猪GM‑CSF蛋白的制备方法及其注射液和应用与流程

本发明涉及一种猪gm-csf蛋白的制备方法和应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

细胞因子(cytokine，ck)是免疫原、丝裂原或其他刺激剂诱导多种细胞产生的低分子量可溶性蛋白质或多肽，通过与细胞表面的受体相互作用，从而具有调节固有免疫、适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种生物学功能。细胞因子分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等。细胞因子在体内通过旁分泌、自分泌或内分泌等方式发挥作用，具有多效性、重叠性、拮抗性、协同性等多种生理特性。细胞因子不仅具有广泛的对疾病的治疗作用，还具有明显的免疫佐剂效应，可增强病毒疫苗、细菌疫苗和寄生虫疫苗的保护效应，特别是亚单位疫苗在增强刺激细胞免疫方面的作用。

在进行造血细胞的体外研究中，发现一些细胞因子可刺激不同的造血干细胞在半固体培养基中形成细胞集落，这类因子被命名为集落刺激因子(colonystimulatingfactor，csf)。根据集落刺激因子的作用范围，分别命名为粒细胞csf(g-csf)，巨噬细胞csf(m-csf)，粒细胞和巨噬细胞csf(gm-csf)，多能集落刺激因子(multi-csf,又称il-3)，干细胞因子(scf)和红细胞生成素(epo)。它们对不同发育阶段的造血干细胞起促增殖、分化的作用，是血细胞发生必不可少的刺激因子。

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)是由t细胞、b细胞、巨噬细胞、内皮细胞等在某些抗原和细胞因子作用下刺激产生的具有多种生物学活性的一类集落刺激因子。gm-csf不仅能刺激造血细胞增殖、分化和成熟，并从骨髓向外周血转移，还能活化中性粒细胞、巨噬细胞及其他单核细胞。因此，gm-csf在疾病治疗中有非常广泛的作用，目前在人医中已经广泛使用，但在猪用的药品中，还没有gm-csf的产品，这是因为目前将人用的gm-csf制备工艺放在猪用gm-csf上面，整体复杂，成本高，不利于在兽用产品中推广和应用。另外，gm-csf能通过促进包括树突状细胞在内的抗原递呈细胞的增殖分化，将其吸引到注射部位，增强抗原递呈能力，从而达到增强免疫效果的作用。因此gm-csf还可以作为免疫佐剂或免疫增强剂，特别是在亚单位疫苗(因为亚单位疫苗在刺激细胞免疫方面的能力较弱)中，具有很广阔的发展前景。

目前在猪gm-csf的制备方面还没有报道，本实验室尝试了在真核表达系统中(包括昆虫杆状病毒、cho细胞)和原核表达系统中单独表达gm-csf，发现这2个真核系统中表达的gm-csf产量很低，且蛋白很杂，考虑原因一是因为gm-csf蛋白小，约17kda，易降解，二是糖基化比较杂乱，导致分子量差异很大。而原核表达系统单独表达gm-csf也存在产量低或检测无表达，究其原因一是因为gm-csf蛋白小，可能容易降解，二是因为gm-csf蛋白在大肠杆菌中表达时折叠错误，或形成包涵体，导致检测时没有发现表达。

在蛋白类药物中，单独直接使用未经修饰的蛋白作为药物，在药代学上来看，药物的半衰期都很短，一般就几个小时。因此，为了延长药物的半衰期，一般都选择对目的蛋白进行修饰。但是，修饰都会极大的增加成本，不利于药物的推广，特别是在猪用药物中的推广。因此，研发一种可以适当延长半衰期且成本低的注射液是非常必要的，特别是在该药物的推广使用过程中。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题一是提供一种成本低、易于推广应用的猪gm-csf蛋白的制备方法；二是克服常规技术中单独表达猪gm-csf蛋白时由于分子量小而造成的产量低和易降解的问题；三是提供了一种可延长半衰期且成本低的注射液及其制备方法。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的制备方法，所述方法包括以下步骤：1)将密码子优化后的猪gm-csf基因序列克隆到原核表达质粒中，得到重组质粒；所述原核表达质粒为可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因序列的质粒，所述克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加一种蛋白酶的酶切位点的基因序列；2)将步骤1)中所述重组质粒转化大肠杆菌，得到阳性克隆；3)将步骤2)中所述阳性克隆进行发酵，诱导表达含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪gm-csf重组融合蛋白，得到含有伴侣蛋白及相应酶切位点的猪gm-csf重组融合蛋白；4)纯化步骤3)中猪gm-csf重组融合蛋白；5)使用能够切开所述猪gm-csf重组融合蛋白中酶切位点的蛋白酶对纯化后的所述猪gm-csf重组融合蛋白进行酶切，得到酶切液；以及6)从步骤5)中的酶切液中纯化得到猪gm-csf蛋白。

