细胞的供应源，则可更有效地进行后续程序。

测量待用于本文的抗体效价的方法的实例包括ria方法和elisa方法，但方法不限于此。

可按照已知方法，将产抗体的细胞从免疫动物的脾细胞或淋巴细胞中进行分离(例如kohler等，nature(1975)，256，第495页；kohler等,eur.j.immunol.(1977)，6，第511页；milstein等，nature(1977)，266，第550页；walsh，nature(1977)，266，第495页)。

(c)骨髓瘤细胞(下文中称为“骨髓瘤“)

用于细胞融合的骨髓瘤细胞没有特别限制，合适的细胞可选自已知的细胞系。然而，考虑到当杂交瘤选自融合细胞时的方便性，优选使用其选择程序已确立的hgprt(次黄嘌呤-鸟嘌呤转磷酸核糖基酶)缺陷型品系。

更具体地讲，hgprt缺陷型品系的实例包括来源于小鼠的x63-ag8(x63)、ns1-ans/1(ns1)、p3x63-ag8.u1(p3u1)、x63-ag8.653(x63.653)、sp2/0-ag14(sp2/0)、mpc11-45.6tg1.7(45.6tg)、f0、s149/5xxo和bu.1；来源于大鼠的210.rsy3.ag.1.2.3(y3)；以及来源于人的u266ar(sko-007)、gm1500·gtg-a12(gm1500)、uc729-6、licr-low-hmy2(hmy2)和8226ar/nip4-1(np41)。

(d)细胞融合

可按照已知方法(weir,d.m.handbookofexperimentalimmunology第i.ii.iii.卷,blackwellscientificpublications,oxford(1987)；kabat,e.a.和mayer,m.m.,experimentalimmunochemistry,charlescthomaspublisher,spigfield,illinois(1964)等)，在使得细胞的存活率不过度降低的条件下，合适地进行产抗体细胞与骨髓瘤细胞间的融合。

作为这类方法，可以采用例如其中产抗体细胞和骨髓瘤细胞在含有高浓度聚合物(例如聚乙二醇)的溶液中混合的化学方法、使用电刺激的物理方法等。

(e)杂交瘤群的选择

选择通过上述细胞融合获得的杂交瘤的方法没有特别限制。通常采用hat(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)选择方法(kohler等，nature(1975)，256，第495页；milstein等，nature(1977)，266，第550页)。

当使用在氨基蝶呤存在下无法存活的hgprt缺陷型品系的骨髓瘤细胞获得杂交瘤时，该方法是有效的。

就是说，通过在hat培养基中培养未融合的细胞和杂交瘤，仅选择性地允许对氨基蝶呤有抗性的杂交瘤存活和增殖。

(f)分裂成单个细胞克隆(克隆形成)

作为杂交瘤的克隆方法，可采用已知方法例如甲基纤维素方法、软琼脂糖方法或有限稀释方法(参见例如barbara,b.m.和stanley,m.s.:selectedmethodsincellularimmunology,w.h.freemanandcompany,sanfrancisco(1980))。在这些方法中，特别优选三维培养方法，例如甲基纤维素方法。例如，将通过细胞融合产生的杂交瘤群悬浮于甲基纤维素培养基例如clonacell-hy选择培养基d(由stemcelltechnologies，inc.制造，#03804)中并培养。然后，收集所形成的杂交瘤集落，藉此可获得单克隆杂交瘤。培养所收集的各个杂交瘤集落，选出在所获得的杂交瘤培养上清液中证实具有稳定抗体效价的杂交瘤作为产生dr5单克隆抗体的杂交瘤品系。

由此确立的杂交瘤品系的实例包括dr5杂交瘤b273。顺便提一句，在本说明书中，由杂交瘤b273产生的抗体称为“b273抗体”或简称“b273”。b273抗体的重链具有序列表中seqidno:8所示氨基酸序列。此外，b273抗体的轻链具有序列表中seqidno:10所示氨基酸序列。顺便提一句，在序列表的seqidno:8所示重链氨基酸序列中，包含氨基酸残基1-19的氨基酸序列是信号序列，包含氨基酸残基20-141的氨基酸序列是可变区，而包含氨基酸残基142-465的氨基酸序列是恒定区。此外，在序列表的seqidno:10所示轻链氨基酸序列中，包含氨基酸残基1-19的氨基酸序列是信号序列，包含氨基酸残基20-133的氨基酸序列是可变区，而包含氨基酸残基134-238的氨基酸序列是恒定区。

序列表的seqidno:8所示重链氨基酸序列由序列表的seqidno:7所示核苷酸序列编码。在序列表的seqidno:7所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列编码抗体的重链信号序列，包含核苷酸58-423的核苷酸序列编码抗体的重链可变区，而包含核苷酸424-1395的核苷酸序列编码抗体的重链恒定区。

序列表的seqidno:10所示轻链氨基酸序列由序列表的seqidno:9所示核苷酸序列编码。在序列表的seqidno:9所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列编码抗体的轻链信号序列，包含核苷酸58-399的核苷酸序列编码抗体的轻链可变区，而包含核苷酸400-714的核苷酸序列编码抗体的轻链恒定区。

(g)通过培养杂交瘤制备单克隆抗体

通过培养如此选出的杂交瘤，可有效地获得单克隆抗体。然而，在培养前，优选对产生目标单克隆抗体的杂交瘤进行筛选。

在这类筛选中，可采用已知的方法。

可通过例如上述(b)项中解释的elisa方法，进行本发明的抗体效价的测量。

通过上述方法获得的杂交瘤可以冻结态保存在液氮中或保存在-80℃以下的致冷器中。

在完成克隆后，从ht培养基交换培养基至正常培养基中，并培养杂交瘤。

通过使用大培养瓶的旋转培养或通过旋动培养进行大量培养。可采用本领域技术人员已知方法(例如凝胶过滤)，从通过大量培养获得的上清液中，通过纯化获得与本发明的蛋白质特异性结合的单克隆抗体。

此外，将杂交瘤注射入与杂交瘤同一品系的小鼠(例如上述balb/c)或nu/nu小鼠的腹腔中以使杂交瘤增殖，藉此可获得含有大量本发明的单克隆抗体的腹水。

在将杂交瘤给予腹腔内的情况下，如果在给予杂交瘤前(3-7天前)给予矿物油例如2,6,10,14-四甲基十五烷(姥鲛烷)，则可获得大量腹水。

例如，事先将免疫抑制药注射入与杂交瘤相同品系的小鼠腹腔以使t细胞失活。此后20天，将10⁶-10⁷个杂交瘤克隆细胞悬浮于无血清培养基(0.5ml)中，将悬液注射入小鼠腹腔。通常在腹部膨胀并充满腹水时，从小鼠中收集腹水。通过该方法，可以获得浓度是培养液浓度约100倍以上的单克隆抗体。

通过上述方法获得的单克隆抗体可通过描述于以下文献的方法纯化：例如weir,d.m.:handbookofexperimentalimmunology第i,ii,iii卷,blackwellscientificpublications,oxford(1978)。

如此获得的单克隆抗体对dr5具有高度抗原特异性。

(h)单克隆抗体的测定

可如下确定如此获得的单克隆抗体的同种型和亚类。

首先，鉴定方法的实例包括ouchterlony方法、elisa方法和ria方法。

ouchterlony方法简单，但是当单克隆抗体的浓度低时，需要浓缩操作。

另一方面，当采用elisa方法或ria方法时，通过使培养上清液与抗原吸附固相直接反应，并使用相当于免疫球蛋白同种型和亚类的各种类型的抗体作为第二抗体，便可鉴定出单克隆抗体的同种型和亚类。

另外，作为较简单方法，亦可使用市售鉴定试剂盒(例如由bio-radlaboratories，inc.制造的mousetyper试剂盒)等。

此外，可通过folinlowry方法和基于280nm处吸光度的计算方法[1.4(od280)＝免疫球蛋白1mg/ml]，来进行蛋白质的定量测定。

此外，即使当通过再次进行上述(2)的(a)-(h)步骤分别而独立地获得单克隆抗体，也有可能获得具有相当于b273的细胞毒性活性的抗体。作为这类抗体的一个实例，可例示结合与b273抗体相同的表位的抗体。如果新产生的单克隆抗体与b273抗体与之结合的部分肽或部分三级结构结合，则可确定单克隆抗体结合与b273抗体相同的表位。此外，通过证实单克隆抗体与b273抗体竞争结合dr5(即单克隆抗体抑制b273抗体和dr5之间的结合)，可以确定单克隆抗体结合与b273抗体相同的表位，即使具体的表位序列或结构未确定。在单克隆抗体结合与b273抗体相同的表位的情况下，强有力地预期单克隆抗体具有相当于b273的细胞毒性活性。

此外，如实施例4所示，可根据fab片段与dr5间的复合物的x射线衍射数据，确定位于抗体fab片段的dr5侧附近的氨基酸残基。具体地讲，在来源于任意抗体的fab片段位于序列表中seqidno:23所示氨基酸序列的26位的甘氨酸残基、34位的异亮氨酸残基、36位的谷氨酸残基、37位的天冬氨酸残基、38位的甘氨酸残基、56位的天冬氨酸残基、57位的亮氨酸残基、58位的亮氨酸残基、59位的苯丙氨酸残基、61位的亮氨酸残基和62位的精氨酸残基的附近以下距离的情况下，可以确定该抗体对与b273相同的表位具有特异性。

(3)其它抗体

本发明的抗体不仅包括上述针对dr5的单克隆抗体，而且还包括出于降低在人中的异源抗原性的目的而通过人工修饰获得的重组抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。这些抗体可采用已知方法产生。

作为嵌合抗体，其中抗体可变区和恒定区来源于不同物种的抗体，例如，可例示其中小鼠来源或大鼠来源的抗体可变区与人来源的恒定区连接的嵌合抗体(参见proc.natl.acad.sci.usa,81,6851-6855,(1984))。来源于小鼠抗人dr5抗体b273的嵌合抗体是包含以下重链和轻链及可具有任意恒定区的抗体：所述重链含有具有包含seqidno:20的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区，所述轻链含有具有包含seqidno:16的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区。作为这类嵌合抗体的一个实例，可例示包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含序列表中seqidno:20的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:16的氨基酸残基21-239的氨基酸序列。顺便提一句，在序列表的seqidno:20所示重链序列中，包含氨基酸残基1-19的氨基酸序列是信号序列，包含氨基酸残基20-141的氨基酸序列是可变区，而包含氨基酸残基142-471的氨基酸序列是恒定区。此外，在序列表的seqidno:16所示轻链氨基酸序列中，包含氨基酸残基1-20的氨基酸序列是信号序列，包含氨基酸残基21-134的氨基酸序列是可变区，而包含氨基酸残基135-239的氨基酸序列是恒定区。

序列表的seqidno:20所示重链氨基酸序列由序列表的seqidno:19所示核苷酸序列编码。在序列表的seqidno:19所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-57的核苷酸序列编码抗体的重链信号序列，包含核苷酸58-423的核苷酸序列编码抗体的重链可变区，而包含核苷酸424-1413的核苷酸序列编码抗体的重链恒定区。

序列表的seqidno:16所示轻链氨基酸序列由序列表的seqidno:15所示核苷酸序列编码。在序列表的seqidno:15所示核苷酸序列中，包含核苷酸1-60的核苷酸序列编码抗体的轻链信号序列，包含核苷酸61-402的核苷酸序列编码抗体的轻链可变区，而包含核苷酸403-717的核苷酸序列编码抗体的轻链恒定区。

作为人源化抗体，可例示以下抗体：通过仅将互补决定区(cdr)整合至人来源的抗体所获得的抗体(参见nature(1986)321，第522-525页)和通过将构架的氨基酸残基的部分以及cdr序列通过cdr移植方法(wo90/07861)移植到人抗体所获得的抗体。

然而，来源于b273抗体的人源化抗体不限于特定的人源化抗体，只要人源化抗体具有b273的cdr序列的所有6种类型，并且具有在细胞中诱导细胞凋亡的活性。顺便提一句，b273抗体的重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1(gyfmn)、由seqidno:83所示氨基酸序列组成的cdrh2(rfnpyngdtfynqkfkg)和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3(sayyfdsggyfdy)。此外，b273抗体的轻链可变区具有由序列表的seqidno:79所示氨基酸序列组成的cdrl1(rssqslvhsngntylh)、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2(kvsnrfs)和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3(sqsthvpwt)。

此外，在上述cdr之一中包括一至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的序列可用作cdr序列，来源于b273抗体的cdr修饰抗体具有此序列。在cdrl1中包括一个氨基酸残基取代的序列的实例包括由序列表的seqidno:85所示氨基酸序列组成的序列(rssqslvhsnentylh)、由seqidno:86所示氨基酸序列组成的序列(rssqslvhsnfntylh)、由seqidno:87所示氨基酸序列组成的序列(rssqslvhsnkntylh)和由seqidno:88所示氨基酸序列组成的序列(rssqslvhsnlntylh)。此外，在cdrh2中包括一个氨基酸残基取代的序列的实例包括由seqidno:89所示氨基酸序列组成的序列(rfnpynedtfynqkfkg)。

一般来讲，通过天冬酰胺和c末端侧的邻接氨基酸之间形成环状琥珀酰亚胺过渡态而对蛋白质中的天冬酰胺进行脱酰胺作用(geiger,t.和clarke,s.(1987)deamidation,isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation(肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰残基处的脱酰胺、异构化和外消旋化。造成蛋白质降解的琥珀酰亚胺连接反应).j.biol.chem.262,785-794)。环状琥珀酰亚胺过渡态形成的限速因素是邻接氨基酸侧链的大小，因此，具有最小侧链的甘氨酸可达到最快的脱酰胺速率。另一方面，通过用具有大侧链的氨基酸取代c末端侧的邻接基团，可抑制脱酰胺速率。b273抗体在cdrl1和cdrh2中具有对脱酰胺敏感的-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列。因此，本发明人制备了点突变体，其中邻接基团由甘氨酸变为赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或谷氨酸，其每一个都具有比甘氨酸大的侧链。就是说，在cdrh2中，-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突变为-n-e-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，在cdrl1中，-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突变为-n-l-(天冬酰胺-亮氨酸)序列、-n-f-(天冬酰胺-苯丙氨酸)序列、-n-k-(天冬酰胺-赖氨酸)序列或-n-e-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，藉此抑制抗体脱酰胺。

作为具有上述cdr的抗体的一个实例，可例示以下抗体：含有以下重链可变区和轻链可变区的抗体：所述重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:83所示氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3，和所述轻链可变区具有由序列表的seqidno:79所示氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3；含有以下重链可变区和轻链可变区的抗体：所述重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:89所示氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3，和所述轻链可变区具有由序列表的seqidno:85所示氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3；含有以下重链可变区和轻链可变区的抗体：所述重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:89所示氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3，和所述轻链可变区具有由序列表的seqidno:86所示氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3；含有以下重链可变区和轻链可变区的抗体：所述重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:89所示氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3，和所述轻链可变区具有由序列表的seqidno:87所示氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3；含有以下重链可变区和轻链可变区的抗体：所述重链可变区具有由序列表的seqidno:82所示氨基酸序列组成的cdrh1、由seqidno:89所示氨基酸序列组成的cdrh2和由seqidno:84所示氨基酸序列组成的cdrh3，和所述轻链可变区具有由序列表的seqidno:88所示氨基酸序列组成的cdrl1、由seqidno:80所示氨基酸序列组成的cdrl2和由seqidno:81所示氨基酸序列组成的cdrl3。

作为小鼠抗体b273(包括cdr修饰抗体)的人源化抗体的一个实例，可例示含有包含以下氨基酸序列的重链可变区的重链与含有包含以下氨基酸序列的轻链可变区的轻链的任意组合，所述重链可变区的氨基酸序列包含序列表的seqidno:34、36、38、40、42、44、46、48、50和70的任一个的氨基酸残基20-141，所述轻链可变区的氨基酸序列包含seqidno:28、30、32、52、58、62和66的任一个的氨基酸残基21-134。

作为优选的组合，可例示下列抗体：其特征在于含有包含seqidno:34的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:34的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:30的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:34的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:32的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:36的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:36的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:30的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:36的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:32的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:38的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:38的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:30的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:38的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:32的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:40的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:42的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:44的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:46的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:48的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:50的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:52的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:58的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:62的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；及其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:66的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

作为更优选的组合，可例示下列抗体：包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:34的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:34的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:30的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:34的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:32的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:36的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:36的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:30的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:36的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:32的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:38的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:38的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:30的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:38的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:32的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:40的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:42的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:44的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:46的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:48的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:50的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:52的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:58的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:62的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；及包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:66的氨基酸残基21-239的氨基酸序列。

作为进一步更优选的组合，可例示下列抗体：其特征在于含有包含seqidno:42的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:28的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:52的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:58的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:62的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体；以及其特征在于含有包含seqidno:70的氨基酸残基20-141的氨基酸序列的重链可变区和包含seqidno:66的氨基酸残基21-134的氨基酸序列的轻链可变区的抗体。

作为最优选的组合，可例示下列抗体：包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:42的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:28的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:52的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:58的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:62的氨基酸残基21-239的氨基酸序列；以及包含以下重链和轻链的抗体，所述重链具有包含seqidno:70的氨基酸残基20-471的氨基酸序列和所述轻链具有包含seqidno:66的氨基酸残基21-239的氨基酸序列。

通过使与上述重链氨基酸序列具有高度同源性的序列同与上述轻链氨基酸序列具有高度同源性的序列组合，可能选出具有相当于上述抗体每一种的细胞毒性活性的抗体。同源性一般为80％以上同源性，优选90％以上同源性，更优选95％以上同源性，最优选99％以上同源性。此外，通过在重链或轻链氨基酸序列包括一至几个氨基酸残基的取代、缺失或添加的氨基酸序列组合，也可能选出具有相当于上述抗体每一种的细胞毒性活性的抗体。待取代、缺失或添加的氨基酸残基的数目一般为10个以下，优选5-6个以下，更优选2-3个以下，最优选1个。

