胰高血糖素样肽‑1类似物及其用途的制作方法

本发明属于生物医学领域，涉及一种胰高血糖素样肽-1类似物及其用途。

背景技术：

胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，glp-1)具有广泛的生理作用：glp-1促进胰岛素的生物合成和分泌；增加胰腺中对葡萄糖反应的胰岛β细胞的数量，即有更多的胰岛β细胞可以参与产生胰岛素；glp-1抑制胰高血糖素分泌；glp-1抑制胰岛β细胞的凋亡，促进胰岛β细胞增殖和分化；glp-1抑制胃的排空和胃酸分泌；glp-1对进食中枢的作用；glp-1对心脏和血压的影响；glp-1减少内源性糖异生。正是由于glp-1广泛的生理作用，所以glp-1对于糖尿病，特别是那些肥胖的2型糖尿病患者来说可能成为比较理想的治疗药物。但是，机体本身所产生的活性glp-1却很容易被二肽肽酶iv(dpp-4)降解而失活，为了提高glp-1的生物活性，保持长时间有效的血浆浓度，发挥其治疗糖尿病的作用，国内外研究人员着力研发长效glp-1类似物。

在饮食诱导的糖尿病鼠上验证glp-1、gip治疗效果的实验结果显示，同时使用glp-1和gip两周的小鼠在体重降低、饮食量减少、脂沉积降低、血糖降低上都比单独使用glp-1或者gip的效果更佳(finan,maetal.2013)，而且3nmol·kg^-1glp-1和gip同时的效果相当于30nmol·kg^-1liraglutide的治疗效果。这一研究显示glp-1与gip同时使用不仅仅可以提高治疗效果，还可以大大降低用药量。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种全新的在保留降糖活性的基础上，还能降低使用剂量的胰高血糖素样肽-1类似物及其用途。

本发明首先提供含有如通式1所示氨基酸序列的蛋白质。

通式1：

xaa1-ser-glu-gly-thr-phe-xaa7-ser-asp-xaa10-ser-xaa12-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20-xaa21-phe-xaa23-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30

其中，xaa1是his或tyr；xaa7是thr或ile；xaa10是val或tyr；xaa12是ser或ile；xaa13是tyr或ala；xaa14是met或leu；xaa15是asp或glu；xaa16是gly或lys；xaa17是gln或ile；xaa18是ala或his；xaa19是ala或gln；xaa20是lys或gln；xaa21是glu或asp；xaa23是ile或val；xaa24是ala或asn；xaa27是val或leu；xaa28是lys或ala；xaa29是gly或gln；xaa30是arg或lys。

更进一步，所述蛋白质的氨基酸序列如序列表中序列1-30中任一所示。

为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下表所示的标签。

表：标签的序列

编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna、hnrna或trna等。

在本发明中，所述核酸分子具体可为如下任一：

(1)序列表中序列31-60中任一所示的dna分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的dna分子杂交且编码所述蛋白质的dna分子；

(3)与(1)或(2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性，且编码所述蛋白质的dna分子。

上述严格条件可为用6×ssc，0.5％sds的溶液，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组微生物也属于本发明的保护范围。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体为重组表达载体或重组克隆载体。在本发明中，所述重组载体具体为将所述核酸分子的5’端顺次连上肠激酶酶切位点识别序列(序列61)和strep-ii标签的编码序列(序列62)，并在所述核酸分子的3’端连上终止子序列(tgatga)后插入到pgapzαa载体的多克隆位点处后得到的重组载体(命名为pgapzαa-sglp-1)。

所述重组微生物为含有所述核酸分子的重组酵母。在本发明中，所述重组酵母具有将所述pgapzαa-sglp-1转化受体酵母细胞后得到的重组酵母。所述受体酵母具体可为gs115、x-33、km71、smd1168。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述转基因细胞系或所述重组微生物在制备具有降低血糖功能的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组载体或所述表达盒或所述转基因细胞系或所述重组微生物在制备用于治疗和/或预防糖尿病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供一种产品，其活性成分为所述蛋白质；所述产品具有如下功能中的至少一种：(a)降低血糖；(b)治疗和/或预防糖尿病。