本发明的技术方案中，优选地，所述的密码子优化后的猪gm-csf基因序列如seqidno.1所示。

本发明的技术方案中，所述的可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因的质粒为pcold-tf质粒或pcoldpros2质粒，优选地，所述的可低温诱导表达目的蛋白且含有伴侣蛋白基因的质粒为pcold-tf质粒，所述的伴侣蛋白为tf蛋白。

本发明的技术方案中，克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加的一种蛋白酶的酶切位点的基因序列为tev蛋白酶的酶切位点的基因序列、hrv3c蛋白酶的酶切位点的基因序列、thrombin蛋白酶的酶切位点的基因序列，优选地，克隆时在伴侣蛋白基因序列后面添加的一种酶的酶切位点的基因序列为tev蛋白酶的酶切位点的基因序列，所述的tev蛋白酶的酶切位点的基因序列如seqidno.3所示。

本发明的技术方案中，优选地，所述猪gm-csf蛋白为蛋白质(a)或蛋白质(b)：蛋白质(a)由seqidno.4所示的氨基酸组成的蛋白质；蛋白质(b)在蛋白质(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有猪gm-csf蛋白抗原性的由蛋白质(a)衍生的蛋白质。

本发明的技术方案中，优选地，所述的转化的大肠杆菌为e.colibl21(de3)。

本发明的技术方案中，优选地，所述的步骤3)中阳性克隆进行发酵时的培养基配制如下：4-1)发酵培养基组分1：ye：10g/l；胰蛋白胨：20g/l；kh2po4:1.14g/l；k2hpo4:0.9g/l；(nh4)2so4:3.0g/l；mgso4·7h2o：0.3g/l，调节ph至6.8，定容至2.4l，与发酵罐体一起灭菌121℃，20min；4-2)发酵培养基组分2：甘油：终浓度30g/l，定容至0.45l，单独灭菌121℃，20min；4-3)发酵培养基组分3：vb1：6mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌；4-4)补料培养基组分1：ye：7.5g；胰蛋白胨：15g，定容至300ml，灭菌121℃，20min；4-5)补料培养基组分2：甘油：45g，定容至150ml，灭菌121℃，20min。

本发明的技术方案中，优选地，所述的发酵包括以下步骤：5-1)设置参数：agit：400rpm；tempreture：37℃；ph：7.0；air：100％；gasflow：4.0；5-2)从补料口加入150μl消泡剂母液，加入发酵培养基组分2、1ml发酵培养基组分3、工作液浓度为50μg/ml的卡那霉素；5-3)溶氧电极标定：将do电极与电极缆线断开连接，点开calib界面，选中do，在setzero对应的下框中输入0.0，待currentvalue读数稳定后点击setzero；连接上电缆线，在setspan对应的下框中输入100，待currentvalue读数稳定后点击setspan；5-4)对照取样：待读数稳定后用取样瓶取出30ml培养基作为测od600的对照及稀释液，置于4℃冰箱保存；5-5)接种：取150ml摇瓶培养的菌液，从补料口加入到发酵罐体中；5-6)关联：约2h后，测量发酵罐内菌液od600值，等od值降到40，关联do与agit，gasflow；5-7)每隔2h，取样测od600值，需稀释读值范围至0.2-0.8；5-8)降温：od600值为10.45时，调节温度设置至20℃；5-9)诱导：约20min后，od600值约为11.45时，开始iptg诱导，诱导前取20ml菌液作为诱导前对照样品，取完样后加入iptg使终浓度为0.3mm；5-10)补料：od600接近15.5时，开始补料，从补料口中加入预先混合好的补料培养基组分1和补料培养基组分2；5-11)收菌：培养至od600值约为19.1时，收菌，将收集的菌液8,000rpm，4℃离心15min后，弃上清。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种猪gm-csf注射液，所述注射液含本发明制备的猪gm-csf蛋白和一种水溶性佐剂，所述的注射液中猪gm-csf蛋白的浓度为40μg/ml。