可应用具有默认参数的blast算法2.2.2版(altschul,stephenf.,thomasl.madden,alejandroa.jinghuizhang,zhengzhang,webbmiller和davidj.lipman(1997),“gappedblastandpsi-blast:anewgenerationofproteindatabasesearchprograms(空位化blast和psi-blast：新一代的蛋白质数据库搜索程序)”,nucleicacidsres.25:3389-3402)，测定两个氨基酸序列之间的同源性。还可通过访问网址www.ncbi.nlm.nih.gov/blast通过互联网来应用blast算法。顺便提一句，通过blast算法计算两种类型的同一性(identity/identities)和确定性(positivity/positivities)的百分比值。前者是在待测定其同源性程度的两个氨基酸序列中氨基酸残基彼此匹配时的值，后者是还要考虑具有类似化学结构的氨基酸残基获得的值。在本说明书中，当氨基酸残基彼此匹配时同一性的值用作同源性值。

顺便提一句，在序列表的seqidno:34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示的重链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-19组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基20-141组成的氨基酸序列是可变区，由氨基酸残基142-471组成的氨基酸序列是恒定区。此外，在序列表的seqidno:28、30、32、52、58、62或66所示轻链氨基酸序列中，由氨基酸残基1-20组成的氨基酸序列是信号序列，由氨基酸残基21-134组成的氨基酸序列是可变区，由氨基酸残基135-239组成的氨基酸序列是恒定区。

序列表的seqidno:34、36、38、40、42、44、46、48、50或70所示的重链氨基酸序列由序列表的seqidno:33、35、37、39、41、43、45、47、49或69所示核苷酸序列编码。在上述核苷酸序列的每一个中，由核苷酸1-57组成的核苷酸序列编码抗体的重链信号序列，由核苷酸58-423组成的核苷酸序列编码抗体的重链可变区，由核苷酸424-1413组成的核苷酸序列编码抗体的重链恒定区。

序列表的seqidno:28、30、32、52、58、62或66所示轻链氨基酸序列由序列表的seqidno:27、29、31、51、57、61或65所示核苷酸序列编码。在上述核苷酸序列的每一个中，由核苷酸1-60组成的核苷酸序列编码抗体的轻链信号序列，由核苷酸61-402组成的核苷酸序列编码抗体的轻链可变区，由核苷酸403-717组成的核苷酸序列编码抗体的轻链恒定区。

这些核苷酸序列中的任一个与另一抗体的核苷酸序列之间的同源性也可应用blast算法确定。

此外，本发明的抗体包括结合与b273抗体相同的表位的人抗体。人抗dr5抗体是指只具有来源于人染色体的抗体的基因序列的人抗体。可通过采用具有含有人抗体的重链和轻链基因的人染色体片段的产生人抗体的小鼠的方法，来获得人抗dr5抗体(参见tomizuka,k.等,naturegenetics(1997)16,第133-143页；kuroiwa,y.等,nucl.acidsres.(1998)26,第3447-3448页；yoshida,h.等,animalcelltechnology:basicandappliedaspects第10卷,第69-73页(kitagawa,y.,matsuda,t.andiijima,s.主编),kluweracademicpublishers,1999；tomizuka,k.等,proc.natl.acad.sci.usa(2000)97,第722-727页等)。

可具体如下产生这类产生人抗体的小鼠。通过产生敲除动物和转基因动物并使这些动物交配，来产生经遗传修饰的动物，其中内源免疫球蛋白重链和轻链基因基因座遭破坏，取而代之的是，通过酵母人工染色体(yac)载体等引入人免疫球蛋白重链和轻链基因基因座。

此外，按照遗传工程技术，通过使用分别编码人抗体的这类重链和轻链的cdna和优选含有所述cdna的载体，使真核细胞转化，培养产生重组人单克隆抗体的转化体，藉此还可从培养上清液中获得抗体。

在此，作为宿主，可以使用例如真核细胞，优选哺乳动物细胞例如cho细胞、淋巴细胞或骨髓瘤细胞。

此外，亦已知获取自人抗体文库筛选的噬菌体展示来源的人抗体的方法(参见wormstone,i.m.等,investigativeophthalmology&visualscience.(2002)43(7),第2301-2308页；carmen,s.等,briefingsinfunctionalgenomicsandproteomics(2002),1(2),第189-203页；siriwardena,d.等,ophthalmology(2002)109(3),第427-431页等)。

例如，可采用这样的噬菌体展示方法，其中人抗体的可变区在噬菌体表面表达作为单链抗体(scfv)，并选出与抗原结合的噬菌体(naturebiotechnology(2005),23,(9),第1105-1116页)。

通过分析根据与抗原结合选出的噬菌体的基因，可确定编码与抗原结合的人抗体的可变区的dna序列。

如果测定出与抗原结合的scfv的dna序列，则可通过制备具有该序列的表达载体并将载体导入合适的宿主以使其表达来获得人抗体(wo92/01047、wo92/20791、wo93/06213、wo93/11236、wo93/19172、wo95/01438、wo95/15388、annu.rev.immunol.(1994)12,第433-455页、naturebiotechnology(2005)23(9),第1105-1116页)。

如果新产生的人抗体结合b273抗体与之结合的部分肽或部分三级结构，则可确定所述人抗体和b273抗体与相同表位结合。此外，通过证实人抗体与b273抗体竞争结合dr5(即人抗体抑制b273抗体与dr5间的结合)，可以确定人抗体和b273抗体与相同表位结合，即使具体的表位序列或结构未确定。当证实人抗体和b273抗体与相同表位结合时，强有力地预期人抗体具有相当于b273的细胞毒性活性。

此外，如实施例4所示，可根据fab片段与dr5间的复合物的x射线衍射数据，确定位于抗体fab片段附近的dr5侧的氨基酸残基。具体地讲，在其中来源于任意抗体的fab片段位于序列表的seqidno:23所示氨基酸序列的26位的甘氨酸残基、34位的异亮氨酸残基、36位的谷氨酸残基、37位的天冬氨酸残基、38位的甘氨酸残基、56位的天冬氨酸残基、57位的亮氨酸残基、58位的亮氨酸残基、59位的苯丙氨酸残基、61位的亮氨酸残基和62位的精氨酸残基的附近(为以下距离)的情况下，可以确定该抗体结合与b273相同的表位。

通过实施例3所示的已知方法等，针对与抗原结合的性质，对通过上述方法获得的嵌合抗体、人源化抗体或人抗体进行评价，可选出优选的抗体。作为用于比较抗体性质的另一个指标的一个实例，可例示抗体稳定性。实施例10中所示的示差扫描量热法(dsc)是一种能够快速准确地测量热变性中点温度(tm)(用作蛋白质的相对构象稳定性的有利指标)的装置。可通过采用dsc测量tm值并对所述值进行比较，来比较热稳定性的差异。已知抗体的贮存稳定性显示与抗体的热稳定性有某种相关性(loriburton等,pharmaceuticaldevelopmentandtechnology(2007)12,第265-273页)，可使用热稳定性作为指标选择优选的抗体。用于选择抗体的其它指标的实例包括下列因素：在合适宿主细胞中的产量高，且在水溶液中的聚集性低。例如，显示最高产量的抗体并不总是显示最高的热稳定性，因此，必需根据上述指标进行全面评价来选择最适于给予人的抗体。

此外，其中抗体的全长重链和轻链序列使用合适的接头连接，由此获得单链免疫球蛋白的方法也是已知的(lee，h-s等，molecularimmunology(1999)36，第61-71页；shirrmann，t.等，mabs(2010)，2，(1)第1-4页)。通过使这类单链免疫球蛋白二聚化，所得二聚体可具有与本身是四聚体的抗体类似的结构和活性。此外，本发明的抗体可以是具有单一重链可变区且没有轻链序列的抗体。这类抗体称为单域抗体(sdab)或纳米抗体(nanobody)，实际上，在骆驼和美洲驼中观察到这类抗体，据报道这类抗体具有抗原结合亲和力(muyldemanss.等，proteineng.(1994)7(9)，1129-35，hamers-castermanc.等，nature(1993)363(6428)446-8)。本发明的抗体包括上述抗体。

此外，通过控制其中聚糖与本发明的抗体结合的糖基化，可能提高抗体依赖性细胞毒性活性。作为用于控制抗体的糖基化的技术，wo99/54342、wo00/61739、wo02/31140等是已知的。然而，不限于此。

在其中通过先分离抗体基因然后将基因导入合适宿主中来产生抗体的情况下，可使用合适宿主和合适表达载体的组合。抗体基因的具体实例包括编码本说明书所述抗体的重链序列的基因及编码其轻链序列的基因的组合。当宿主细胞被转化时，可能将重链序列基因和轻链序列基因插入相同的表达载体，也可能分别插入不同的表达载体。在其中真核细胞用作宿主的情况下，可以使用动物细胞、植物细胞和真核微生物。作为动物细胞，可例示下列细胞：(1)哺乳动物细胞，例如猿猴cos细胞(gluzman，y.，cell，(1981)23，第175-182页，atcccrl-1650)、鼠成纤维细胞nih3t3(atcc号.crl-1658)和中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞；atcc:ccl-61)的二氢叶酸还原酶缺陷型品系(urlaub,g.和chasin,l.a.,proc.natl.acad.sci.usa(1980)77,第4126-4220页)。此外，在其中使用原核细胞的情况下，可例示例如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。可通过经转化将目标抗体基因导入这些细胞，体外培养如此转化的细胞，获得抗体。在上述培养方法中，产量有时可根据抗体的序列而变化，因此，可能通过使用产量作为指标，在具有相当的结合活性的抗体中选出容易产生作为药物的抗体。

对本发明抗体的同种型没有限制，其实例包括igg(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、iga(iga1、iga2)、igd和ige，其优选的实例包括igg和igm，其还更优选的实例包括igg1和igg2。

此外，本发明的抗体可以是具有抗体的抗原结合部位或其修饰片段的抗体的功能性片段。可通过用蛋白酶例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体，或按照遗传工程技术修饰抗体基因并在合适的培养细胞中表达修饰基因，来获得抗体的片段。在这些抗体片段当中，具有抗体全长分子的全部或部分功能的片段可称为抗体的功能性片段。作为抗体的功能，一般可例示抗原结合活性、中和抗原活性的活性、提高抗原活性的活性、抗体依赖性细胞毒性活性、补体依赖性细胞毒性活性和补体依赖性细胞细胞毒性活性。本发明抗体的功能性片段的功能是与dr5结合的活性，优选在细胞中诱导细胞凋亡的活性，更优选通过在癌细胞中诱导细胞凋亡的细胞毒性活性。然而，本发明的抗体可具有抗体依赖性细胞毒性活性、补体依赖性细胞毒性活性和/或补体依赖性细胞细胞毒性活性以及在细胞中诱导细胞凋亡的活性。

抗体片段的实例包括fab、f(ab’)2、fv、其中重链和轻链的fv分子通过合适的接头连接的单链fv(scfv)、双链抗体(diabody/diabodies)、线性抗体和由抗体片段组成的多特异性抗体。此外，作为通过在还原条件下处理f(ab’)2获得的抗体可变区中的单价片段的fab’也包括在抗体的片段中。

此外，本发明的抗体可以是具有针对至少两种不同抗原的特异性的多特异性抗体。通常这类分子与两种抗原结合(即双特异性抗体)，然而，本文所用术语“多特异性抗体”包括对两种或更多种(例如3种)抗原具有特异性的抗体。

本发明的多特异性抗体可以是全长抗体或这类抗体的片段(例如f(ab’)2双特异性抗体)。双特异性抗体可通过连接两种类型的抗体的重链和轻链(hl对)而产生，或也可通过产生不同单克隆抗体以制备产生双特异性抗体的融合细胞的融合杂交瘤来产生(millstein等，nature(1983)305，第537-539页)。

本发明的抗体可以是单链抗体(亦称scfv)。单链抗体可通过经由多肽接头而连接抗体的重链可变区与轻链可变区来获得(pluckthun,thepharmacologyofmonoclonalantibodies,113(rosenburg和moore主编),springerverlag,newyork,第269-315页(1994),naturebiotechnology(2005),23,第1126-1136页)。此外，通过经由多肽接头而连接两个scfv分子产生的biscfv片段也可用作双特异性抗体。

产生单链抗体的方法是该技术领域已知的(参见例如美国专利号4,946,778、5,260,203、5,091,513、5,455,030等)。在这种scfv中，重链可变区和轻链可变区通过不形成缀合物的接头，优选通过多肽接头连接(huston,j.s.等,proc.natl.acad.sci.usa(1988),85,第5879-5883页)。在该scfv中，重链可变区和轻链可变区可来源于相同抗体或不同抗体。

作为用于连接可变区的多肽接头，使用例如由12-19个残基组成的指定的单链肽。

可如下获得编码scfv的dna：使用编码dna(选自编码上述抗体的重链或重链可变区的dna)的整个氨基酸序列或所需部分氨基酸序列的dna和编码轻链或其轻链可变区的dna作为模板，通过使用规定其两个末端的引物对，通过pcr方法进行扩增，并且通过使编码多肽接头部分的dna与规定其两个末端的引物对组合，使得两个末端分别与重链和轻链连接，进行进一步扩增。

此外，一旦产生编码scfv的dna，则可按照通用程序，获得含有所述dna的表达载体和由表达载体转化的宿主。此外，可按照通用程序，通过使用所得宿主，来获得scfv。按与上述相同的方式，可通过获得基因并表达基因，以在宿主中产生其抗体片段。

可使本发明的抗体多聚化以提高其对抗原的亲和力。待多聚化的抗体可为一种抗体类型或识别相同抗原的多个表位的多种抗体。作为抗体多聚化的方法，可例示iggch3结构域与两个scfv分子结合、与链霉抗生物素结合、螺旋-转角-螺旋基序的引入等。

本发明的抗体可以是多克隆抗体，其是具有不同氨基酸序列的多种抗dr5抗体类型的混合物。作为多克隆抗体的一个实例，可例示具有不同cdr的多种抗体类型的混合物。作为这类多克隆抗体，可以使用如下得到的抗体：通过培养产生不同抗体的细胞的混合物，然后从所得培养物中纯化抗体(参见wo2004/061104)。

作为修饰抗体，还可以使用与任何类型的分子(例如聚乙二醇(peg))结合的抗体。

此外，本发明的抗体可以是这些抗体的任一种与另一种药剂之间形成的缀合物的形式(免疫缀合物)。这类抗体的实例包括其中抗体与具有药理作用的放射性物质或化合物缀合的抗体(naturebiotechnology(2005)23，第1137-1146页)。

可将所得抗体纯化至同质性。抗体的分离和纯化可采用常规蛋白质分离和纯化方法进行。例如，可通过适当选择并结合柱层析法、过滤器过滤、超滤、盐沉淀、透析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电点聚焦电泳等(strategiesforproteinpurificationandcharacterization:alaboratorycoursemanual,danielr.marshak等主编,coldspringharborlaboratorypress(1996)；antibodies:alaboratorymanual.edharlowanddavidlane,coldspringharborlaboratory(1988))，来分离并纯化抗体，但方法不限于这些。

这类层析法的实例包括亲和层析法、离子交换层析法、疏水层析法、凝胶过滤层析法、反相层析法和吸附层析法。

可采用液相层析法例如hplc或fplc，进行这类层析法。

作为待用于亲和层析法的柱，可例示a蛋白柱和g蛋白柱。

例如，作为使用a蛋白柱的柱，可例示hyperd、poros、sepharoseff(pharmacia)等。此外，亦可通过使用抗原固定在其上的载体，利用抗体对抗原的结合性质，来纯化抗体。

(4)其它抗dr5抗体的具体实例

在表达dr5的细胞中诱导细胞凋亡的抗dr5抗体描述于例如wo98/51793、wo2001/83560、wo2002/94880、wo2003/54216、wo2006/83971和wo2007/22157。此外，称为替加珠单抗(tigatuzumab)(cs-1008)、来沙木单抗(lexatumumab)(hgs-etr2)、hgs-tr2j、drozitumab(apomab)、可那木单抗(amg-655)和lby135的抗dr5抗体正在临床试验中，或者过去曾经临床试验。在本申请提交日仍在临床试验中的抗dr5抗体为替加珠单抗、来沙木单抗和可那木单抗。与上述替加珠单抗、来沙木单抗、可那木单抗和drozitumab相比，本说明书中描述的新的抗dr5抗体具有优异的体外和/或体内抗肿瘤活性。

3.含有抗dr5抗体的药物

通过上述“2.抗dr5抗体的产生”项中描述的方法获得的抗体可用作药物，特别是用于癌症的治疗剂和/或预防剂，因为抗体各自在体内起细胞凋亡相关受体dr5的激动剂的作用，并通过受体诱导癌细胞的细胞凋亡以显示细胞毒性活性。

可通过测量其抑制过量表达细胞凋亡相关受体的细胞增殖中的活性，来确定抗体体外显示的杀细胞活性。

例如，培养过量表达dr5的癌细胞系，将不同浓度的抗体加入培养系统中，可测量针对病灶形成(focusformation)、集落形成和球状体增殖的抑制活性。

可通过例如将抗体给予植入过量表达dr5的肿瘤细胞系的裸小鼠，测量癌细胞的变化，来确定使用实验动物的抗体对癌症的体内治疗作用。

癌症类型的实例包括肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胃癌、肝癌、卵巢癌、结肠癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌、子宫癌包括子宫内膜癌、黑素细胞癌包括黑素瘤、纤维肉瘤、成胶质细胞瘤和血细胞癌(例如白血病和淋巴瘤)，然而，癌症的类型不限于此，只要待治疗的癌细胞表达dr5。