以上所述糖尿病具体可为ii型糖尿病。

本发明中，将glp-1的第二位的氨基酸由ala替换成ser，并改变其他位点的氨基酸，让类似物同时具有glp-1及gip的生物学功能，降低类似物使用剂量，且具有降糖作用。本发明的优点在于通过氨基酸替换，构建了一种全新的降糖调脂肽，保留降糖活性的基础上，还降低了类似物的使用剂量。

附图说明

图1为glp-1样肽表达纯化设计。

图2为glp-1类似物纯化蛋白小分子胶电泳图，泳道1-6：sgp-1、sgp-5、sgp-13、sgp-19、sgp-23、sgp-25；m：小分子marker26628。

图3为glp-1类似物降糖能力检测结果。对照组为g+vehicle，n＝12，*p＜0.05。图中g表示葡萄糖，vehicle表示生理盐水。

图4为sgp-13对雄性c57小鼠降糖能力检测结果。对照组为g+vehicle，n＝7，*p＜0.05。图中的g表示葡萄糖，vehicle表示生理盐水。

图5为雌性c57小鼠sgp-13降糖能力检测结果。对照组为g+vehicle，n＝7，*p＜0.05。图中的g表示葡萄糖，vehicle表示生理盐水。

图6为sgp-13在体内有效作用时间检测结果。对照组为g+vehicle，n＝7，*p＜0.05。图中的g表示葡萄糖，vehicle表示生理盐水。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、胰高血糖素样肽-1类似物的设计与制备

gip的功能研究显示gip(1-42)的功能与gip(1-30)功能相同，而gip(1-30)与glp-1(7-36)相同的氨基酸达到80％，因此本发明的后续氨基酸突变设计时就综合考虑gip(1-30)与glp-1(7-36)序列，保留两者共同的序列，将glp-1(7-36)上与gip(1-30)不同的序列用gip(1-30)上的氨基酸进行不同组合的替换。

glp-1(7-36)：haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr

gip(1-30)：yaegtfisdysiamdkihqqdfvnwllaqk

本发明所设计的glp-1类似物，其氨基酸序列如通式1所示。

通式1：

xaa1-ser-glu-gly-thr-phe-xaa7-ser-asp-xaa10-ser-xaa12-xaa13-xaa14-xaa15-xaa16-xaa17-xaa18-xaa19-xaa20-xaa21-phe-xaa23-xaa24-trp-leu-xaa27-xaa28-xaa29-xaa30

其中，xaa1是his或tyr；xaa7是thr或ile；xaa10是val或tyr；xaa12是ser或ile；xaa13是tyr或ala；xaa14是met或leu；xaa15是asp或glu；xaa16是gly或lys；xaa17是gln或ile；xaa18是ala或his；xaa19是ala或gln；xaa20是lys或gln；xaa21是glu或asp；xaa23是ile或val；xaa24是ala或asn；xaa27是val或leu；xaa28是lys或ala；xaa29是gly或gln；xaa30是arg或lys。

最终所得部分glp-1类似物的氨基酸序列及对应的编码基因序列见表1。

按照通式1的序列设计好glp-1类似物的氨基酸序列，并且用gip多肽上氨基酸对应的碱基序列进行后期的碱基的设计。为了便于后期的浓缩、纯化，在glp-1类似物编码基因的5’端顺次连上肠激酶酶切位点识别序列(序列61)和strep-ii标签的编码序列(序列62)，并在在glp-1类似物编码基因的3’端连上终止子序列(tgatga)，这样便于后续的酶切纯化，而且酶切纯化后的多肽不带任何标签，并将这段碱基序列合成并克隆至pgapzαa载体的酶切位点ecori和xbai之间，并测序验证正确(图1)。