本发明的技术方案中，所述的水溶性佐剂可以为铝胶佐剂、montanidegel01pr佐剂，优选地，所述的水溶性佐剂为montanidegel01pr佐剂。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种制备猪gm-csf注射液的方法，该方法是将本发明制备的猪gm-csf蛋白与montanidegel01pr佐剂按照体积比为10:1的比例混合。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种猪gm-csf蛋白在猪病的治疗和保健中的应用。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种猪gm-csf蛋白作为免疫增强剂在猪疫苗中的应用。

本发明一方面提供的制备猪gm-csf蛋白的方法，该方法在制备猪gm-csf蛋白时除具有产量高(猪gm-csf蛋白产量能达到320mg/l)、易于纯化(表达出来的tf-tev-gm-csf融合蛋白为可溶性表达，比包涵体表达的蛋白在纯化时省去了很多步骤，且在tev酶消化后的纯化非常简单、易放大)、成本低(大肠杆菌发酵远比细胞发酵成本低廉，且tev蛋白酶也可以自己制备，能进一步节约成本)、适合大规模生产等优点，还克服了常规技术中单独表达猪gm-csf蛋白时由于分子量小而造成的产量低和易降解的问题(一开始通过低温诱导表达tf-tev-gm-csf融合蛋白，一方面该融合蛋白中含有伴侣蛋白tf，tf蛋白能够帮助目的蛋白正确折叠，不容易形成包涵体，另一方面，是在低温诱导下表达该融合蛋白，低温诱导有利于目的蛋白的进一步正确折叠，且不容易形成包涵体，因此表达出来的融合蛋白为可溶性表达，易纯化，且产量很高)。

本发明的另一方面提供了一种治疗猪疾病用的猪gm-csf注射液及其制备方法，该注射液在治疗病猪时有非常好的疗效，该注射液不仅克服了单独使用未经修饰猪gm-csf蛋白作为药物时半衰期短的问题，还克服了对猪gm-csf蛋白进行修饰时成本高的问题，在一个实施例中，注射液实验组比对照组(常规化药治疗)的平均日增重要高0.1kg/天，且注射液实验组比另一个实验组(猪gm-csf蛋白未配制成注射液进行治疗)的平均日增重要高0.04kg/天(这是因为配制成注射液后，可以延长猪gm-csf蛋白在猪体内的半衰期且有一定的缓释左右)；且在观察的30天内2组实验组都没有死亡(对照组死亡2头)。

本发明的另一方面还提供了一种将猪gm-csf蛋白作为免疫增强剂的实施例，从实施例中可以看出，猪gm-csf作为免疫增强剂在疫苗免疫后能够增强疫苗产生抗体的速度和高度，特别是在疫苗一免后到二免前这段时间。

附图说明

图1表示pcold-tf-tev-opti-gm-csf质粒模式图。

图2表示pcold-tf-tev-opti-gm-csf质粒双酶切鉴定结果：其中1和2是pcold-tf-tev-opti-gm-csf质粒sphi&sali酶切结果，电泳条带大小分别为4,772bp和1,383bp；m：dl10,000dnamarker。

图3表示sds-page检测tf-tev-gm-csf融合蛋白小量诱导表达结果：m：lowermarker；1是诱导前上清；2是诱导前沉淀；3是诱导后上清；4是诱导后沉淀。