此外，已知针对dr5的抗体在炎性细胞中诱导细胞凋亡(j.clin.invest.1996,98(2),271-278；int.immunol.1996,8(10),1595-1602)。因此，本发明的抗体还可用作自身免疫病或炎性疾病的治疗剂。自身免疫病或炎性疾病的实例包括系统性红斑狼疮、桥本病(hashimoto’sdisease)、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、斯耶格伦综合征(sjogren’ssyndrome)、恶性贫血、艾迪生病(addison’sdisease)、硬皮病、古德帕斯彻综合征(goodpasture’ssyndrome)、克罗恩病(crohn’sdisease)、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、巴塞多病(basedow’sdisease)、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球性肾炎、再生障碍性贫血和器官移植后排斥。

待用于本发明的药物组合物中可接受的制剂中的物质优选就剂量和浓度而言对被给予药物组合物的人是无毒的。

本发明的药物组合物可含有用于药物用途的物质，所述物质能够改变或保持其ph、渗透压、粘度、透明度、颜色、等张性、无菌状态、稳定性、溶解度、释放率、吸收率和渗透性。用于药物用途的这类物质的实例包括但不限于甘氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸和赖氨酸等氨基酸；抗微生物剂；抗坏血酸、硫酸钠和亚硫酸氢钠等抗氧化剂；磷酸盐、柠檬酸盐、硼酸盐缓冲剂、碳酸氢钠和tris-hcl溶液等缓冲剂；甘露糖醇和甘氨酸等填充剂；乙二胺四乙酸盐(edta)等螯合剂；咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精和羟丙基-β-环糊精等络合剂；葡萄糖、甘露糖和糊精等增量剂；单糖和二糖等其它碳水化合物；着色剂；香料剂；稀释剂；乳化剂；聚乙烯吡咯烷酮等亲水聚合物；低分子量多肽、成盐抗衡离子、苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸和过氧化氢等防腐剂；甘油、丙二醇和聚乙二醇等溶剂；甘露糖醇和山梨糖醇等糖醇；助悬剂；山梨坦酯、聚山梨酯(包括聚山梨酯20和聚山梨酯80)、triton、氨丁三醇、卵磷脂和胆固醇等表面活性剂；蔗糖和山梨糖醇等稳定促进剂；氯化钠、氯化钾和甘露糖醇和山梨糖醇等弹性增强剂；输送剂；赋形剂和/或药用佐剂。药物用途的这些物质的量优选为抗dr5抗体重量的0.01-100倍，特别优选为0.1-10倍。本领域技术人员可根据向其施用组合物的疾病、待采用的给药途径等，适当地确定制剂中药物组合物的优选制剂。

药物组合物中赋形剂或载体可呈液体或固体的形式。合适的赋形剂或载体可为注射用水、生理盐水、人工脑脊液或常用于胃肠外给药的其它物质。此外，中性生理盐水或含有血清白蛋白的生理盐水也可用作载体。药物组合物可含有ph7.0-8.5的tris缓冲液、ph4.0-5.5的乙酸盐缓冲液或ph3.0-6.2的柠檬酸盐缓冲液。此外，这类缓冲液可补充山梨糖醇或另一种化合物。

本发明的药物组合物的实例包括含有抗dr5抗体的药物组合物和含有抗dr5抗体和至少一种癌症治疗剂的药物组合物。本发明的药物组合物可以冻干制品或液体的形式制备，作为具有所选组成和所需纯度的药剂。还可使用合适的赋形剂(例如蔗糖)，将含有抗dr5抗体的药物组合物和含有抗dr5抗体和至少一种癌症治疗剂的药物组合物制成冻干制品。

在上述药物组合物中，待与抗dr5抗体一起掺入的癌症治疗剂可与抗dr5抗体同时、分别或序贯给予，或者治疗剂和抗dr5抗体可以不同的剂量间隔给予。这类癌症治疗剂的实例包括凯素(abraxane)、卡铂、顺铂、吉西他滨、伊立替康(cpt-11)、紫杉醇、培美曲塞、索拉非尼、长春碱、5-fu和描述于wo2003/038043的药剂，然而，药剂不限于此，只要药剂是具有抗肿瘤活性的药剂。

可以制备本发明的药物组合物用于胃肠外给药或用于通过口服给药用于胃肠吸收。制剂的组成和浓度可根据给药方法确定。本发明的药物组合物中所含抗dr5抗体对dr5的亲和力越高，即其对dr5的解离常数(kd值)越低，则抗dr5抗体可显示其药物功效越大，甚至当人用剂量降低时。因此，还可根据该事实确定本发明的药物组合物用于人的剂量。至于剂量，在其中将人抗dr5抗体给予人的情况下，抗体可以约0.1-100mg/kg的剂量每1-180天给予一次。

本发明的药物组合物的剂型的实例包括注射剂包括输注剂、栓剂、经鼻剂、舌下剂和经皮吸收剂。

在下文中，将参照实施例更具体地描述本发明，然而，本发明不限于此。注意，在下列实施例中有关基因操作的各种操作按照描述于"molecularcloning"(sambrook,j.,fritsch,e.f.和maniatis,t.编著,coldspringharborlaboratorypress于1989出版)的方法进行，或在使用市售试剂或试剂盒的情况下，按照随附方案使用，除非另有说明。

[实施例1]小鼠抗体b273的产生

1)-1人dr5蛋白(人dr5胞外域/人fc融合蛋白)的产生

1)-1-1人dr5胞外域表达载体的产生

通过插入基因来构建表达人dr5蛋白(同种型2:np_671716)的载体，其中人dr5胞外域与cmv启动子下游的人igg1/fc区融合。

1)-1-2人dr5蛋白的产生

表达载体导入293freestyle细胞和收集培养上清液由invitrogencorporation(现为lifetechnologiesjapanltd.)进行。

1)-1-3人dr5蛋白的纯化

上述b)中获得的培养上清液使用a蛋白亲和柱层析法纯化。将5l培养上清液施用于用pbs平衡接着用pbs洗涤的“hitrapproteinaff”(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.,目录号17-5079-01)中。随后，将2m精氨酸溶液(ph4.0)加入柱中，收集含有人dr5蛋白的流分。将该流分加入离心过滤装置(amiconultra-4，流分分子量：10k，milliporeco.,ltd.)，用pbs进行液体置换并进行浓缩。将最终体积配制成6ml，其用作纯化的样品(rdr5-hfc)。蛋白质纯化产物的定量测定采用“microbca蛋白质测定试剂盒”(pierce#23235)进行。作为参比标准，使用试剂盒中所包含的“白蛋白标准品”。

1)-2免疫

使用5-6周龄的balb/cajcl小鼠(cleajapan，inc.)。在第0天，将1)-1-3中制备的50μgrdr5-hfc和弗式完全佐剂(wakopurechemicalindustries,ltd.制造)(按1:1的体积比)的混合物皮下给予每只小鼠颈部附近。在第14和28天，将50μgrdr5-hfc和弗式不完全佐剂(wakopurechemicalindustries,ltd.制造)(按1:1的体积比)的混合物皮下给予每只小鼠背部区域。在第42天，将50μgrdr5-hfc给予每只小鼠的腹腔，在第45天，从每只小鼠中摘取脾，用于产生杂交瘤。

1)-3杂交瘤的产生

使用peg4000(immuno-biologicallaboratoriesco.,ltd.制造)，对脾细胞和小鼠骨髓瘤p3x63ag8u.1细胞进行细胞融合，所得融合细胞用clonacell-hy选择培养基d(stemcelltechnologies，inc.制造，#03804)稀释并培养。然后，收集形成的杂交瘤集落，由此产生单克隆杂交瘤。分别培养所收集的杂交瘤集落，通过使用所得到的各个杂交瘤的培养上清液，筛选产生抗dr5抗体的杂交瘤。

1)-4通过细胞-elisa方法筛选抗体

1)-4-1人dr5突变型表达载体(pcdna3.1-dr5m)的构建

将编码人dr5蛋白(同种型2:np_671716)的cdna克隆至pcdna3.1(+)载体，并构建死亡结构域修饰的表达载体pcdna3.1-dr5m，其经设计从而表达其中死亡结构域334位处的氨基酸l被d取代的蛋白质。

1)-4-2表达抗原基因的细胞的制备

在含有10％fbs的dmem培养基中制备7.5x10⁵个细胞/ml的hek293细胞。然后，使用lipofectamine2000(lifetechnologiesjapanltd.制造)，将hek293细胞用死亡结构域修饰的dr5表达载体pcdna3.1-dr5m或用作对照的pcdna3.1模拟品(mock)转染，将各细胞悬液以50μl/孔分配在96孔半面积微量培养板(corningincorporated制造)中。在37℃和5％co2的条件下，将细胞在含有10％fbs的dmem培养基中培养过夜。在细胞-elisa(cell-elisa)中按原样使用如此获得的呈贴壁状态的转染细胞。

1)-4-3细胞-elisa

在用1)-4-2中制备的表达载体转染的hek293细胞的培养物中取出上清液后，将杂交瘤培养上清液加入用pcdna3.1-dr5m转染的hek293细胞和用pcdna3.1模拟品转染的hek293细胞的每种中，使板在4℃下静置1小时。在各孔的细胞用含有5％fbs的pbs洗涤一次后，将用含有5％fbs的pbs稀释至500倍的过氧化物酶缀合的山羊抗小鼠igg(chemiconco.,ltd.制造，#ap181p)加入各孔中，使板在4℃下静置1小时。在各孔的细胞用含有5％fbs的pbs洗涤5次后，将opd显色溶液(邻苯二胺二盐酸盐(wakopurechemicalindustries,ltd.制造)和h2o2分别以0.4mg/ml和0.6％(v/v)溶解，以25μl/孔加入用于溶解opd(0.05m柠檬酸三钠和0.1m磷酸氢二钠十水合物，ph4.5))的溶液。在不时搅拌反应混合物的同时，允许进行显色反应，通过以25μl/孔加入1mhcl终止显色反应。此后，使用读板仪(arvo，perkinelmer，inc.制造)，测量490nm处的吸光度。为了选择产生与细胞膜上表达的dr5特异性结合的抗体的杂交瘤，选出对于抗dr5抗体产生为阳性的杂交瘤，所述杂交瘤与用pcdna3.1模拟品(对照)转染的hek293细胞相比，产生在用pcdna3.1-dr5m表达载体转染的hek293细胞中显示较高吸光度的培养上清液。

1)-5通过流式细胞方法筛选抗体

1)-5-1表达抗原基因的细胞的制备

以5x10⁴个细胞/cm²将293t细胞接种到225-cm²培养瓶(sumitomobakeliteco.,ltd.制造)中，在37℃和5％co2的条件下，在含有10％fbs的dmem培养基中培养过夜。次日，使用lipofectamine2000，将293t细胞用pcdna3.1-dr5m或用作对照的pcdna3.1模拟品转染，在37℃和5％co2的条件下进一步培养过夜。次日，将用表达载体转染的293t细胞用trypleexpress(lifetechnologiesjapanltd.制造)处理。然后，细胞用含有10％fbs的dmem洗涤，此后悬浮于含有5％fbs的pbs中。将由此获得的细胞悬液用于流式细胞分析。

1)-5-2流式细胞分析

将在1)-5-1中制备的293t细胞悬液离心，取出上清液。然后，将杂交瘤培养上清液分别加入用pcdna3.1-dr5m转染的293t细胞和用pcdna3.1模拟品转染的293t细胞中以悬浮细胞，使细胞在4℃下静置1小时。在细胞用含有5％fbs的pbs洗涤两次后，将用含有5％fbs的pbs稀释1000倍的小鼠igg(完整分子)的荧光素缀合的山羊igg部分(cappelco.,ltd.制造，#55493)加入其中以悬浮细胞，使细胞在4℃下静置1小时。在细胞用含有5％fbs的pbs洗涤3次后，将细胞重悬浮于补充2μg/ml7-氨基放线菌素d(invitrogen(molecularprobes)corporation制造)的含有5％fbs的pbs中，使用流式细胞仪(fc500，beckmancoulter，inc.)进行检测。应用flowjo(treestar，inc.)分析数据。使用门(gate)排除7-氨基放线菌素d-阳性死细胞。然后，绘制活细胞的fitc荧光强度直方图。选出对于抗dr5抗体产生是阳性的杂交瘤，所述杂交瘤产生这样的样品，其在用pcdna3.1-dr5m转染的293t细胞的荧光强度直方图中产生比在用pcdna3.1模拟品(用作对照)转染的293t细胞的荧光强度直方图中强的荧光强度。

1)-6根据杀细胞作用的筛选

通过使用所选的对于1)-4和1)-5中的抗dr5抗体产生为阳性的杂交瘤的培养上清液，证实对人t-淋巴瘤细胞系jurkat的细胞死亡诱导作用。将用5mmtris-hcl(ph8.5)以50μg/ml制备的特异性affinipure山羊抗小鼠iggfc(affinipuregoatanti-mouseiggfcspecific)(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#115-005-071)以25μl/孔分配于96孔半面积微量培养板(corningincorporated制造)中，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，将杂交瘤培养上清液加入各孔中，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，按25μl/孔加入在含有10％fbs的rpmi1640培养基制备的4.0x10⁴个细胞/ml的jurkat细胞中，在37℃和5％co2的条件下培养20小时。通过使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(luminescentcellviabilityassaykit)(promegacorporation制造，#g7571)，定量测定来源于活细胞的atp的量，来评价杂交瘤培养上清液中存在的抗dr5单克隆抗体的杀细胞作用。结果，建立了产生5种类型的单克隆抗体(b086、b139、b192、b273和b467)的杂交瘤，与加入用于培养杂交瘤的培养基的情况相比，其每一种显示atp的量降低达80％以上。

1)-7单克隆抗体的同种型确定

使用小鼠单克隆同种型分型试剂盒(abdserotec，inc.制造)，确定单克隆抗体的同种型。结果，b086、b139、b192、b273和b467的同种型被证实为igg1，κ链。

1)-8单克隆抗体的制备

从植入杂交瘤的小鼠腹水(下文亦称为“抗体纯化的起始原料”)中纯化单克隆抗体。

如下制备小鼠腹水。首先，将7-8周龄的balb/cajcl-nu/nu(japanslc，inc.)小鼠用姥鲛烷处理(sigmaco.,ltd.制造)，在约3周后，将用生理盐水洗涤的杂交瘤按1x10⁷个细胞/小鼠植入腹腔。在1-2周后，收集在腹腔中蓄积的腹水，通过0.22-μm网式过滤器除菌，所得材料用作抗体纯化的起始原料。

抗体用hitrapmabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造)纯化。即，将抗体纯化的起始原料加到柱上，柱用pbs洗涤，此后，用2m精氨酸-hclph4.0进行洗脱。在中和洗脱的抗体溶液后，缓冲液用pbs置换。通过洗脱与porosg20μm柱peek，4.6mm×50mm，0.83ml(appliedbiosystems,inc.)结合的抗体，测量洗出液的吸光度(o.d.280nm)，获得抗体的浓度。具体地讲，将用pbs稀释的抗体样品加入用平衡缓冲液(30.6mm磷酸二氢钠十水合物、19.5mm磷酸一钾、0.15mnacl，ph7.0)平衡的porosg20μm中。然后，柱用平衡缓冲液洗涤，与柱结合的抗体然后用洗脱液(0.1％(v/v)hcl、0.15mnacl)洗脱。测量洗出液的吸光度(o.d.280nm)的峰面积，按照下列等式计算浓度：抗体样品的浓度(mg/ml)＝(抗体样品的峰面积)/(参比标准(人igg1)的峰面积)×参比标准的浓度(mg/ml)×样品的稀释因子。此外，使用limuluses-iisingletestwako(wakopurechemicalindustries,ltd.，含有对照标准内毒素的295-51030)和内毒素检测仪(toxinometer)(wakopurechemicalindustries,ltd.，et-301或et-5000)，测量所得抗体所含内毒素的浓度，并证实为1eu/mg以下。所得抗体用于随后的实验。

1)-9针对人癌细胞系的小鼠抗体b273的体外杀细胞活性

在含有10％fbs的rpmi1640培养基或含有10％fbs的mem(极限必需培养基)培养基中，制备4.4x10⁴个细胞/ml的人t-淋巴瘤细胞系jurkat和人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg的每一种，按45μl/孔加入白色透明底6孔微量培养板(corningincorporated制造)中，在37℃和5％co2的条件下培养过夜。将小鼠b273抗体或小鼠igg1抗体(r&dsystems，inc.制造)与相同浓度的特异性affinipure山羊抗小鼠iggfc(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#115-005-071)混合，以5μl/孔加入所得混合物中，使得小鼠b273抗体或小鼠igg1抗体的最终浓度为10,000-0.01ng/ml，将细胞在37℃和5％co2的条件下培养24小时。按照随附的方案，使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)，通过发光计(perkinelmer，inc.制造)测量来源于各孔的活细胞的atp的量。将向其中加入培养基(替换抗体溶液)的孔中所得到的值计为100％，来评价杀细胞活性(图1)。在各曲线中，细胞成活率表示为平均值±标准差(n＝3)。结果，发现小鼠b273抗体以抗体浓度依赖性方式对两种细胞系显示杀细胞作用。

[实施例2]小鼠抗体b273基因的克隆和人嵌合抗体基因的产生

2)-1小鼠抗体b273cdna的克隆和序列的测定

2)-1-1小鼠抗体b273的重链和轻链n末端氨基酸序列的测定

为了测定小鼠抗体b273重链和轻链的n末端氨基酸序列，通过sds-page分离实施例1-8中纯化的小鼠抗体b273。在分离后，将凝胶中的蛋白质从凝胶转移到pvdf膜(孔径大小：0.45μm，invitrogencorporation制造)上。膜用洗涤缓冲液(25mmnacl、10mm硼酸钠缓冲液ph8.0)洗涤，此后通过浸入染料溶液(50％甲醇、20％乙酸、0.05％考马斯亮蓝)达5分钟染色，接着用90％甲醇脱色。切取pvdf膜上显现的相当于重链的条带(具有较小迁移率的条带)和相当于轻链的条带(具有较大迁移率的条带)的部分，并采用procise(注册商标)clc蛋白质序列分析仪492clc型(appliedbiosystems,inc.)，通过自动edman方法(参见edman等(1967)eur.j.biochem.1，80)，进行鉴定其相应n末端氨基酸序列的尝试。结果，相当于小鼠抗体b273重链的条带的n末端氨基酸序列为evqlqqsgpelvkpg(序列表的seqidno:1)，相当于小鼠抗体b273轻链的条带的n末端氨基酸序列为dvvmtqtplslpvslgdqas(序列表的seqidno:2)。