表1glp-1类似物序列表

实施例2、glp-1类似物酵母转化、表达筛选及纯化

将20μl实施例1构建的系列重组质粒全部加入100μlgs115酵母感受态中，轻轻吹吸两下使重组质粒与感受态混合均匀，置于冰上，将混合物加入预冷的电击杯中，进行电击，电击后立即加入1ml预冷的1m山梨醇；将转化菌液转入1.5ml离心管，放入29℃培养箱中静止3h；分别涂布于zeocin浓度为0.5、1、2mg/ml的ypds平板上，置于29℃培养箱中培养，用pcr方法鉴定重组成功。

分别挑取不同zeocin浓度平板上的单克隆接种于100mlbmgy液体培养基，29℃，220rpm连续培养三天，13000rpm离心40min，收集上清液。收集的上清液调ph为8.0；用0.45μm膜过滤，即样品液。

用5倍柱体积bindingbuffer平衡strep-tagⅱ纯化柱；将大约100ml样品液上样到纯化柱；用bindingbuffer持续冲洗至uv不变；用5倍柱体积的digestionbuffer冲洗纯化柱；将0.05ml肠激酶(ek酶)上样到纯化柱，4℃静置消化16h；用desaltingbuffer冲洗纯化柱，收集冲洗液即目的蛋白，将目的蛋白溶液用desaltingbuffer脱盐，最后保存在pbs溶液中。

取30μl目的蛋白液，加入10μl4×loadingbuffer；沸水煮样5min；跑小分子胶，结果见图2。检测后的目的蛋白冻干，精确称量1μg用于后续实验。

实施例3、glp-1类似物功能验证

glp-1具有广泛的生理作用，其中最方便快捷的检测指标便是体内降低血糖的能力。因此本实验以6周龄的雄性c57小鼠为实验对象，每个实验组12只小鼠。所有小鼠按2g/kg体重注射葡萄糖溶液。实验组小鼠注射葡萄糖的同时注射glp-1类似物(sgp-1、sgp-5、sgp-13、sgp-19或sgp-23，浓度均为2mmol/l)；对照组注射0.1ml生理盐水，阳性对照组注射exendin-4(ex)、glp-1、gip(浓度均为2mmol/l)，按10nmol/kg小鼠体重注射glp-1类似物及对照注射物分别于注射后0、20和40min检测各组小鼠的血糖水平。每组小鼠12只，结果取均值。

实验结果显示：sgp-13同exendin-4(ex)、glp-1一样能显著降低血糖(图3)。说明sgp-13在雄性小鼠体内具有降低血糖的能力。

实施例4、sgp-13功能验证

有些药物会出现不同性别动物药效有区别的情况，为了判断sgp-13是否存在性别药效差异，因此在再次重复原有的雄性小鼠上的降糖实验时增加了雌性小鼠上的相关验证实验，而且还增加了减少剂量后的sgp-13降糖效果验证实验。所有小鼠按2g/kg体重注射葡萄糖溶液。实验组小鼠注射葡萄糖的同时注射glp-1类似物sgp-13(2mmol/l)，按5nmol/kg及10nmol/kg小鼠体重注射glp-1类似物及对照注射物；对照组注射0.1ml生理盐水，阳性对照组注射glp-1(2mmol/l)，按照10nmol/kg小鼠体重注射。分别于注射后0、20、40和60min检测各组小鼠的血糖水平。每组小鼠7只，结果取均值。6周龄雄性小鼠上的结果如图4所示。6周龄雌性c57小鼠的结果如图5所示(n＝7)。

图4和图5所示结果显示：sgp-13在雌性、雄性小鼠上都具有降低血糖的能力，且sgp-13按照10nmol/kg小鼠体重注射时效果显著优于glp-1，sgp-13仅使用一半剂量(按5nmol/kg小鼠体重注射sgp-13)时同样具有与glp-1相同的降糖作用。

实施例5、sgp-13在体内有效作用时间验证

由于sgp-13在降低血糖效果上不存在性别差异，因此用6周龄的雌性小鼠来验证体内有效作用时间。在0min时按10nmol/kg小鼠体重注射sgp-13、glp-1，对照组注射生理盐水，同时在0min，30min，60min，90min时按2g/kg体重注射葡萄糖，在0min，30min，60min，90min，120min时检测血糖值，每组小鼠7只，结果取均值。结果见图6。