图4表示sds-page检测tf-tev-gm-csf融合蛋白纯化结果：其中1为纯化后的tf-tev-gm-csf蛋白。

图5表示sds-page检测tev蛋白酶对tf-tev-gm-csf融合蛋白酶切结果。

图6表示sds-page检测tf-tev-gm-csf融合蛋白酶切后纯化结果。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。

本发明试剂及药品的来源列单如下：

pcold-tf质粒购自武汉淼灵生物科技有限公司；

消泡剂母液购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；

montanidegel01pr佐剂购自法国赛彼克公司；

tev蛋白酶购自南京金斯瑞生物科技有限公司。

实施例1：猪gm-csf重组蛋白密码子优化

通过对猪gm-csf蛋白(nm_214118.2)核苷酸序列进行密码子优化，得到opti-gm-csf序列，如seqidno.1所示，该工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

将seqidno.1与seqidno.2的序列进行比对，发现密码子优化后的猪gm-csf蛋白核苷酸序列与未经密码子优化的猪gm-csf蛋白核苷酸序列有55.8％的差异，即387个核苷酸中有216个核苷酸不同。

实施例2：pcold-tf-tev-opti-gm-csf的克隆

2.1pcr扩增目的片段opti-gm-csf

2.1.1pcr反应

(1)引物设计及合成

上游引物:5’-gagggtaccgagaatttatacttccaaggtgcgccgacccgtccgccg-3’

下游引物:5’-gacaagctttatttcttaaccggaccccagc-3’

其中标有下划线的为tev酶切位点的核苷酸序列。

(2)加样体系50μl，如下表所示：

pcr扩增程序：

2.1.2pcr产物进行胶回收

(1)标记好样品收集ep管、吸附柱以及收集管；

(2)称取标记好的空的ep管重量，并记录数值；

(3)将单一的目的dna条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5ml离心管中；

(4)向步骤(3)中的1.5ml离心管中加入600μlpcbuffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；

(5)柱平衡：向吸附柱cb2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μl平衡液bl，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；

(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱cb2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱cb2放入收集管中；

(7)向吸附柱中加入600μl漂洗液pwbuffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cb2放入收集管中；

(8)重复步骤(7)；

(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；

(10)将吸附柱cb2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlelutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；

(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱cb2，盖上离心管盖子，保留离心管中的dna样品；

(12)将步骤11中的dna样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收dna片段。

2.2pcr产物及载体双酶切反应

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，在1.5mlep管中按照下表进行加样、混匀：50μl反应体系

(2)将步骤(1)中的1.5mlep管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。

双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的dna片段，方法同1.2.1中pcr产物胶回收。

2.3连接反应

(1)准备洁净的1.5mlep管若干，做好标记，置于ep管架上待用。

(2)在1.5mlep管按照下表进行加样、混匀。

(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；

(4)取出步骤(3)中ep管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；

(5)取出步骤(4)中的ep管，置于4℃保存。

1.2.4转化反应

(1)将10μl连接反应液快速加入100μl感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；

(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；

(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；

(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μl上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。

(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；

(6)观察转化结果。

2.5质粒抽提与双酶切鉴定

2.5.1质粒抽提

(1)用10μl移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的lb液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；

(2)将菌液移至1.5mlep管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；

(3)向步骤(2)的ep管中加入250μl质粒提取试剂p1buffer，彻底悬浮菌体；

(4)向步骤(3)溶液中加入250μlp2buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；

(5)向步骤(4)溶液中加入350μlp3buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；

(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；

(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(8)向吸附柱中心加入500μlbufferdw1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；

(9)向吸附柱中心加入500μlwashsolution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；

(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。

(11)将吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入30μlelutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中dna溶液。

2.5.2双酶切鉴定

(1)标记好需要用到的1.5mlep管，按照下表进行加样：20μl反应体系

(2)将步骤(1)中的ep管20μl反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。

(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；实验结果见图1和2所示：1,2是pcold-tf-tev-opti-pgm-csf质粒sphi&sali酶切结果，电泳条带大小分别为4,772bp和1,383bp；m：dl10,000dnamarker。因此，插入片段大小正确，构建成功。