2)-1-2由产生小鼠抗体b273的杂交瘤制备mrna

为了分别克隆编码小鼠抗体b273的重链和轻链cdna，使用quickprepmrnapurificationkit(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)，由产生小鼠抗体b273的杂交瘤制备mrna。

2)-1-3小鼠抗体b273cdna的克隆和序列的测定

参照见于实施例1-7中的小鼠抗体b273重链和轻链的同种型为γ1和κ的研究结果、上述2)-1-1中测定的重链和轻链的n末端氨基酸序列和kabat等人(参见kabat,e.a.等,(1991)载于sequencesofproteinsofimmunologicalinterest第i和ii卷,u.s.departmentofhealthandhumanservices)制备的抗体氨基酸序列的数据库，分别合成了与抗体基因编码区的5’末端区及其含有终止密码子的3’末端区杂交的若干寡核苷酸引物，并采用2)-1-2中制备的mrna和takaraonesteprnapcrkit(amv)(takarabio，inc.)，扩增编码重链的cdna和编码轻链的cdna。结果，编码抗体重链的cdna和编码抗体轻链的cdna可通过下列引物组扩增。

用于重链的引物组

5’-aagaattcatgggatggagctgtatc-3’(mh258e1f1：序列表的seqidno:3)

5’-aagatatcttatttaccaggagagtgggagag-3’(g1evr1：序列表的seqidno:4)

用于轻链的引物组

5’-aagaattcatgaagttgcctgttagg-3’(mk19eif1：序列表的seqidno:5)

5’-aagatatcttaacactcattcctgttgaagct-3’(序列表的kevr1:seqidno:6)

通过pcr扩增的编码重链的cdna和编码轻链的cdna的每一种使用pef6/v5-histopotaexpressionkit(invitrogencorporation)克隆，并采用基因序列分析仪(“abiprism3700dnaanalyzer；appliedbiosystems”或“appliedbiosystems3730xlanalyzer；appliedbiosystems”)测定克隆的重链和轻链的核苷酸序列的每一种。在测序反应中，采用geneamp9700(appliedbiosystems,inc.)。

已测定的编码小鼠抗体b273重链cdna的核苷酸序列由序列表的seqidno:7表示，其氨基酸序列由seqidno:8表示。编码小鼠抗体b273轻链cdna的核苷酸序列由序列表的seqidno:9表示，其氨基酸序列由序列表的seqidno:10表示。seqidno:7和8的序列见图28，seqidno:9和10的序列见图29。

此外，应用作为抗体氨基酸序列数据库的kabatman(参见proteins:structure,functionandgenetics,25(1996)，130-133)，通过比较，分析重链和轻链的氨基酸序列。结果，发现在小鼠抗体b273的重链中，由序列表的seqidno:8的氨基酸编号20-141所示氨基酸序列是可变区。还发现在小鼠抗体b273的轻链中，由序列表的seqidno:10所示氨基酸编号20-133的氨基酸序列是可变区。

2)-2嵌合抗体b273表达载体的产生

2)-2-1通用表达载体pef6kcl和pef1fccu的产生

2)-2-1-1嵌合和人源化轻链表达载体pef6kcl的构建

通过使用质粒pef6/v5-hisb(invitrogencorporation)作为模板，并且还使用下列引物进行pcr，获得自bghpa的紧接下游(序列位置：2174)到smai(序列位置：2958)的dna片段(一种含有f1复制起点和sv40启动子和起点的dna片段，下文中称为“片段a”)。

5’-ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc-3’(引物eff1：序列表的seqidno:11)

5’-aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg-3’(引物efsmar：序列表的seqidno:12)

所得到的片段a及含有编码人κ链分泌信号、人κ链恒定区和人聚腺苷酸附加信号的dna序列的dna片段(seqidno:13，下文中称为“片段b”)通过重叠延伸pcr彼此连接。如此获得的其中片段a和片段b彼此连接的dna片段用限制性内切酶kpni和smai消化，将其与用限制性内切酶kpni和smai消化的质粒pef6/v5-hisb(invitrogencorporation)连接，从而构建具有信号序列、克隆位点、人κ链恒定区和ef1启动子下游的人聚腺苷酸附加信号序列的嵌合和人源化轻链表达载体pef6kcl。

2)-2-1-2pef1/kcl的构建

将通过用限制性内切酶kpni和smai切割通过上述方法获得的pef6kcl而得到的dna片段与用kpni和smai消化的pef1/myc-hisb(invitrogencorporation)连接，由此构建质粒pef1kcl。

2)-2-1-3嵌合和人源化重链表达载体pef1fccu的构建

将含有编码信号序列和人igg1恒定区的氨基酸的dna序列的dna片段(seqidno:14)用限制性内切酶nhei和pmei消化，并且与用nhei和pmei消化的质粒pef1kcl连接，由此构建具有信号序列、克隆位点、人重链恒定区和ef1启动子下游的人聚腺苷酸附加信号序列的嵌合和人源化重链表达载体pef1fccu。

2)-2-2b273嵌合型轻链表达载体的构建

通过使用编码小鼠抗体b273轻链的cdna作为模板，并且还使用kod-plus-(toyobo，co.,ltd.)和下列引物组，扩增含有编码轻链可变区的cdna的区域。将通过用限制性内切酶ndei和bsiwi切割扩增产物获得的dna片段在用限制性内切酶ndei和bsiwi切割的位点处插入通用嵌合和人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，由此构建b273嵌合型轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/b273l”。b273嵌合型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:15表示，其氨基酸序列用seqidno:16表示。seqidno:15和16的序列见图30。顺便提一句，序列表的seqidno:16所示嵌合型轻链氨基酸序列134位处的氨基酸残基位于轻链可变区的羧基端，并且对应于序列表的seqidno:10所示小鼠抗体b273轻链氨基酸序列133位处的丙氨酸残基，然而，在seqidno:16所示氨基酸序列中，该残基已被来源于人抗体轻链的苏氨酸残基取代。

用于轻链的引物组：

5’-aaacatatggcgatgttgtgatgacccaaactccactctcc-3’(b273lf：序列表的seqidno:17)

5’-aaacgtacgtttgatttccagcttggtgcctccaccgaacg-3’(b273lr：序列表的seqidno:18)

2)-2-3b273嵌合型重链表达载体的构建

通过使用编码小鼠抗体b273重链的cdna作为模板，且另使用kod-plus-(toyobo，co.,ltd.)和下列引物组，扩增含有编码重链可变区的cdna的区域。将用限制性内切酶blpi切割扩增产物获得的dna片段在用限制性内切酶blpi切割的位点处插入通用嵌合和人源化抗体重链表达载体(pef1fccu)，由此构建b273嵌合型重链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef1fccu/b273h”。b273嵌合型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:19表示，其氨基酸序列用seqidno:20表示。seqidno:19和20的序列见图31。

用于重链的引物组：

5’-aaagctgagcgaggttcagctgcagcagtctggacctgagc-3’(b273hf：序列表的seqidno:21)

5’-aaagctgagctgactgtgagagtggtgccttggccccagtag-3’(b273hr：序列表的seqidno:22)

2)-3嵌合抗体b273的制备

2)-3-1嵌合抗体b273的产生

将对数生长期的freestyle293f细胞(invitrogencorporation)的1.2×10⁹个细胞接种到1.2l新鲜的freestyle293表达培养基(invitrogencorporation)中，通过在8％co2培养箱中在90rpm下于37℃振荡1小时来培养。将3.6mg聚乙烯亚胺(polyscience#24765)溶于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorporation)中。随后，将用purelinkhipureplasmid试剂盒(invitrogencorporation)制备的pef1fccu/b273h(0.4mg)和pef6kcl/b273l(0.8mg)悬浮于20mlopti-prosfm培养基中。然后，将20ml所得到的表达载体/opti-prosfm混合液加入20ml所得的聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合液中，轻轻搅拌所得混合物，然后放置5分钟。此后，将混合物加入freestyle293f细胞中，在8％co2培养箱中在90rpm下于37℃进行培养振荡达7天。使所得培养上清液通过一次性囊式过滤器(advantec#ccs-045-e1h)过滤。

通过pef1fccu/b273h和pef6kcl/b273l的组合获得的嵌合抗体b273被命名为“cb273”。

2)-3-2cb273的纯化

上述2)-3-1中获得的培养上清液通过包括rproteina亲和层析法(在4-6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)的两步过程进行纯化。在通过rproteina亲和层析法纯化后以及在通过陶瓷羟基磷灰石纯化后，在室温下进行缓冲液置换步骤。首先，将1100-1200ml培养上清液施加于用pbs平衡的mabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap柱(容积：1ml)串联连接)中。在将全部培养液倒入柱中后，将柱用15-30ml的pbs洗涤。随后，用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)进行洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用含有5mm磷酸钠、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液置换缓冲液。此外，将进行缓冲液置换的抗体溶液施加于用含有5mmnapi、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(japanbio-radlaboratories，inc.，bio-scalecht2-1羟基磷灰石柱(容积：2ml))中。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用cbs(含有140mm氯化钠的10mm柠檬酸盐缓冲液，ph6.0)置换液体。最后，采用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(流分分子量：30k，sartoriusco.,ltd.，在4℃下)将所得溶液浓缩，调节igg的浓度至1.0mg/ml以上，将如此获得的溶液用作纯化样品。

[实施例3]人嵌合b273(cb273)抗体活性的测量(体外)

3)-1cb273抗体与人dr5胞外域的选择结合性质研究

通过下文描述的直接elisa方法，对cb273与人trailr1-r4和小鼠trailr2的胞外域蛋白质(r&dsystems，inc.制造)的结合性质进行了研究。首先，用pbs将trailr的胞外域蛋白质的每一种稀释至1μg/ml，将稀释溶液以50μl/孔分配在免疫板(nunc，inc.制造，#442404)中，使板在4℃下静置过夜，蛋白质因此吸附到板上。次日，除去各孔的液体，将各孔用pbs洗涤一次。此后，为了抑制蛋白质的非特异性吸附，按200μl/孔分配含有3％胎牛血清的pbs，使板在室温下静置1.5小时。除去各孔的液体，将用含有3％胎牛血清的pbs稀释的cb273或可溶性人trail(alexiscorporation制造，#alx-522-003)以50μl/孔加入其中。使板在室温下静置1.5小时后，将pbs加入各孔中，然后，除去孔中的液体，孔用pbs洗涤两次。然后，按50μl/孔向其中加入cb273抗体的孔中加入用含有3％胎牛血清的pbs稀释2500倍的过氧化物酶缀合的特异性山羊抗人iggf(ab’)2片段(goatanti-humaniggf(ab’)2fragmentspecific,peroxidaseconjugated)(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#109-035-097)，并按50μl/孔向其中加入可溶性trail的孔中加入稀释2000倍的抗flagm2单克隆抗体-过氧化物酶缀合物，使板在室温下静置1小时。在将pbs加入各孔后，除去孔中的液体，将孔用pbs洗涤两次。此后，以100μl/孔加入opd显色液，藉此显色。然后，以100μl/孔加入1mhcl，藉此终止显色反应。此后，使用读板仪测量492nm处的吸光度。图2a显示cb273的结果，图2b显示可溶性trail的结果。图中的数据表示为平均值±标准差(n＝3)。结果，表明cb273与人trailr2的胞外域选择性结合。

3)-2采用biacore对cb273抗体的结合活性的评价

3)-2-1人dr5胞外域蛋白质的制备

3)-2-1-1dr5胞外域蛋白质表达载体的产生

为了构建表达由序列表的seqidno:23所示人dr5氨基酸编号1-130的氨基酸序列组成的区域(下文中称为“sdr5”)的载体，使用以下扩增sdr5的引物组：

dr5ndefw：5’-gtggcatatggctctgatcacccaacaa-3’(序列表的seqidno:24)和

dr5xhorv：5’-cgcctcgagtgattctttgtggacaca-3’(序列表的seqidno:25)，且还使用编码人dr5胞外域的cdna作为模板，进行pcr反应。所得pcr产物用ndei和xhoi切割，并克隆至pet21b(+)(novagen，inc.制造)的ndei/xhoi位点(下文简称为“pet21b(+)-sdr5”)。此外，由“pet21b(+)-sdr5”表达的重组蛋白在下文和附图中称为“rsdr5”(序列表的seqidno:26)。

3)-2-1-2dr5胞外域蛋白质(rsdr5)的产生

大肠杆菌origamib(de3)(novagen，inc.制造)用表达质粒pet21b(+)-sdr5转化，并在补充100μg/ml氨苄西林(sigmaco.,ltd.制造)和15μg/ml卡那霉素(wakopurechemicalindustries,ltd.制造)的2-yt培养基中培养，通过加入0.5mmiptg诱导dr5的部分蛋白质表达。细胞通过以6000rpm离心20分钟来收集，并悬浮于结合缓冲液(50mmtris-hclph7.5，300mmnacl)中，接着在冰上超声均化。将所得匀浆物以25000rpm离心20分钟。回收上清液，加入ni-nta(invitrogencorporation制造)中。在用结合缓冲液进行洗涤后，用洗脱缓冲液(50mmtris-hclph7.5、300mmnacl和300mm咪唑)进行洗脱。洗脱样品用透析缓冲液(50mmtris-hclph8.0、20mmnacl)透析，加入monoq中，用洗脱缓冲液(50mmtris-hclph8.0、1mnacl)进行梯度洗脱。使用pbs作为溶剂，通过凝胶过滤柱层析法(superdex7516/60，gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造)进一步纯化经洗脱的样品。在uv280nm处测量如此获得的重组蛋白的浓度(摩尔吸光常数：14855)。

3)-2-2采用biacore测量结合活性

采用biacore3000(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)，通过其中抗体被固定化抗人igg(fc)抗体俘获的俘获方法，并且使用抗原作为分析物进行测量，来测量cb273抗体和rsdr5每种的解离常数。通过胺偶联方法，将抗人igg(fc)抗体(humanantibodycapturekit，gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)以约8000ru共价固定在传感器芯片cm5(biacore，inc.)上。另以相同方式对参比细胞进行固定。作为运行缓冲液，使用hbs-ep(10mmhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta和0.05％表面活性剂p20)。在其上面固定了抗人igg(fc)抗体的芯片上，按10μl/分钟的流速加入50nmcb273抗体溶液达60秒钟，然后，按30μl/分钟的流速加入rsdr5的系列稀释液(0.63-20nm)达60秒钟，随后，监测解离相300秒钟。作为再生溶液，按10μl/分钟的流速加入3m氯化镁达30秒钟。在数据分析中，以一对一结合模型应用分析软件(biaevaluation软件，3.1版)，计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(kd；kd＝koff/kon)。采用biacore测量获得的cb273抗体的结果见图3。

3)-3cb273抗体对人癌细胞系的体外杀细胞作用

按照下列方法，研究了cb273抗体对各种癌细胞系的杀细胞作用。a2780、sk-ov-3、sk-co-1、caov-3和nih:ovcar-5(其全部均为人卵巢癌细胞系)、hct-15、colo205、ht29、sw480、sw620、dld-1、colo201和widr(其全部均为人结肠癌细胞系)、nci-h1975、nci-h292、nci-h460和nci-h358(其全部均为人肺癌细胞系)、mda-mb-231和zr-75-1(这两种为人乳腺癌细胞系)购自美国典型培养物保藏中心(americantypeculturecollection,atcc)。用含有10％胎牛血清(hyclonelaboratories,inc.制造)的培养基(下文中称为“培养基”)制备1×10⁵个细胞/ml的这些细胞系的每一种，并以50μl/孔接种在白色透明底6孔微量培养板(corningincorporated制造)中。用1μg/ml第二抗体(山羊抗人iggfc，mpbiomedicals，llc.制造)的溶液制备20000ng/ml的cb273抗体，然后用培养基制成2000、200、20和2ng/ml，将每种所得溶液以50ml/孔加入板中(最终的抗体浓度：10000、1000、100、10和1ng/ml)。使板在37℃和5％co2的条件下温育72小时后，按照随附的方案，使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)，通过发光计(bertholdtechnologies制造)测量来源于各孔活细胞的atp的量。制备向其中加入培养基和细胞悬液的孔作为阴性对照孔，制备向其只加入培养基的孔作为背景孔，并计算各试验孔的细胞成活率。在图4中，显示了用cb273抗体处理的各个癌细胞系细胞成活率的平均值±标准误差(n＝3)。cb273抗体对除sk-co-1以外的细胞系显示杀细胞活性。

使用bxpc-3和miapaca-2(这两种为人胰腺癌细胞系)、a2058和a375(这两种为人黑素瘤细胞系)、u-87mg(人成胶质细胞瘤细胞系)、an3ca(人子宫内膜癌细胞系)作为试验对象，研究了对各种癌细胞系的体外杀细胞作用。用含有10％fbs的培养基制备4.4×10⁴个细胞/ml的这些细胞系的每一种，以45μl/孔加入白色透明底6孔微量培养板(corningincorporated制造)中，使板在37℃和5％co2的条件下温育过夜。将cb273抗体与相同浓度的山羊抗人iggfc(mpbiomedicals，llc.制造)混合，然后将所得混合物加入以5μl/孔加入板中，使得cb273抗体的最终浓度为10,000-1ng/ml，使板在37℃和5％co2的条件下温育24小时。按照随附的方案，使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)通过发光计(perkinelmerinc.制造)，测量来源于各孔活细胞的atp的量。各图显示表示为平均值±标准差(n＝3)的细胞成活率。结果，cb273抗体对所研究的全部癌细胞系显示杀细胞作用(图5)。