从图6结果可以看出，sgp-13在注射后的30min，60min均能有效减低小鼠的血糖值，而对照组glp-1仅在30min时有效减低了血糖值。结果说明sgp-13在体内降低血糖的作用时间较glp-1长。

<110>中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120>胰高血糖素样肽-1类似物及其用途

<130>gncln171250

<160>62

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>2

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuleualaglylys

202530

<210>3

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

tyrsergluglythrpheileserasptyrserilealaleuglulys

151015

ilehisglnglnaspphevalasntrpleuleualaglyarg

202530

<210>4

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

hissergluglythrphethrserasptyrseriletyrleuglugly

151015

glnhisalaglnaspphevalasntrpleuleualaglnlys

202530

<210>5

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuleualaglyarg

202530

<210>6

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuleualaglylys

202530

<210>7

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetaspgly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>8

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>9

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglyarg

202530

<210>10

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>11

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>12

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>13

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>14

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

tyrsergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetaspgly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>15

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetglugly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>16

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglulys

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>17

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>17

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>18

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>18

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>19

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>19

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetasplys

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>20

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>20

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetasplys

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>21

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>21

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetaspgly

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>22

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>22

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>23

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>23

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuleualaglyarg

202530

<210>24

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>24

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetasplys

151015

ilevalalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>25

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>25

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetasplys

151015

ilehisalaglnaspphevalasntrpleuvalalaglyarg

202530

<210>26

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>26

hissergluglythrphethrseraspvalseriletyrmetasplys

151015

ilevalalalysaspphevalasntrpleuvalalaglylys

202530

<210>27

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>27

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleulysalaglylys

202530

<210>28

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>28

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilealaalaglnaspphevalasntrpleulysalaglylys

202530

<210>29

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>29

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetaspgly

151015

ilealaalalysaspphevalasntrpleulysalaglylys

202530

<210>30

<211>30

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>30

hissergluglythrphethrseraspvalsersertyrmetglugly

151015

ilehisalalysaspphevalasntrpleulysalaglyarg

202530

<210>31

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>31

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcatcgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>32

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>32

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcatcgctgccaag60

gacttcgtgaactggctgctggccggcaag90

<210>33

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>33

tacagtgaagggaccttcatcagtgattacagtattgccttggaaaagattcaccaacaa60

gacttcgtgaactggctgctggccggccga90

<210>34

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>34

catagtgaagggaccttcaccagtgattacagtatttatttggaaggccaacacgcccaa60

gacttcgtgaactggctgctggcccaaaag90

<210>35

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>35

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctgctggccggccga90

<210>36

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>36

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctgctggccggcaag90

<210>37

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>37

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>38

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>38

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>39

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>39

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggccga90

<210>40

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>40

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>41

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>41

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>42

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>42

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>43

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>43

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>44

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>44

tacagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>45

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>45

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggaaggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>46

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>46

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaaagattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>47

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>47

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>48

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>48

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>49

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>49

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacaagattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>50

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>50

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacaagattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>51

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>51

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacggcattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>52

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>52

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>53

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>53

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctgctggccggccga90

<210>54

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>54

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacaagattgtcgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>55

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>55

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacaagattcacgcccaa60

gacttcgtgaactggctggtggccggccga90

<210>56

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>56

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagtatttatatggacaagattgtcgccaag60

gacttcgtgaactggctggtggccggcaag90

<210>57

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>57

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctgaaggccggcaag90

<210>58

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>58

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcattgctgcccaa60

gacttcgtgaactggctgaaggccggcaag90

<210>59

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>59

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggacggcattgctgccaag60

gacttcgtgaactggctgaaggccggcaag90

<210>60

<211>90

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>60

catagtgaagggaccttcaccagtgatgtaagttcttatatggaaggcattcacgccaag60

gacttcgtgaactggctgaaggccggccga90

<210>61

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>61

gacgacgacgacaag15

<210>62

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>62

tggagtcatccgcagttcgagaag24