(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。

实施例3：tf-tev-gm-csf小量诱导表达

3.1质粒转化

1)准备一个冰盒，以盛放冰水混合物；

2)从-80℃取出实验所需要的bl21感受态细胞(e.colibl21(de3))并将其置于冰上解冻；

3)取质粒1μl加入到100μl感受态细胞中，用枪头轻轻混匀后，放置于水混合物上，冰浴30min；

4)42℃水浴锅热激90s后，立即放在冰水混合物上冰浴2min；

5)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μl液体lb培养基，然后置于恒温水浴锅中，37℃培养1h；

6)取出步骤5)中样品管，取200μl上清液重悬细胞，然后涂布到相应的转化平板中；

7)将平板倒置放入37℃恒温箱中培养12h(过夜培养)。

3.2培养及诱导表达

1)取对应转化平板，接种转化子(单克隆)到含有100μg/mlamp的3mllb培养液中，37℃振荡培养2.5h；

2)从1)中按照1:50的接种量接种至含有100μg/mlamp的15mllb培养液中，震荡培养至od600＝0.5～0.6之间时，立即将培养液移至15℃震荡培养30分钟；

3)取出5ml菌液，4,500rpm离心10min，收集菌体作为诱导前对照样品，冻存于-20℃冰箱；

4)向余下的菌液中加入iptg母液，使其终浓度为0.5mm，15℃培养24h后，取样品用lb培养基调整至od与诱导前相同，同样取5ml菌液，4,500rpm离心10min，收集菌体冻存于-20℃冰箱；

3.3sds-page检测表达结果

取诱导前后样品，加入pbs重悬后，超声破碎后分离上清与沉淀，并将沉淀用pbs重悬，各取80μl用于sds-page分析，结果如图3所示。由sds-page图可以看出目的蛋白为可溶性表达。

实施例4：菌体发酵

4.1溶液配置

1)发酵培养基组分1：ye：10g/l；胰蛋白胨：20g/l；kh2po4:1.14g/l；k2hpo4:0.9g/l；(nh4)2so4:3.0g/l；mgso4·7h2o：0.3g/l，调节ph至6.8，定容至2.4l，与发酵罐体一起灭菌121℃，20min。

2)发酵培养基组分2：甘油：终浓度30g/l，定容至0.45l，单独灭菌121℃，20min。

3)发酵培养基组分3：vb1：6mg/ml，0.22μm滤膜过滤除菌。

4)补料培养基组分1：ye：7.5g；胰蛋白胨：15g，定容至300ml，灭菌121℃，20min。

5)补料培养基组分2：甘油：45g，定容至150ml，灭菌121℃，20min。

备注：补料时，补料培养基组分1和2混合补料。

6)10％h2so4，氨水(无需灭菌)。

4.2发酵过程

1)设置参数：agit：400rpm；tempreture：37℃；ph：7.0；air：100％；gasflow：4.0。

2)从补料口加入150μl消泡剂母液(1000×appro)，加入发酵培养基组分2、1ml发酵培养基组分3、卡那霉素(工作液浓度为50μg/ml)。

3)溶氧电极标定：将do电极与电极缆线断开连接，点开calib界面，选中do，在setzero对应的下框中输入0.0，待currentvalue读数稳定后点击setzero；连接上电缆线，在setspan对应的下框中输入100，待currentvalue读数稳定后点击setspan。

4)对照取样：待读数稳定后用取样瓶取出30ml培养基作为测od600的对照及稀释液，置于4℃冰箱保存

5)接种：取150ml摇瓶培养的菌液，从补料口加入到发酵罐体中。

5)填写发酵记录表格，记录此时的发酵参数。

6)关联：约2h后，测量发酵罐内菌液od600值，等od值降到40，关联do与agit，gasflow。

7)每隔两小时，取样测od600值，需稀释读值范围至0.2-0.8。

8)降温：od600值为10.45时，调节温度设置至20℃。

9)诱导：约20min后，od600值约为11.45时，开始iptg诱导，诱导前取20ml菌液作为诱导前对照样品，取完样后加入iptg使终浓度为0.3mm。

10)补料：od600接近15.5时，开始补料，从补料口中加入预先混合好的补料培养基组分1和补料培养基组分2。

11)收菌：培养至od600值约为19.1时，收菌，将收集的菌液8,000rpm，4℃离心15min后，弃上清，共收得菌体84.7g。

实施例5：蛋白纯化

5.1溶液配置

1)裂解液：50mmnah2po4(ph8.0)，500mmnacl，0.05％tween-20，0.2％tritonx-114，0.0075％(1mm)β-巯基乙醇。