[实施例4]cb273抗体表位的鉴定

4)-1cb273fab片段的产生

cb273用pbs透析，然后用pbs稀释至2mg/ml，并制成17ml的最终体积。向其中加入用pbs以1.7ml的量制备的0.1mm半胱氨酸(sigmaco.,ltd.制造)和用pbs以2.04ml量稀释至0.1mg/ml的木瓜蛋白酶(sigmaco.,ltd.制造)，使反应在37℃下进行5小时。5小时后，向其中加入以120mm溶于量为6.33ml的pbs中的n-乙基马来酰亚胺(tokyochemicalindustryco.,ltd.制造)以终止反应。将反应溶液加入用含有20mmnacl的50mmtris-hcl平衡的superdex20026/60(gehealthcare，co.,ltd.制造)中，收集14ml相当于fab片段的流分。

4)-2cb273fab片段-rsdr5复合物样品的制备

采用amiconultra-15(mwco：10k)(milliporeco.,ltd.制造)，将cb273fab片段浓缩至9.46mg/ml，将2ml如此浓缩的cb273fab片段与采用amiconultra-15(mwco：3k)浓缩至5.6mg/ml的2mlrsdr5混合，将所得混合物加入用含有50mmnacl的20mmtris-hcl平衡的superdex20016/60中。

收集8ml相当于复合物的流分。

4)-3cb273fab片段-rsdr5复合物的结晶和结构分析

使如此获得的rsdr5-cb273fab复合物浓缩至25mg/ml，其被用于结晶。对于结晶，采用蒸气扩散方法。将通过将等量的沉淀剂溶液(6-8％(w/v)聚乙二醇4000、20％(v/v)异丙醇、0.1m氯化锂、0.1m柠檬酸盐缓冲液(ph5.6))加入0.45-1.0μl的蛋白质溶液中所获得的溶液放入密封容器中，其中已放入0.45ml沉淀剂溶液，使得两种溶液彼此不接触，使容器在22℃下静置。3天后，获得板状晶体(0.4mmx0.3mmx0.03mm)。

将如此获得的晶体浸入补充30％(v/v)甘油的沉淀剂溶液中，然后在-180℃下氮气流中冷冻。在高能加速器研究机构(highenergyacceleratorresearchorganization)的材料结构科学研究所光子工厂(photonfactoryoftheinstituteofmaterialsstructurescience)的bl17a中，在氮气流中于95k收集x射线衍射数据。应用hkl-2000软件(hklresearch，inc.生产)，根据所得到的衍射图像，定量测量衍射强度，并计算晶体结构因子。所得晶体属于单斜晶系，空间群为c2，晶体具有以下晶胞参数：β＝110.2。

使用如此获得的结构因子和dr5(pdb代码：2h9g)和赫赛汀(herceptin)fab(pdb代码：1n8z)的三维结构坐标，进行分子置换方法，并测定相位。在计算中应用软件phaser(ccp4：collaborativecomputationalprojectno.4)。晶体在不对称单位中含有两种复合物。

应用cnx软件(accerlysinc.)对结构进行精修，并应用coot软件校正模型。重复该程序，以的分辨率，得到最终的r值为25.0％，自由r值为28.7％。最终模型由两个复合物组成，并含有cb273fabl链的氨基酸残基1-218(两个分子)、h链的氨基酸残基1-222(两个分子)、两分子中dr5的一个分子的氨基酸残基18-92和98-127、dr5另一个分子的氨基酸残基21-92和98-127以及324个水分子。未观察到dr5的氨基酸残基93-97、dr5n端的17或20个残基、dr5c端的6个残基和his标签、cb273fabl链c端1个残基和cb273fabh链c端5个残基的清晰的电子密度，因此，未构建模型。通过ramachandran图证实了该模型，发现仅l链的val56位于允许区域以外，且该氨基酸val56具有cdrl2的特有结构。

dr5和cb273fab间已确定的相互作用在不对称单位的两个分子中基本相等。位于距cb273fab以下距离的dr5的氨基酸残基(每个氨基酸残基的位置对应于seqidno:23的位置)如下：gly26、ile34、glu36、asp37、gly38、asp56、leu57、leu58、phe59、leu61和arg62。图6显示整个复合物的带状模型及其表面，图7显示dr5与cb273fab的h或l链之间的相互作用。

[实施例5]cb273抗体的人源化(1)

5)-1人源化b273(hb273)的设计

5)-1-1b273可变区的分子建模

按照一般称为同源性建模(methodsinenzymology,203,121-153,(1991))的方法，进行b273可变区的分子建模。将在蛋白质数据库(nuc.acidres.28,235-242(2000))中登记的人免疫球蛋白可变区的一级序列(可获得来源于x射线晶体结构的三维结构)与上述确定的b273可变区进行比较。结果，选择1t66作为与b273轻链可变区具有最高序列同源性的序列。此外，选择1xiw作为与b273重链可变区具有最高序列同源性的序列。根据“构架模型”通过将相当于b273轻链和重链的1t66和1xiw的坐标组合，来制作构架区的三维结构。对于b273cdr，按照thornton等人(j.mol.biol.,263,800-815,(1996))的分类，分别将cdrl1、cdrl2、cdrl3、cdrh1和cdrh2指定为16a、7a、9a、10a和10a聚簇。按照h3原则(febsletters399，1-8(1996))，将cdrh3归类为k(11)。随后，将每个cdr的代表性构象结合到构架模型中。

最后，就能量方面而言，为了得到b273可变区可能的分子模型，进行了能量计算，以排除不利的原子间接触。应用市售蛋白质三级结构预测程序prime和坐标搜索程序macromodel(llc)，进行上述程序。

5)-1-2人源化b273氨基酸序列设计

按照一般称为cdr移植的方法(proc.natl.acad.sci.usa86，10029-10033(1989))，构建人源化b273抗体。根据构架区内的氨基酸同源性选择接纳体抗体。

将b273构架区的序列与抗体氨基酸序列的kabat数据库(nuc.acidres.29，205-206(2001))中的全部人构架序列进行比较。结果，根据构架区中76％的序列同源性，选择humc3抗体作为接纳体。将humc3构架区中的氨基酸残基与b273的氨基酸残基比对，鉴定出其中使用不同氨基酸的位置。使用上文构建的b273的三维模型，分析这些残基的位置。然后，按照queen等人(proc.natl.acad.sci.usa86，10029-10033(1989))提供的标准，选出待移植到接纳体的供体残基。

按照下列实施例中所述，通过将某些选定的供体残基转移到接纳体抗体上，来构建人源化b273序列。

5)-1-2b273轻链的人源化

5)-1-2-1hb273_l1型轻链：

通过分别将序列表的seqidno:16所示cb273轻链的氨基酸编号22(缬氨酸)、27(苏氨酸)、34(丝氨酸)、35(亮氨酸)、37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、70(赖氨酸)、108(亮氨酸)、110(异亮氨酸)、112(苯丙氨酸)、125(甘氨酸)和129(亮氨酸)用异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸、谷氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、缬氨酸、酪氨酸、脯氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273轻链被命名为“hb273_l1型轻链”。

编码hb273_l1型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:27表示。此外，hb273_l1型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:28表示。seqidno:27和28的序列亦见图32。

5)-1-2-2hb273_l2型轻链：

通过分别将序列表的seqidno:16所示cb273轻链的氨基酸编号37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、108(亮氨酸)、110(异亮氨酸)、125(甘氨酸)和129(亮氨酸)用谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、缬氨酸、脯氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273轻链被命名为“hb273_l2型轻链”。

编码hb273_l2型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:29表示。此外，hb273_l2型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:30表示。seqidno:29和30的序列亦见图33。

5)-1-2-3hb273_l3型轻链：

通过分别将序列表的seqidno:16所示cb273轻链的氨基酸编号37(天冬氨酸)、38(谷氨酰胺)、108(亮氨酸)、110(异亮氨酸)、和129(亮氨酸)用谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、缬氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273轻链被命名为“hb273_l3型轻链”。

编码hb273_l3型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:31表示。此外，hb273_l3型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:32表示。seqidno:31和32的序列亦见图34。

5)-1-3b273重链的人源化

5)-1-3-1hb273_h1型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、56(甲硫氨酸)、57(赖氨酸)、59(丝氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、63(丝氨酸)、67(异亮氨酸)、86(赖氨酸)、87(丙氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、114(苯丙氨酸)、116(甘氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h1型重链”。

编码hb273_h1型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:33表示。此外，hb273_h1型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:34表示。seqidno:33和34的序列亦见图35。

5)-1-3-2hb273_h2型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、116(甘氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2型重链”。

编码hb273_h2型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:35表示。此外，hb273_h2型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:36表示。seqidno:35和36的序列亦见图36。

5)-1-3-3hb273_h3型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h3型重链”。

编码hb273_h3型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:37表示。此外，hb273_h3型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:38表示。seqidno:37和38的序列亦见图37。

5)-2hb273_l1、hb273_l2和hb273_l3型轻链表达载体的构建

合成含有编码seqidno:28的氨基酸编号21-134、seqidno:30的氨基酸编号21-134或seqidno:32的氨基酸编号21-134所表示的hb273_l1、hb273_l2或hb273_l3型轻链可变区的基因的dna(geneart,inc.artificialgenesynthesisservice)。然后，将通过用限制性内切酶ndei和bsiwi切割合成的dna所获得的各个dna片段在用限制性内切酶ndei和bsiwi切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建hb273_l1、hb273_l2和hb273_l3型轻链表达载体。如此获得的表达载体分别被命名为“pef6kcl/hb273_l1”、“pef6kcl/hb273_l2”和“pef6kcl/hb273_l3”。

5)-3hb273_h1、hb273_h2和hb273_h3型重链表达载体的构建

合成含有编码序列表的seqidno:34的氨基酸编号20-141、seqidno:36的氨基酸编号20-141或seqidno:38的氨基酸编号20-141所表示的hb273_h1、hb273_h2或hb273_h3型重链可变区的基因的dna(geneart,inc.artificialgenesynthesisservice)。然后，将通过用限制性内切酶blpi切割合成的dna所获得的各个dna片段在用限制性内切酶blpi切割的位点处插入通用人源化抗体重链表达载体(pef1fccu)，藉此构建hb273_h1、hb273_h2和hb273_h3型重链表达载体。如此获得的表达载体分别被命名为“pef1fccu/hb273_h1”、“pef1fccu/hb273_h2”和“pef1fccu/hb273_h3”。

5)-4人源化抗体的制备

5)-4-1人源化抗体的产生

将对数生长期的freestyle293f细胞(invitrogencorporation)的1.2×10⁹个细胞接种到1.2l新鲜的freestyle293表达培养基(invitrogencorporation)中，在8％co2培养箱中，在90rpm下于37℃振荡培养1小时。将3.6mg聚乙烯亚胺(polyscience#24765)溶于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorporation)中。随后，将用purelinkhipureplasmidkit(invitrogencorporation)制备的重链表达载体(0.4mg)和轻链表达载体(0.8mg)悬浮于20mlopti-prosfm培养基中。然后，将20ml所得到的表达载体/opti-prosfm混合液加入20ml所得的聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合液中，轻轻搅拌所得混合物，然后放置5分钟。此后，将混合物加入freestyle293f细胞中。3小时后，以10mm的最终浓度向其中加入z-vad-fmk(peptideinstitute,inc.)，在8％co2培养箱中在90rpm下于37℃进行培养振荡达7天。使所得培养上清液通过一次性囊式过滤器(advantec#ccs-045-e1h)过滤。

通过pef1fccu/hb273_h1和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h1/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h1和pef6kcl/hb273_l2的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h1/hb273_l2”，通过pef1fccu/hb273_h1和pef6kcl/hb273_l3的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h1/hb273_l3”，通过pef1fccu/hb273_h2和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2和pef6kcl/hb273_l2的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2/hb273_l2”，通过pef1fccu/hb273_h2和pef6kcl/hb273_l3的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2/hb273_l3”，通过pef1fccu/hb273_h3和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h3/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h3和pef6kcl/hb273_l2的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h3/hb273_l2”，通过pef1fccu/hb273_h3和pef6kcl/hb273_l3的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h3/hb273_l3”。

5)-4-2人源化抗体的纯化

将上述5)-4-1获得的培养上清液通过包括rproteina亲和层析法(在4-6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)的两步过程进行纯化。在通过rproteina亲和层析法纯化后以及在通过陶瓷羟基磷灰石纯化后，在室温下进行缓冲液置换步骤。首先，将1100-1200ml培养上清液施加于用pbs平衡的mabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap柱(容积：1ml)串联连接)中。在将全部培养液倒入柱中后，将柱用15-30ml的pbs洗涤。随后，用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)进行洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用含有5mm磷酸钠、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液置换缓冲液。此外，将进行缓冲液置换的抗体溶液施加于用含有5mmnapi、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(japanbio-radlaboratories，inc.，bio-scalecht2-1羟基磷灰石柱(容积：2ml))中。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用cbs(含有140mm氯化钠的10mm柠檬酸盐缓冲液，ph6.0)置换液体。最后，采用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(流分分子量：30k，sartoriusco.,ltd.，在4℃下)将所得溶液浓缩，调节igg的浓度至1.0mg/ml以上，将如此获得的溶液用作纯化样品。

[实施例6]人源化b273(hb273)抗体活性的测量(1)

6)-1采用biacore评价hb273抗体的结合活性

采用biacoret100(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)，通过其中抗体被固定化抗人igg(fc)抗体俘获的俘获方法并使用抗原作为分析物进行测量，来测量人源化抗dr5抗体和rsdr5每一个的解离常数。通过胺偶联方法，将约10,000ru的抗人igg(fc)抗体(humanantibodycapturekit，gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)共价固定在传感器芯片cm5(biacore，inc.)上。以相同方式同样对参比细胞进行固定。作为运行缓冲液，使用hbs-ep(10mmhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta和0.05％表面活性剂p20)。在其上面固定了抗人igg(fc)抗体的芯片上，按10μl/分钟的流速加入约20nm的抗体溶液达60秒钟，然后，按30μl/分钟的流速加入rsdr5的系列稀释液(3.13-50nm)达120秒钟，随后，监测解离相180秒钟。作为再生溶液，按10μl/分钟的流速加入3m氯化镁达30秒钟。在数据分析中，应用具有一对一结合模型的分析软件(biacoret100评价软件，2.0.1版)，计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(kd；kd＝koff/kon)。对于9种类型的人源化dr5抗体，采用biacore通过测量得到的结果见图8。

6)-2hb273抗体针对人癌细胞系的体外杀细胞活性

将用50mmtris-hcl(ph8.5)以50mg/ml制备的特异性affinipuref(ab’)2片段山羊抗人iggfc片段(affinipuref(ab’)2fragmentgoatanti-humaniggfcfragmentspecific)(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#109-006-098)按45ml/孔分配在96孔微量培养板(corningincorporated制造)中，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，以50μl/孔加入允许产生5)-4-1中的抗体的293f的培养上清液、纯化的cb273抗体(实施例2-3-2)或市售人igg(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#009-000-003)，使得最终的抗体浓度为150-1.5ng/ml，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，以50μl/孔加入在含有10％fbs的rpmi1640培养基中以4.0x10⁴个细胞/ml制备的jurkat细胞，在37℃和5％co2的条件下培养23小时。使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)，定量测定来源于活细胞的atp的量，将通过从向其中加入培养基(替换抗体溶液)的孔中得到的值作为100％，来评价各种hb273抗体的杀细胞作用。结果，如图9所示，就b273重链的人源化而言，观察到包含h1型重链的抗体显示出比包含h2或h3型重链的抗体略微低的杀细胞作用的趋势。另一方面，就b273轻链的人源化而言，发现包含设计的l1、l2和l3型轻链任一种的抗体可显示出大致相同的杀细胞作用。

[实施例7]cb273抗体的人源化(2)

7)-1人源化b273(hb273)的设计

7)-1-1人源化b273氨基酸序列的设计

根据实施例5和6中显示的人源化抗体(1)的设计结果，按照下列实施例中所述，通过将一些供体残基转移至接纳体抗体上，来构建人源化b273序列。

7)-1-2人源化b273氨基酸序列的设计

7)-1-2-1hb273_h1-1型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、57(赖氨酸)、59(丝氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、63(丝氨酸)、67(异亮氨酸)、86(赖氨酸)、87(丙氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、精氨酸、丙氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、缬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h1-1型重链”。

编码hb273_h1-1型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:39表示。此外，hb273_h1-1型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:40表示。seqidno:39和40的序列亦见图38。

7)-1-2-2hb273_h2-1型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、116(甘氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2-1型重链”。

编码hb273_h2-1型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:41表示。此外，hb273_h2-1型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:42表示。seqidno:41和42的序列亦见图39。

7)-1-2-3hb273_h2-2型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、116(甘氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2-2型重链”。

编码hb273_h2-2型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:43表示。此外，hb273_h2-2型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:44表示。seqidno:43和44的序列亦见图40。

7)-1-2-4hb273_h2-3型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、116(甘氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2-3型重链”。

编码hb273_h2-3型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:45表示。此外，hb273_h2-3型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:46表示。seqidno:45和46的序列亦见图41。

7)-1-2-5hb273_h2-4型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、62(赖氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2-4型重链”。

编码hb273_h2-4型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:47表示。此外，hb273_h2-4型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:48表示。seqidno:47和48的序列亦见图42。

7)-1-2-6hb273_h2-5型重链：

通过分别将序列表的seqidno:20所示cb273重链的氨基酸编号20(谷氨酸)、24(谷氨酰胺)、28(脯氨酸)、30(亮氨酸)、31(缬氨酸)、39(异亮氨酸)、60(组氨酸)、95(丝氨酸)、96(苏氨酸)、99(组氨酸)、103(亮氨酸)、106(苏氨酸)、110(丝氨酸)、136(苏氨酸)和137(亮氨酸)用谷氨酰胺、缬氨酸、丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苏氨酸、丝氨酸、酪氨酸、丝氨酸、精氨酸、苏氨酸、亮氨酸和缬氨酸取代而设计的人源化b273重链被命名为“hb273_h2-5型重链”。

编码hb273_h2-5型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:49表示。此外，hb273_h2-5型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:50表示。seqidno:49和50的序列亦见图43。

7)-2hb273_h1-1、hb273_h2-1、hb273_h2-2、hb273_h2-3、hb273_h2-4和hb273_h2-5型重链表达载体的构建

合成含有编码序列表的seqidno:40的氨基酸编号20-141、seqidno:42的氨基酸编号20-141、seqidno:44的氨基酸编号20-141、seqidno:46的氨基酸编号20-141、seqidno:48的氨基酸编号20-141或seqidno:50的氨基酸编号20-141所表示的hb273_h1-1、hb273_h2-1、hb273_h2-2、hb273_h2-3、hb273_h2-4或hb273_h2-5-型重链可变区的基因的dna(geneart,inc.artificialgenesynthesisservice)。然后，将用限制性内切酶blpi切割合成的dna所获得的每个dna片段在用限制性内切酶blpi切割的位点处插入通用人源化抗体重链表达载体(pef1fccu)，藉此构建hb273_h1-1、hb273_h2-1、hb273_h2-2、hb273_h2-3、hb273_h2-4和hb273_h2-5型重链表达载体。如此获得的表达载体分别被命名为“pef1fccu/hb273_h1-1”、“pef1fccu/hb273_h2-1”、“pef1fccu/hb273_h2-2”、“pef1fccu/hb273_h2-3”、“pef1fccu/hb273_h2-4”和“pef1fccu/hb273_h2-5”。

7)-3人源化抗体的制备

7)-3-1人源化抗体的产生

将对数生长期的freestyle293f细胞(invitrogencorporation)的1.2×10⁹个细胞接种到1.2l新鲜的freestyle293表达培养基(invitrogencorporation)中，在8％co2培养箱中通过在90rpm下于37℃振荡1小时进行培养。将3.6mg聚乙烯亚胺(polyscience#24765)溶于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorporation)中。随后，将用purelinkhipureplasmidkit(invitrogencorporation)制备的重链表达载体(0.4mg)和轻链表达载体(0.8mg)悬浮于20mlopti-prosfm培养基中。然后，将20ml所得到的表达载体/opti-prosfm混合液加入20ml所得的聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合液中，轻轻搅拌所得混合物，然后放置5分钟。此后，将混合物加入freestyle293f细胞中。3小时后，以10mm的最终浓度将z-vad-fmk(peptideinstitute,inc.)加入其中，在8％co2培养箱中在90rpm下于37℃进行培养振荡达7天。使所得培养上清液通过一次性囊式过滤器(advantec#ccs-045-e1h)过滤。

通过pef1fccu/hb273_h1-1和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h1-1/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2-1和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-1/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2-2和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-2/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2-3和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-3/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2-4和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-4/hb273_l1”，通过pef1fccu/hb273_h2-5和pef6kcl/hb273_l1的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-5/hb273_l1”。

7)-3-2人源化抗体的纯化

将在上述7)-3-1中获得的培养上清液通过包括rproteina亲和层析法(在4-6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)的两步过程进行纯化。在通过rproteina亲和层析法纯化后以及在通过陶瓷羟基磷灰石纯化后，在室温下进行缓冲液置换步骤。首先，将1100-1200ml培养上清液施加于用pbs平衡的mabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap柱(容积：1ml)串联连接)中。在将全部培养液倒入柱中后，将柱用15-30ml的pbs洗涤。随后，用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)进行洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用含有5mm磷酸钠、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液置换缓冲液。此外，将进行缓冲液置换的抗体溶液施加于用含有5mmnapi、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(japanbio-radlaboratories，inc.，bio-scalecht2-1羟基磷灰石柱(容积：2ml))中。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用cbs(含有140mm氯化钠的10mm柠檬酸盐缓冲液，ph6.0)置换液体。最后，采用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(流分分子量：30k，sartoriusco.,ltd.，在4℃下)将所得溶液浓缩，调节igg的浓度至1.0mg/ml以上，将如此获得的溶液用作纯化样品。

[实施例8]人源化b273(hb273)抗体活性的测量(2)

8)-1采用biacore评价hb273抗体的结合活性

采用biacoret100(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)，通过其中抗体被固定化抗人igg(fc)抗体俘获的俘获方法并使用抗原作为分析物进行测量，来测量人源化抗dr5抗体和rsdr5每种的解离常数。通过胺偶联方法，将约10,000ru的抗人igg(fc)抗体(humanantibodycapturekit，gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)共价固定在传感器芯片cm5(biacore，inc.)上。以相同方式同样对参比细胞进行固定。作为运行缓冲液，使用hbs-ep(10mmhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta和0.05％表面活性剂p20)。在其上面固定了抗人igg(fc)抗体的芯片上，按10μl/分钟的流速加入约20nm的抗体溶液达60秒钟，然后，按30μl/分钟的流速加入rsdr5的系列稀释液(3.13-50nm)达120秒钟，随后，监测解离相180秒钟。作为再生溶液，按10μl/分钟的流速加入3m氯化镁达30秒钟。在数据分析中，应用具有一对一结合模型的分析软件(biacoret100评价软件，2.0.1版)，计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(kd；kd＝koff/kon)。对于6种类型的人源化dr5抗体，采用biacore通过测量得到的结果见图10。

8)-2hb273抗体针对人癌细胞系的体外杀细胞活性

将用50mmtris-hcl(ph8.5)以50μg/ml制备的特异性affinipuref(ab’)2片段山羊抗人iggfc片段(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#109-006-098)按45ml/孔分配在96孔微量培养板(corningincorporated制造)中，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，以50μl/孔加入允许产生7)-3-1中的抗体的293f的培养上清液，使得最终的抗体浓度为150-1.5ng/ml，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，按50μl/孔加入在含有10％fbs的rpmi1640培养基中以4.0x10⁴个细胞/ml制备的jurkat细胞，在37℃和5％co2的条件下培养23小时。使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)，定量测定来源于活细胞的atp的量，并将通过从向其中加入培养基(替换抗体溶液)的孔中得到的值作为100％，来评价各种hb273抗体的杀细胞作用。结果，如图11所示，观察到hb273_h1-1/l1抗体显示比hb273_h1/l1抗体高的杀细胞活性趋势，在所述抗体基础上，设计出hb273_h1-1/l1抗体。另一方面，hb273_h2-1/l1至hb273_h2-5/l1抗体显示与hb273_h2/l1抗体大致相同的杀细胞作用，在所述抗体基础上，设计出hb273_h2-1/l1至hb273_h2-5/l1抗体。

[实施例9]自cb273抗体cdr除去脱酰胺位点

9)-1突变体的设计和表达载体的构建

9)-1-1突变体的设计

一般来讲，通过天冬酰胺和c末端侧的邻接氨基酸之间形成环状琥珀酰亚胺过渡态而在蛋白质中进行天冬酰胺的脱酰胺作用(geiger,t.和clarke,s.(1987)deamidation,isomerization,andracemizationatasparaginylandaspartylresiduesinpeptides.succinimide-linkedreactionsthatcontributetoproteindegradation(肽中天冬酰胺酰和天冬氨酰残基处的脱酰胺、异构化和外消旋化。造成蛋白质降解的琥珀酰亚胺连接反应).j.biol.chem.262,785-794)。环状琥珀酰亚胺过渡态形成的限速因素是邻接氨基酸侧链的大小，因此，具有最小侧链的甘氨酸可实现最快的脱酰胺速率。另一方面，通过将c末端侧上的邻接基团用具有大的侧链的氨基酸取代，可以抑制脱酰胺速率。b273抗体在l链和h链两者中具有对脱酰胺敏感的-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列。因此，本发明人产生其中将邻接基团由甘氨酸变为赖氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸或谷氨酸的点突变体，其每一个都有比甘氨酸大的侧链。就是说，进行突变体的设计，使得在h链中，-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突变成-n-e-(天冬酰胺-谷氨酸)序列，而在l链中，-n-g-(天冬酰胺-甘氨酸)序列突变成-n-l-(天冬酰胺-亮氨酸)序列、-n-f-(天冬酰胺-苯丙氨酸)序列、-n-k-(天冬酰胺-赖氨酸)序列或-n-e-(天冬酰胺-谷氨酸)序列。

9)-1-2hb273_l1-ne型轻链表达载体的构建

通过使用pef6kcl/hb273_l1(其是在实施例5中产生的hb273_l1型轻链表达载体)作为模板，使通过使用引物组a进行pcr获得的dna片段和通过使用引物组b进行pcr获得的dna片段通过使用引物组c的重叠延伸pcr彼此连接。将通过用限制性内切酶nhei和pmei切割如此获得的dna片段而获得的dna片段在用限制性内切酶nhei和pmei切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建其中seqidno:28的氨基酸编号54处的甘氨酸被谷氨酸取代的hb273_l1-ne型轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/hb273_l1-ne”。

编码hb273_l1-ne型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:51表示。此外，hb273_l1-ne型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:52表示。seqidno:51和52的序列亦见图44。

引物组a

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ccaatgcaggtaagtgttctcattgctatggaccagtgactg-3’(l-ne-r2：序列表的seqidno:54)

引物组b

5’-cagtcactggtccatagcaatgagaacacttacctgcattgg-3’(l-ne-f2：序列表的seqidno:55)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

引物组c

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

9)-1-3hb273_l1-nf型轻链表达载体的构建

通过使用pef6kcl/hb273_l1(其是在实施例5中产生的hb273_l1型轻链表达载体)作为模板，使通过使用引物组a进行pcr获得的dna片段和通过使用引物组b进行pcr获得的dna片段通过使用引物组c的重叠延伸pcr彼此连接。将通过用限制性内切酶nhei和pmei切割如此获得的dna片段而获得的dna片段在用限制性内切酶nhei和pmei切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建其中seqidno:28的氨基酸编号54处的甘氨酸被苯丙氨酸取代的hb273_l1-nf型轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/hb273_l1-nf”。

编码hb273_l1-nf型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:57表示。此外，hb273_l1-nf型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:58表示。seqidno:57和58的序列亦见图45。

引物组a

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ccaatgcaggtaagtgttgaaattgctatggaccagtgactg-3’(l-nf-r2：序列表的seqidno:59)

引物组b

5’-cagtcactggtccatagcaatttcaacacttacctgcattgg-3’(l-nf-f2：序列表的seqidno:60)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

引物组c

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

9)-1-4hb273_l1-nk型轻链表达载体的构建

通过使用pef6kcl/hb273_l1(其是在实施例5中产生的hb273_l1型轻链表达载体)作为模板，使通过使用引物组a进行pcr获得的dna片段和通过使用引物组b进行pcr获得的dna片段通过使用引物组c的重叠延伸pcr彼此连接。将通过用限制性内切酶nhei和pmei切割如此获得的dna片段而获得的dna片段在用限制性内切酶nhei和pmei切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建其中seqidno:28的氨基酸编号54处的甘氨酸被赖氨酸取代的hb273_l1-nk型轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/hb273_l1-nk”。

编码hb273_l1-nk型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:61表示。此外，hb273_l1-nk型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:62表示。seqidno:61和62的序列亦见图46。

引物组a

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ccaatgcaggtaagtgttcttattgctatggaccagtgactg-3’(l-nk-r2：序列表的seqidno:63)

引物组b

5’-cagtcactggtccatagcaataagaacacttacctgcattgg-3’(l-nk-f2：序列表的seqidno:64)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

引物组c

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

9)-1-5hb273_l1-nl型轻链表达载体的构建

通过使用pef6kcl/hb273_l1(其是在实施例5中产生的hb273_l1型轻链表达载体)作为模板，使通过使用引物组a进行pcr获得的dna片段和通过使用引物组b进行pcr获得的dna片段通过使用引物组c的重叠延伸pcr彼此连接。将通过用限制性内切酶nhei和pmei切割如此获得的dna片段而获得的dna片段在用限制性内切酶nhei和pmei切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建其中seqidno:28的氨基酸编号54处的甘氨酸被亮氨酸取代的hb273_l1-nl型轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/hb273_l1-nl”。

编码hb273_l1-nl型轻链的核苷酸序列用序列表的seqidno:65表示。此外，hb273_l1-nl型轻链的氨基酸序列用序列表的seqidno:66表示。seqidno:65和66的序列亦见图47。

引物组a

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ccaatgcaggtaagtgttcagattgctatggaccagtgactg-3’(l-nl-r2：序列表的seqidno:67)

引物组b

5’-cagtcactggtccatagcaatctgaacacttacctgcattgg-3’(l-nl-f2：序列表的seqidno:68)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

引物组c

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgc-3’(l-f1：序列表的seqidno:53)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccctaacac-3’(l-r1：序列表的seqidno:56)

9)-1-6hb273_h2-1-ne型重链表达载体的构建

通过使用pef1fccu/hb273_h2-1(其是在实施例7中产生的hb273_h2-1型重链表达载体)作为模板，使通过使用引物组a进行pcr获得的dna片段和通过使用引物组b进行pcr获得的dna片段通过使用引物组c的重叠延伸pcr彼此连接。通过用限制性内切酶nhei和pmei切割如此获得的dna片段而获得的dna片段在用限制性内切酶nhei和pmei切割的位点处插入通用人源化抗体重链表达载体(pef1fccu)，藉此构建其中seqidno:42的氨基酸编号75的甘氨酸被谷氨酸取代的hb273_h2-1-ne型重链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef1fccu/hb273_h2-1-ne”。

编码hb273_h2-1-ne型重链的核苷酸序列用序列表的seqidno:69表示。此外，hb273_h2-1-ne型重链的氨基酸序列用序列表的seqidno:70表示。seqidno:69和70的序列亦见图48。

引物组a

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(h-f1：序列表的seqidno:71)

5’-ctggttgtagaaggtgtcctcgttgtaggggttgaaccggcc-3’(h-ne-r2：序列表的seqidno:72)

引物组b

5’-ggccggttcaacccctacaacgaggacaccttctacaaccag-3’(h-ne-f2：序列表的seqidno:73)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(h-r1：序列表的seqidno:74)

引物组c

5’-aggtaagcttgctagcgccaccatgaaacacc-3’(h-f1：序列表的seqidno:71)

5’-ggatgccacccgtttaaacgggcccgatatctc-3’(h-r1：序列表的seqidno:74)

9)-2cdr修饰的hb273抗体的制备

9)-2-1cdr修饰的hb273抗体的产生

将对数生长期的freestyle293f细胞(invitrogencorporation)的1.2×10⁹个细胞接种到1.2l新鲜的freestyle293表达培养基(invitrogencorporation)中，在8％co2培养箱中通过在90rpm下于37℃振荡1小时进行培养。将3.6mg聚乙烯亚胺(polyscience#24765)溶于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorporation)中。随后，将用purelinkhipureplasmidkit(invitrogencorporation)制备的重链表达载体(0.4mg)和轻链表达载体(0.8mg)悬浮于20mlopti-prosfm培养基中。然后，将20ml所得到的表达载体/opti-prosfm混合液加入20ml所得的聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合液中，轻轻搅拌所得混合物，然后放置5分钟。此后，将混合物加入freestyle293f细胞中。3小时后，以10mm的最终浓度将z-vad-fmk(peptideinstitute,inc.)加入其中，在8％co2培养箱中在90rpm下于37℃进行培养振荡达7天。使所得培养上清液通过一次性囊式过滤器(advantec#ccs-045-e1h)过滤。

通过pef1fccu/hb273_h2-1-ne和pef6kcl/hb273_l1-ne的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-1-ne/hb273_l1-ne”，通过pef1fccu/hb273_h2-1-ne和pef6kcl/hb273_l1-nf的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nf”，通过pef1fccu/hb273_h2-1-ne和pef6kcl/hb273_l1-nk的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk”，通过pef1fccu/hb273_h2-1-ne和ppef6kcl/hb273_l1-nl的组合获得的cb273的人源化抗体被命名为“hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nl”。

9)-2-2cdr修饰的hb273抗体的纯化

将上述9)-2-1中获得的培养上清液通过包括rproteina亲和层析法(在4-6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)的两步过程进行纯化。在通过rproteina亲和层析法纯化后以及在通过陶瓷羟基磷灰石纯化后，在室温下进行缓冲液置换步骤。首先，将1100-1200ml培养上清液施加于用pbs平衡的mabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap柱(容积：1ml)串联连接)中。在将全部培养液倒入柱中后，将柱用15-30ml的pbs洗涤。随后，用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)进行洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用含有5mm磷酸钠、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液置换缓冲液。此外，将进行缓冲液置换的抗体溶液施加于用含有5mmnapi、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(japanbio-radlaboratories，inc.，bio-scalecht2-1羟基磷灰石柱(容积：2ml))中。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用cbs(含有140mm氯化钠的10mm柠檬酸盐缓冲液，ph6.0)置换液体。最后，采用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(流分分子量：30k，sartoriusco.,ltd.，在4℃下)将所得溶液浓缩，调节igg的浓度至1.0mg/ml以上，将如此获得的溶液用作纯化样品。