2)washingbuffer1：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，0.05％tween-20，0.2％tritonx-114(除内毒素)，0.0075％(1mm)β-巯基乙醇；

3)washingbuffer2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，0.05％tween-20，0.0075％(1mm)β-巯基乙醇；

4)洗脱缓冲液组分(咪唑母液)：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，0.05％吐温-20，500mm咪唑，0.0075％(1mm)β-巯基乙醇；

5)透析液1：50mmnah2po4(ph8.0)，500mmnacl，0.05％tween-20，

6)透析液2：50mmnah2po4(ph7.4)，500mmnacl，0.05％tween-20。

5.2纯化步骤(镍柱纯化)

1)菌体破碎：向20g菌中加入裂解液350ml，用50ml注射器吹打均匀至无颗粒状；均质仪破碎：压力：800-1,000bar循环次数：4次；

2)将步骤1)破碎完全的样品分装到500mlbeckman离心管中，12,000rpm，4℃离心30min，上清和沉淀重悬均预留80μl样品用于sds-page检测；

3)柱平衡：取适量qiagenni-nta填料，用超纯水平衡2～3柱体积(cv)，排出20％的乙醇保存液；然后用裂解液平衡2～3柱体积(cv)；

4)上样：将填料与菌体破碎后上清倒入蓝盖瓶，在滚瓶机中混匀1h，滚瓶机转速约30～40rpm，混合均匀后转移至柱子中，并将柱子固定，流穿并收集流穿液。混合后取80μl用于sds-page分析；

5)冲洗1：用50倍柱体积(cv)的清洗缓冲液组分1(washingbuffer1)洗柱(用于去除内毒素)；

6)冲洗2：用25倍柱体积(cv)的洗脱缓冲液组分1(elutionbuffer1)(不含tritonx-114)洗柱，减少tritonx-114的残留；

7)洗脱：用20mm洗脱杂蛋白，250mm洗脱目的蛋白咪唑洗脱目的蛋白，收集流出液，每个咪唑浓度直至考马斯亮蓝检测蓝色不再变浅为止，混合后取80μl用于sds-page分析；结果如图4所示：其中1为纯化后的tf-tev-gm-csf蛋白。

53浓缩及透析换液

取250mm咪唑洗脱下的目的蛋白进行浓缩，浓缩后用透析液1换液除去咪唑(换液≥1000倍)。

5.4浓度及内毒素检测

透析换液后测定蛋白浓度,得到目的蛋白约1g且内毒素含量检测合格(＜1eu/5ug)。

每升发酵液得到菌体28.2g，因此计算得蛋白产量约为1.4g/l。

5.5tev蛋白酶切除tf及纯化

1)酶切：取5.3得到的已知浓度的蛋白溶液，加入5％(质量分数)的tev蛋白酶(购自南京金斯瑞生物科技有限公司，也可以自己制备，本发明人2种方法都验证过，效果一致)，1％tritonx-100，5mmβ-巯基乙醇；30℃水浴锅酶切3h，取80μl用于sds-page分析，结果如图5所示。从图中可以看出，tev蛋白酶能够切开tf蛋白，从而可以进一步纯化得到gm-csf蛋白。

2)纯化：取适量thermoprobond^tmresin填料与酶切后蛋白溶液倒入无内毒素蓝口瓶，在滚瓶机中混匀1h，滚瓶机转速约30～40rpm，混合均匀后转移至柱子中，并将柱子固定，流穿并收集流穿液，取80μl用于sds-page分析；结果如图6所示：纯化后的gm-csf蛋白在sds-page上纯度能达到90％以上。