[实施例10]cdr修饰的hb273抗体活性的测量

10)-1采用biacore评价cdr修饰的hb273抗体的结合活性

采用biacoret100(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)，通过其中抗体被固定化抗人igg(fc)抗体俘获的俘获方法，并使用抗原作为分析物进行测量，来测量人源化抗dr5抗体和rsdr5每种的解离常数。通过胺偶联方法，将约10,000ru的抗人igg(fc)抗体(humanantibodycapturekit，gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)共价固定在传感器芯片cm5(biacore，inc.)上。另以相同方式对参比细胞进行固定。作为运行缓冲液，使用hbs-ep(10mmhepesph7.4、0.15mnacl、3mmedta和0.05％表面活性剂p20)。在其上面固定了抗人igg(fc)抗体的芯片上，按10μl/分钟的流速加入约20nm的抗体溶液达60秒钟，然后，按30μl/分钟的流速加入rsdr5的系列稀释液(3.13-50nm)达120秒钟，随后，监测解离相180秒钟。作为再生溶液，按10μl/分钟的流速加入3m氯化镁达30秒钟。在数据分析中，应用具有一对一结合模型的分析软件(biacoret100评价软件，2.0.1版)，计算结合速率常数(kon)、解离速率常数(koff)和解离常数(kd；kd＝koff/kon)。对于4种类型的人源化dr5抗体，采用biacore通过测量获得的结果见图12。

10)-2采用示差扫描量热法(dsc)测量人源化抗dr5抗体及其突变体的热稳定性

采用示差扫描量热法(dsc)，进行热稳定性的测量。将样品按0.5mg/ml溶于cbs缓冲液(含有10mm柠檬酸和140mmnacl，在ph6.0下制备)中，其400μl等分量用作dsc测量的样品溶液。如下设置dsc测量条件：初始温度：20℃；最终温度：100℃；升温速度：200℃/小时；过滤时间：2秒钟；反馈模式：低。作为参比溶液，使用cbs。作为dsc测量装置，所有测量都使用microcal，inc.(us)(现为gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.)制造的vp-capillarydscplatform。从得自样品溶液的扫描曲线减去基线(亦通过用参比溶液充入样品池来获得扫描曲线)来进行基线校正。整个温谱图中的峰顶温度值定义为fab区的热变性中点tm。4种类型的人源化dr5抗体的dsc测量结果见图13。

10)-3cdr修饰的hb273抗体针对人癌细胞系的体外杀细胞活性

将用50mmtris-hcl(ph8.5)以50mg/ml制备的特异性affinipuref(ab’)2片段山羊抗人iggfc片段(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#109-006-098)按45ml/孔分配在96孔微量培养板(corningincorporated制造)中，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，按50μl/孔加入允许产生9)-2-1中的抗体的293f的培养上清液，使得最终的抗体浓度为150-1.5ng/ml，使板在4℃下静置过夜。在各孔用pbs洗涤两次后，按50μl/孔加入在含有10％fbs的rpmi1640培养基中以4.0x10⁴个细胞/ml制备的jurkat细胞中，在37℃和5％co2的条件下培养23小时。使用celltiter-glo发光细胞活力测定试剂盒(promegacorporation制造，#g7571)，定量测定来源于活细胞的atp的量，并将通过从向其中加入培养基(替换抗体溶液)的孔中得到的值作为100％，来评价各种hb273抗体的杀细胞作用。4种类型的cdr修饰抗体每一种的杀细胞活性见图14。

10)-4胱天蛋白酶-3/7活化作用和hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体对人癌细胞系的体外杀细胞活性

在含有10％fbs的rpmi1640培养基或含有10％fbs的mem(极限必需培养基)培养基中，按1.1x10⁵个细胞/ml制备人结肠癌细胞系hct-15和人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg的每一种，按45μl/孔加入白色透明底96孔微量培养板(corningincorporated制造)中，在37℃和5％co2的条件下培养过夜。将hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体、cb273抗体或人igg(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造)与相同浓度的特异性affinipure山羊抗人iggfcγ片段(jacksonimmunoresearchlaboratories，inc.制造，#109-005-098)混合，按5μl/孔加入所得混合物，使得hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体、cb273抗体或人igg的最终浓度为10,000-0.1ng/ml，将细胞在37℃和5％co2的条件下培养4小时。使用caspase-glo3/7测定试剂盒(promegacorporation制造，#g8093)，通过发光计(perkinelmer，inc.制造)测量各孔中的胱天蛋白酶-3/7活性。按照试剂盒随附的方案，在室温下温育30分钟后进行测量。然后，将从向其中加入培养基(替换抗体溶液)的孔中所得到的值作为100％，来评价胱天蛋白酶-3/7活性。此外，按照实施例3-3所示方法，通过在用抗体处理后，测量在24小时时atp的量，来评价体外杀细胞活性。结果，发现hb273_h2-1-ne/l1-nk抗体具有胱天蛋白酶-3/7活化作用，且杀细胞作用与cb273抗体的作用相当(图15)。

[实施例11]cb273抗体的体内抗肿瘤作用

11)-1cb273抗体的抗肿瘤活性

11)-1-1移植人结肠癌细胞系colo205的裸小鼠中的抗肿瘤活性

将人结肠癌细胞系colo205(购自atcc)的2x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠(cann.cg-foxnl^nu/crlcrlj，购自charlesriverlaboratoriesjapan，inc.)腋区。植入后第7、14和21天，将cb273抗体以1、3或10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。使用电子数字测径器(mitutoyocorporation制造)，一周两次测量植入肿瘤的长轴和短轴，按照下列计算公式计算肿瘤体积。

肿瘤体积(mm³)＝1/2x(短轴)²(mm)x(长轴)²(mm)

结果见图16。在cb273抗体给予组中，在所有小鼠中观察到肿瘤完全消退。

11)-1-2植入人胰腺癌细胞系miapaca-2的裸小鼠的抗肿瘤活性

将人胰腺癌细胞系miapaca-2(购自atcc)的3x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第11、19、26和33天，将cb273抗体以3或10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图17。在植入后第39天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在3mg/kg给予组中为73.5％，在10mg/kg给予组中为77.4％。

11)-1-3植入人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg的裸小鼠的抗肿瘤活性

将人成胶质细胞瘤细胞系u-87mg(购自atcc)的5x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第4、11、18和25天，将cb273抗体以1、3或10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图18。在植入后第32天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在1mg/kg给予组中为99.7％，在3mg/kg给予组中为97.8％，在10mg/kg给予组中为98.0％。此外，在1mg/kg给予组中观察到10只小鼠中的2只肿瘤完全消退，在3mg/kg给予组中10只小鼠中的5只肿瘤完全消退，在10mg/kg给予组中10只小鼠的3只肿瘤完全消退。

11)-1-4植入人肺癌细胞系nci-h2122的裸小鼠的抗肿瘤活性(与紫杉醇和卡铂组合)将人肺癌细胞系nci-h2122(购自atcc)的5x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第13和20天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后第13、14、15、16和17天，以6.25mg/kg的剂量皮下给予紫杉醇。在植入后第13天，以100mg/kg的剂量腹膜内给予卡铂(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图19。在植入后第41天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为99.6％，在紫杉醇和卡铂组合给予组中为10.2％，在cb273抗体、紫杉醇和卡铂组合给予组中为99.7％。

11)-1-5植入人肺癌细胞系nci-h460的裸小鼠的抗肿瘤活性(与紫杉醇和卡铂组合)

将人肺癌细胞系nci-h460(购自atcc)的5x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第6天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量腹膜内给予荷瘤小鼠。在植入后第6、7、8、9和10天以6.25mg/kg的剂量皮下给予紫杉醇。在植入后第6天以100mg/kg的剂量腹膜内给予卡铂(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图20。在植入后第16天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为43.3％，在紫杉醇和卡铂组合给予组中为66.4％，在cb273抗体、紫杉醇和卡铂组合给予组中为79.6％。

11)-1-6植入人结肠癌细胞系dld-1的裸小鼠的抗肿瘤活性(与cpt-11组合)

将人结肠癌细胞系dld-1(购自atcc)的5x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第35天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量腹膜内给予荷瘤小鼠。在植入后第35、40和43天，以80mg/kg的剂量腹膜内给予cpt-11(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图21。在植入后第55天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为25.9％，在cpt-11给予组中为29.5％，在cb273抗体和cpt-11组合给予组中为72.7％。

11)-1-7植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠的抗肿瘤活性(与cpt-11组合)

将人结肠癌细胞系hct-15(购自atcc)的5x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第7天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后第7、10和14天，以80mg/kg的剂量腹膜内给予cpt-11(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图22。在植入后第31天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为52.8％，在cpt-11给予组中为83.5％，在cb273抗体和cpt-11组合给予组中为97.8％。

11)-1-8植入人结肠癌细胞系hct-116的裸小鼠的抗肿瘤活性(与cpt-11组合)

将人结肠癌细胞系hct-116(购自atcc)的1x10⁷个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第7天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后第7、10和14天，以65mg/kg的剂量腹膜内给予cpt-11(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图23。在植入后第28天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为13.9％，在cpt-11给予组中为89.8％，在cb273抗体和cpt-11组合给予组中为99.7％。

11)-1-9植入人黑素瘤细胞系a375的裸小鼠的抗肿瘤活性(与长春碱组合)

将人黑素瘤细胞系a375(购自atcc)的2x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第10、17和24天，将cb273抗体以10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后10天，以10mg/kg的剂量通过尾静脉给予长春碱(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图24。在植入后第46天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在cb273抗体给予组中为53.1％，在长春碱给予组中为43.6％，在cb273抗体和长春碱组合给予组中为100％，在cb273抗体和长春碱组合给予组中，在所有小鼠中观察到肿瘤完全消退。

11)-2cb273抗体和可那木单抗间抗肿瘤活性的比较

11)-2-1可那木单抗的制备

根据whodruginformation，第22卷，第2期，2008，第129-130页中描述的轻链和重链的氨基酸序列制备可那木单抗。

11)-2-1-1可那木单抗轻链表达载体的构建

合成含有编码seqidno:76的氨基酸编号21-130所示可那木单抗轻链可变区的基因的dna(geneart,inc.artificialgenesynthesisservice)。然后，将通过用限制性内切酶ndei和bsiwi切割所合成的dna而获得的dna片段在用限制性内切酶ndei和bsiwi切割的位点处插入通用人源化抗体轻链表达载体(pef6kcl)，藉此构建可那木单抗轻链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef6kcl/可那木单抗_l”。

11)-2-1-2可那木单抗重链表达载体的构建

合成含有编码序列表的seqidno:78的氨基酸编号20-141所示可那木单抗重链可变区的基因的dna(geneart,inc.artificialgenesynthesisservice)。然后，将通过用限制性内切酶blpi切割所合成的dna而获得的dna片段在用限制性内切酶blpi切割的位点处插入通用人源化抗体重链表达载体(pef1fccu)，藉此构建可那木单抗重链表达载体。如此获得的表达载体被命名为“pef1fccu/可那木单抗_h”。

11)-2-1-3可那木单抗的产生

将对数生长期的freestyle293f细胞(invitrogencorporation)的1.2×10⁹个细胞接种到1.2l新鲜的freestyle293表达培养基(invitrogencorporation)中，在8％co2培养箱中通过在90rpm下于37℃振荡1小时进行培养。将3.6mg聚乙烯亚胺(polyscience#24765)溶于20mlopti-prosfm培养基(invitrogencorporation)中。随后，将用purelinkhipureplasmidkit(invitrogencorporation)制备的重链表达载体pef1fccu/可那木单抗_h(0.4mg)和轻链表达载体pef6kcl/可那木单抗_l(0.8mg)悬浮于20mlopti-prosfm培养基中。然后，将20ml所得到的表达载体/opti-prosfm混合液加入20ml所得的聚乙烯亚胺/opti-prosfm混合液中，轻轻搅拌所得混合物，然后放置5分钟。此后，将混合物加入freestyle293f细胞中，在8％co2培养箱中，在90rpm下于37℃进行培养振荡达7天。使所得培养上清液通过一次性囊式过滤器(advantec#ccs-045-e1h)过滤。

11)-2-1-4可那木单抗的纯化

将上述11)-2-1-3中获得的培养上清液通过包括rproteina亲和层析法(在4-6℃下)和陶瓷羟基磷灰石(在室温下)的两步过程进行纯化。在通过rproteina亲和层析法纯化后以及在通过陶瓷羟基磷灰石纯化后，在室温下进行缓冲液置换步骤。首先，将1100-1200ml培养上清液施加于用pbs平衡的mabselectsure(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap柱(容积：1ml)串联连接)中。在将全部培养液倒入柱中后，将柱用15-30ml的pbs洗涤。随后，用2m精氨酸盐酸盐溶液(ph4.0)进行洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用含有5mm磷酸钠、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液置换缓冲液。此外，将进行缓冲液置换的抗体溶液施加于用含有5mmnapi、50mmmes和20mmnacl的ph6.5缓冲液平衡的陶瓷羟基磷灰石柱(japanbio-radlaboratories，inc.，bio-scalecht2-1羟基磷灰石柱(容积：2ml))中。然后，用氯化钠进行线性浓度梯度洗脱，收集含有抗体的流分。将该流分施加于脱盐柱(gehealthcarebio-sciencesco.,ltd.制造，两个hitrap脱盐柱(容积：5ml)串联连接)中，藉此用cbs(含有140mm氯化钠的10mm柠檬酸盐缓冲液，ph6.0)置换液体。最后，采用centrifugaluffilterdevicevivaspin20(流分分子量：30k，sartoriusco.,ltd.，在4℃下)将所得溶液浓缩，调节igg的浓度至1.0mg/ml以上，将如此获得的溶液用作纯化样品。

11)-2-2植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠中cb273抗体和可那木单抗间抗肿瘤活性的比较

将人结肠癌细胞系hct-15(购自atcc)的1x10⁷个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第6、13和20天，将cb273抗体或可那木单抗以3、10或30mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图25。在植入后第30天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在给予3mg/kg的cb273抗体的组中为57.9％，在给予10mg/kg的cb273抗体的组中为56.0％，在给予30mg/kg的cb273抗体的组中为53.6％，在给予3mg/kg的可那木单抗的组中为27.4％，在给予10mg/kg的可那木单抗的组中为26.9％，在给予30mg/kg的可那木单抗的组中为20.3％。

11)-2-3植入人肺癌细胞系nci-h1975的裸小鼠中cb273抗体和可那木单抗间抗肿瘤活性的比较

将人肺癌细胞系nci-h1975(购自atcc)的3x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第12、19和26天，将cb273抗体或可那木单抗以3或10mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图26。在植入后第32天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在给予3mg/kg的cb273抗体的组中为71.5％，在给予10mg/kg的cb273抗体的组中为73.3％，在给予3mg/kg的可那木单抗的组中为13.5％，在给予10mg/kg的可那木单抗的组中为12.6％。

[实施例12]hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的体内抗肿瘤作用

12)-1植入人结肠癌细胞系colo205的裸小鼠中hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的抗肿瘤活性

将人结肠癌细胞系colo205(购自atcc)的2x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第8、15和22天，将hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体或cb273抗体以0.3或3mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠(n＝10)。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图27。在给予3mg/kg的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的组中和给予0.3mg/kg的cb273抗体的组中，在所有小鼠中观察到肿瘤完全消退。此外，在给予0.3mg/kg的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的组中，观察到10只小鼠中的9只肿瘤完全消退，在给予3mg/kg的cb273抗体的组中，观察到10只小鼠的8只肿瘤完全消退。

[实施例13]hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体针对人癌细胞系的体外杀细胞活性

nci-n87、kato-iii和snu-16(其每种为人胃癌细胞系)；caki-1、achn和786-o(其每种为人肾癌细胞系)；hep3b、sk-hep-1和hepg2(c3a)(其每种为人肝癌细胞系)和ht-1080(其为人纤维肉瘤细胞系)购自美国典型培养物保藏中心(atcc)。gciy(其为人胃癌细胞系)购自riken。huh-7(其为人肝癌细胞系)购自nationalinstituteofbiomedicalinnovation。

按照下列方法，测量针对各种类型的细胞系的体外杀细胞活性。至于胃癌细胞系、肾癌细胞系和纤维肉瘤细胞系，适当继代培养的细胞通过锥虫蓝染色方法计数，此后以1x10⁵个细胞/ml在含有10％胎牛血清(hyclonelaboratories,inc.制造)的培养基(下文中称为“培养基”)中制备。在培养基中，将20μg/ml的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体与40μg/ml的第二抗体(山羊抗人igg抗体，mpbiomedicals，llc.制造)混合。然后，所得混合物用培养基稀释，藉此制备溶液，使得hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的浓度为2000、200、20或2ng/ml。将具有相应浓度的所得溶液的每一种以50μl/孔加入透明的96孔微量培养板(corningincorporated制造)中(3孔/组)，以50μl/孔(5x10³个细胞)接种细胞悬液(hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的最终浓度：10000、1000、100、10或1ng/ml)。

至于肝癌细胞系，适当继代培养的细胞通过锥虫蓝染色方法计数，此后以4x10⁴个细胞/ml在培养基中制备。在培养基中，将2μg/ml的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体与4μg/ml的第二抗体混合。然后，所得混合物用培养基稀释，藉此制备溶液，使得hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的浓度为200、20、2、0.2或0.02ng/ml。将具有相应浓度的所得溶液的每一种以50μl/孔加入黑色透明底96孔微量培养板(corningincorporated制造)中(2孔/组)，以50μl/孔(2x10³个细胞)接种细胞悬液(最终的抗体浓度：1000、100、10、1、0.1或0.01ng/ml)。

在5％co2存在下，将细胞在37℃下培养72小时，测量各孔atp的量。按照随附的方案，使用萤光素酶发光试剂(celltiter-glo，promegacorporation制造)进行atp的量的测量。即，将由细胞裂解物组分和发光底物组分组成的试验溶液以100μl/孔加入板中，接着搅拌。此后，使用发光计(bertholdtechnologies制造)，测量各孔的发光。至于胃癌细胞系、肾癌细胞系和纤维肉瘤细胞系，以100μl/孔的量将试验溶液从透明96孔微量培养板转移到白色96孔微量培养板(corningincorporated制造)中，然后，测量发光。

制备向其中加入培养基和细胞悬液的孔作为阴性对照孔，制备向其中仅加入培养基的孔作为背景孔，按照下列公式，计算各试验孔的细胞成活率。

细胞成活率(％)＝(试验孔的发光强度-背景孔的平均发光强度)/(阴性对照孔的平均发光强度-背景孔的平均发光强度)x100

在图51中，显示了用于处理的相应抗体浓度的各细胞系的细胞成活率的平均值。至于胃癌细胞系、肾癌细胞系和纤维肉瘤细胞系，标准误差用误差棒表示。hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体显示针对所测试的所有细胞系(786-o除外)的细胞毒性活性。

[实施例14]与化疗剂组合的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的体内活性的测量14)-1植入人结肠癌细胞系hct-15的裸小鼠中与5-fu组合的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的抗肿瘤活性及活性与可那木单抗的比较

将人结肠癌细胞系hct-15(购自atcc)的1x10⁷个细胞皮下植入裸小鼠腋区(cann.cg-foxnl^nu/crlcrlj，购自charlesriverlaboratoriesjapan，inc.)。植入后第7、14和21天，将hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体或可那木单抗以3mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后第7天，以160mg/kg的剂量通过尾静脉给予5-fu。以n＝6进行实验。使用电子数字测径器(mitutoyocorporation制造)，一周两次测量植入肿瘤的长轴和短轴，按照下列计算公式计算肿瘤体积。

肿瘤体积(mm³)＝1/2x(短轴)²(mm)x(长轴)²(mm)

结果见图52。在植入后第28天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体给予组中为62％，在可那木单抗给予组中为27％，在5-fu给予组中为54％，在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和5-fu组合给予组中为91％，在可那木单抗和5-fu组合给予组中为78％。即观察到hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和5-fu的联合作用，此外，在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和5-fu组合给予组中观察到比可那木单抗和5-fu组合给予组中高的抗肿瘤活性。

14)-2植入人非小细胞肺癌细胞系nci-h1975的裸小鼠中与紫杉醇组合的hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体的抗肿瘤活性和活性与可那木单抗的比较

将人非小细胞肺癌细胞系nci-h1975(购自atcc)的3x10⁶个细胞皮下植入裸小鼠腋区。在植入后第11、18和25天，将hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体或可那木单抗以3mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。在植入后第11、12、13和14天，将紫杉醇以6.25mg/kg的剂量通过尾静脉给予荷瘤小鼠。以n＝6进行实验。按与上述相同的方式，测量植入肿瘤的长轴和短轴，并计算肿瘤体积。

结果见图53。在植入后第32天，该日为最终测量日，肿瘤生长抑制率在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体给予组中为66％，在可那木单抗给予组中为40％，在紫杉醇给予组中为49％，在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和紫杉醇的组合给予组中为91％，在可那木单抗和紫杉醇的组合给予组中为79％。即观察到hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和紫杉醇的联合作用，此外，在hb273_h2-1-ne/hb273_l1-nk抗体和紫杉醇的组合给予组中观察到比可那木单抗和紫杉醇的组合给予组中高的抗肿瘤活性。

cpch1761237d序列表

<110>daiichisankyocompany,limited

<120>新的抗dr5抗体

<130>dspct-fp1141

<150>jp2010-243549

<151>2010-10-29

<160>89

<170>patentinversion3.4

<210>1

<211>15

<212>prt

<213>小鼠

<400>1

gluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallysprogly

151015

<210>2

<211>20

<212>prt

<213>小鼠

<400>2

aspvalvalmetthrglnthrproleuserleuprovalserleugly

151015

aspglnalaser

20

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物mh258e1f1

<400>3

aagaattcatgggatggagctgtatc26

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物g1evr1

<400>4

aagatatcttatttaccaggagagtgggagag32

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物mk19eif1

<400>5

aagaattcatgaagttgcctgttagg26

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物kevr1

<400>6

aagatatcttaacactcattcctgttgaagct32

<210>7

<211>1395

<212>dna

<213>小鼠

<220>

<221>cds

<222>(1)..(1395)

<400>7

atgggatggagctgtatctttctctttctcctgtcagtaactgtaggt48

metglytrpsercysilepheleupheleuleuservalthrvalgly

151015

gtgttctctgaggttcagctgcagcagtctggacctgagctggtgaag96

valphesergluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallys

202530

cctggggcttcagtgaagatatcctgcaaggcttctggttactcattt144

proglyalaservallysilesercyslysalaserglytyrserphe

354045

attggctactttatgaactggatgaagcagagccatggaaagagcctt192

ileglytyrphemetasntrpmetlysglnserhisglylysserleu

505560

gagtggattggacgttttaatccatacaatggtgatactttctacaac240

glutrpileglyargpheasnprotyrasnglyaspthrphetyrasn

65707580

cagaagttcaagggcaaggccacattgactgtagacaaatcctctacc288

glnlysphelysglylysalathrleuthrvalasplysserserthr

859095

acagcccacatggagctcctgagcctgacatctgaggactctgcagtc336

thralahismetgluleuleuserleuthrsergluaspseralaval

100105110

tatttttgtggaagatcggcgtattacttcgatagtgggggctacttt384

tyrphecysglyargseralatyrtyrpheaspserglyglytyrphe

115120125

gactactggggccaaggcaccactctcacagtctcctcagccaaaacg432

asptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserseralalysthr

130135140

acacccccatctgtctatccactggcccctggatctgctgcccaaact480

thrproproservaltyrproleualaproglyseralaalaglnthr

145150155160

aactccatggtgaccctgggatgcctggtcaagggctatttccctgag528

asnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyrpheproglu

165170175

ccagtgacagtgacctggaactctggatccctgtccagcggtgtgcac576

provalthrvalthrtrpasnserglyserleuserserglyvalhis

180185190

accttcccagctgtcctgcagtctgacctctacactctgagcagctca624

thrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleuserserser

195200205

gtgactgtcccctccagcacctggcccagcgagaccgtcacctgcaac672

valthrvalproserserthrtrpprosergluthrvalthrcysasn

210215220

gttgcccacccggccagcagcaccaaggtggacaagaaaattgtgccc720

valalahisproalaserserthrlysvalasplyslysilevalpro

225230235240

agggattgtggttgtaagccttgcatatgtacagtcccagaagtatca768

argaspcysglycyslysprocysilecysthrvalprogluvalser

245250255

tctgtcttcatcttccccccaaagcccaaggatgtgctcaccattact816

servalpheilepheproprolysprolysaspvalleuthrilethr

260265270

ctgactcctaaggtcacgtgtgttgtggtagacatcagcaaggatgat864

leuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspileserlysaspasp

275280285

cccgaggtccagttcagctggtttgtagatgatgtggaggtgcacaca912

progluvalglnphesertrpphevalaspaspvalgluvalhisthr

290295300

gctcagacgcaaccccgggaggagcagttcaacagcactttccgctca960

alaglnthrglnproargglugluglnpheasnserthrpheargser

305310315320

gtcagtgaacttcccatcatgcaccaggactggctcaatggcaaggag1008

valsergluleuproilemethisglnasptrpleuasnglylysglu

325330335

ttcaaatgcagggtcaacagtgcagctttccctgcccccatcgagaaa1056

phelyscysargvalasnseralaalapheproalaproileglulys

340345350

accatctccaaaaccaaaggcagaccgaaggctccacaggtgtacacc1104

thrileserlysthrlysglyargprolysalaproglnvaltyrthr

355360365

attccacctcccaaggagcagatggccaaggataaagtcagtctgacc1152

ileproproprolysgluglnmetalalysasplysvalserleuthr

370375380

tgcatgataacagacttcttccctgaagacattactgtggagtggcag1200

cysmetilethraspphepheprogluaspilethrvalglutrpgln

385390395400

tggaatgggcagccagcggagaactacaagaacactcagcccatcatg1248

trpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthrglnproilemet

405410415

gacacagatggctcttacttcgtctacagcaagctcaatgtgcagaag1296

aspthraspglysertyrphevaltyrserlysleuasnvalglnlys

420425430

agcaactgggaggcaggaaatactttcacctgctctgtgttacatgag1344

serasntrpglualaglyasnthrphethrcysservalleuhisglu

435440445

ggcctgcacaaccaccatactgagaagagcctctcccactctcctggt1392

glyleuhisasnhishisthrglulysserleuserhisserprogly

450455460

aaa1395

lys

465

<210>8

<211>465

<212>prt

<213>小鼠

<400>8

metglytrpsercysilepheleupheleuleuservalthrvalgly

151015

valphesergluvalglnleuglnglnserglyprogluleuvallys

202530

proglyalaservallysilesercyslysalaserglytyrserphe

354045

ileglytyrphemetasntrpmetlysglnserhisglylysserleu

505560

glutrpileglyargpheasnprotyrasnglyaspthrphetyrasn

65707580

glnlysphelysglylysalathrleuthrvalasplysserserthr

859095

thralahismetgluleuleuserleuthrsergluaspseralaval

100105110

tyrphecysglyargseralatyrtyrpheaspserglyglytyrphe

115120125

asptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserseralalysthr

130135140

thrproproservaltyrproleualaproglyseralaalaglnthr

145150155160

asnsermetvalthrleuglycysleuvallysglytyrpheproglu

165170175

provalthrvalthrtrpasnserglyserleuserserglyvalhis

180185190

thrpheproalavalleuglnseraspleutyrthrleuserserser

195200205

valthrvalproserserthrtrpprosergluthrvalthrcysasn

210215220

valalahisproalaserserthrlysvalasplyslysilevalpro

225230235240

argaspcysglycyslysprocysilecysthrvalprogluvalser

245250255

servalpheilepheproprolysprolysaspvalleuthrilethr

260265270

leuthrprolysvalthrcysvalvalvalaspileserlysaspasp

275280285

progluvalglnphesertrpphevalaspaspvalgluvalhisthr

290295300

alaglnthrglnproargglugluglnpheasnserthrpheargser

305310315320

valsergluleuproilemethisglnasptrpleuasnglylysglu

325330335

phelyscysargvalasnseralaalapheproalaproileglulys

340345350

thrileserlysthrlysglyargprolysalaproglnvaltyrthr

355360365

ileproproprolysgluglnmetalalysasplysvalserleuthr

370375380

cysmetilethraspphepheprogluaspilethrvalglutrpgln

385390395400

trpasnglyglnproalagluasntyrlysasnthrglnproilemet

405410415

aspthraspglysertyrphevaltyrserlysleuasnvalglnlys

420425430

serasntrpglualaglyasnthrphethrcysservalleuhisglu

435440445

glyleuhisasnhishisthrglulysserleuserhisserprogly

450455460

lys

465

<210>9

<211>714

<212>dna

<213>小鼠

<220>

<221>cds

<222>(1)..(714)

<400>9

atgaagttgcctgttaggctgttggtgctgatgttctggattcctgct48

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

tccagcagtgatgttgtgatgacccaaactccactctccctgcctgtc96

serserseraspvalvalmetthrglnthrproleuserleuproval

202530

agtcttggagatcaagcctccatctcttgcagatctagtcagagcctt144

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

gtacacagtaatggaaacacctatctacattggtacctgcagaagcca192

valhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

ggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattttct240

glyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

ggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcaca288

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

ctcaagatcagcagagtggaggctgaggatctgggaatttatttctgc336

leulysileserargvalglualagluaspleuglyiletyrphecys

100105110

tctcaaagtacacatgttccgtggacgttcggtggaggcaccaagctg384

serglnserthrhisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleu

115120125

gaaatcaaacgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccacca432

gluilelysargalaaspalaalaprothrvalserilephepropro

130135140

tccagtgagcagttaacatctggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttg480

sersergluglnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleu

145150155160

aacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaagtggaagattgatggc528

asnasnphetyrprolysaspileasnvallystrplysileaspgly

165170175

agtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggacagc576

sergluargglnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspser

180185190

aaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggac624

lysaspserthrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlysasp

195200205

gagtatgaacgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagaca672

glutyrgluarghisasnsertyrthrcysglualathrhislysthr

210215220

tcaacttcacccattgtcaagagcttcaacaggaatgagtgt714

serthrserproilevallysserpheasnargasnglucys

225230235

<210>10

<211>238

<212>prt

<213>小鼠

<400>10

metlysleuprovalargleuleuvalleumetphetrpileproala

151015

serserseraspvalvalmetthrglnthrproleuserleuproval

202530

serleuglyaspglnalaserilesercysargserserglnserleu

354045

valhisserasnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlyspro

505560

glyglnserprolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheser

65707580

glyvalproaspargpheserglyserglyserglythraspphethr

859095

leulysileserargvalglualagluaspleuglyiletyrphecys

100105110

serglnserthrhisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysleu

115120125

gluilelysargalaaspalaalaprothrvalserilephepropro

130135140

sersergluglnleuthrserglyglyalaservalvalcyspheleu

145150155160

asnasnphetyrprolysaspileasnvallystrplysileaspgly

165170175

sergluargglnasnglyvalleuasnsertrpthraspglnaspser

180185190

lysaspserthrtyrsermetserserthrleuthrleuthrlysasp

195200205

glutyrgluarghisasnsertyrthrcysglualathrhislysthr

210215220

serthrserproilevallysserpheasnargasnglucys

225230235

<210>11

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物eff1

<400>11

ccacgcgccctgtagcggcgcattaagc28

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物efsmar

<400>12

aaacccgggagctttttgcaaaagcctagg30

<210>13

<211>1704

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人κ链信号肽、fc区和聚腺苷酸附加信号的核苷酸序列

<400>13

ggtaccacccaagctggctaggtaagcttgctagcgccaccatggtgctgcagacccagg60

tgttcatctccctgctgctgtggatctccggcgcatatggcgatatcgtgatgattaaac120

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gcaccgcctccgtggtgtgcctgctgaataacttctaccccagagaggccaaggtgcagt240

ggaaggtggacaacgccctgcagtccgggaactcccaggagagcgtgaccgagcaggaca300

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aaaattaagttgcatcattttgtctgactaggtgtccttctataatattatggggtggag600

gggggtggtatggagcaaggggcaagttgggaagacaacctgtagggcctgcggggtcta660

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acaggcgtgaaccactgctccacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtgg960

tggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctt1020

tcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggc1080

tccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagg1140

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agtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatct1260

cggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatg1320

agctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtg1380

tggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtc1440

agcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgca1500

tctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactcc1560

gcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc1620

cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcct1680

aggcttttgcaaaaagctcccggg1704

<210>14

<211>1120

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人igg1链信号肽和fc区的核苷酸序列

<400>14

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<221>cds

<222>(1)..(717)

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valgluilelysargthrvalalaalaproservalpheilephepro

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145150155160

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165170175

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195200205

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prolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalapro

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gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

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<220>

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lysglnpheserleuargleuserservalthralaalaaspthrala

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130135140

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lysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrser

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glyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheproglu

165170175

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provalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhis

180185190

accttccccgctgtcctgcagtcctcaggactctactccctcagcagc624

thrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserser

195200205

gtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgc672

valvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecys

210215220

aacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgag720

asnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargvalglu

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prolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalapro

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asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

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proserglnthrleuserleuthrcysthrvalserglyglyserile

354045

serserglyasptyrphetrpsertrpileargglnleuproglylys

505560

glyleuglutrpileglyhisilehisasnserglythrthrtyrtyr

65707580

asnproserleulysserargvalthrileservalaspthrserlys

859095

lysglnpheserleuargleuserservalthralaalaaspthrala

100105110

valtyrtyrcysalaargaspargglyglyasptyrtyrtyrglymet

115120125

aspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserseralaserthr

130135140

lysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrser

145150155160

glyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheproglu

165170175

provalthrvalsertrpasnserglyalaleuthrserglyvalhis

180185190

thrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserser

195200205

valvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecys

210215220

asnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargvalglu

225230235240

prolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalapro

245250255

gluleuleuglyglyproservalpheleupheproprolysprolys

260265270

aspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalval

275280285

aspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalasp

290295300

glyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyr

305310315320

asnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasp

325330335

trpleuasnglylysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleu

340345350

proalaproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarg

355360365

gluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlys

370375380

asnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproserasp

385390395400

ilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlys

405410415

thrthrproprovalleuaspseraspglyserphepheleutyrser

420425430

lysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalpheser

435440445

cysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysser

450455460

leuserleuserproglylys

465470

<210>79

<211>16

<212>prt

<213>小鼠

<400>79

argserserglnserleuvalhisserasnglyasnthrtyrleuhis

151015

<210>80

<211>7

<212>prt

<213>小鼠

<400>80

lysvalserasnargpheser

15

<210>81

<211>9

<212>prt

<213>小鼠

<400>81

serglnserthrhisvalprotrpthr

15

<210>82

<211>5

<212>prt

<213>小鼠

<400>82

glytyrphemetasn

15

<210>83

<211>17

<212>prt

<213>小鼠

<400>83

argpheasnprotyrasnglyaspthrphetyrasnglnlysphelys

151015

gly

<210>84

<211>13

<212>prt

<213>小鼠

<400>84

seralatyrtyrpheaspserglyglytyrpheasptyr

1510

<210>85

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hb273_l1-ne的cdrl1

<400>85

argserserglnserleuvalhisserasngluasnthrtyrleuhis

151015

<210>86

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hb273_l1-nf的cdrl1

<400>86

argserserglnserleuvalhisserasnpheasnthrtyrleuhis

151015

<210>87

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hb273_l1-nk的cdrl1

<400>87

argserserglnserleuvalhisserasnlysasnthrtyrleuhis

151015

<210>88

<211>16

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hb273_l1-nl的cdrl1

<400>88

argserserglnserleuvalhisserasnleuasnthrtyrleuhis

151015

<210>89

<211>17

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>hb273_h2-1-ne的cdrh2

<400>89

argpheasnprotyrasngluaspthrphetyrasnglnlysphelys

151015

gly