5.6浓缩及透析换液

取5.5的流穿及20mm咪唑洗脱下的目的蛋白进行浓缩，浓缩后用透析液2换液(换液≥1000倍)。

5.7浓度及内毒素检测

透析换液后测定蛋白浓度，约得到蛋白230mg，酶切后得率约为90％，且内毒素检测含量检测合格(＜1eu/5ug)，每升发酵液得到菌体28.2g，因此计算得蛋白产量约320mg/l。

实施例6：病猪治疗实验

6.1注射液配制(制备1ml/头，共220ml为例说明)

所用制备用耗材和材料都需预先经过无菌处理，制备过程是在生物安全柜或其他可以保证整个制备过程都无菌的仪器或环境中完成。

1)montanidegel01pr佐剂准备：根据抗原液和佐剂质量比为10:1，称取佐剂质量为20g(约20ml)置于预先准备好的试剂瓶中，封口，待用。

2)根据抗原液和佐剂质量比为10:1，抗原液总质量为200g(约200ml)。根据猪gm-csf蛋白浓度以及注射液中该蛋白的含量，计算猪gm-csf蛋白取用的体积；用pbs或其他缓冲液将抗原液总质量补充至200g(约200ml)，混匀，待用。例如猪gm-csf蛋白浓度为0.5mg/ml，注射液中猪gm-csf蛋白含量为40μg/头份(1ml/头份)。具体配置如下表所示：

3)搅拌：将准备好的抗原液置于预先准备好的烧杯(根据制备量选择大小合适的烧杯，如制备220ml选择500ml的烧杯即可)中，调整好搅拌机的高度和速度，再将准备好的佐剂加到抗原液中，继续搅拌30-40min。一般根据制备体积选择搅拌速度和搅拌时间，如制备220ml疫苗，一般选择500rpm/min搅拌30min即可。

4)分装：稳定好的注射液根据需要分装并写上标签。

6.2保育病猪治疗

1)33日龄左右的病猪，挑选33头，随机均匀分成3组，一组注射1ml猪gm-csf(6.1配制的注射液)，一组注射相同剂量和体积的未配制成注射液的猪gm-csf蛋白，一组作为对照组，进行常规抗生素治疗。注射后连续观察一个月，并跟踪治疗前后的体重、死亡率及精神食欲方面的变化。

2)精神、食欲对比：在跟踪阶段，2组实验组猪只在精神、食欲方面比对照组较好。

3)死亡率对比：在整个跟踪阶段，对照组死亡2头(3-8号、3-10号死亡)，2组实验组全部存活，在死亡率方面，实验组明显优于对照组(实验组为0，对照组为2/10)。

4)日增重对比：在整个跟踪阶段，注射液实验组日增重明显优于对照组日增重(实验组日增重比对照组高0.1kg/天)，且比另一个实验组(猪gm-csf蛋白未配制成注射液进行治疗)的平均日增重要高0.04kg/天。具体信息见下表：

实施例7：作为免疫增强剂的免疫实验

7.1疫苗配制

将适量猪瘟e2蛋白加入到isa201vg佐剂中(体积比为46:54)，使猪瘟e2蛋白终浓度为30μg/ml，超声乳化，记为疫苗1；

将适量猪瘟e2蛋白和猪gm-csf蛋白加入到isa201vg佐剂中(体积比为46:54)，使猪瘟e2蛋白浓度为30μg/ml，猪gm-csf蛋白浓度为20μg/ml，超声乳化，记为疫苗2。

具体猪瘟e2蛋白的制备参考本发明人申请号为201610625392.x的发明专利申请。

7.2免疫实验

筛选3-4周龄仔猪(猪瘟抗原抗体阴性、猪圆环抗原阴性、蓝耳抗原阴性)15头进行试验，将其平均随机分成3组，每组5头，其中2组分别免疫7.1制备的疫苗1和疫苗2(颈部肌肉注射，每次每头注射1ml相应疫苗)，剩余一组作为空白对照组，初免三周后加强免疫一次，免疫前、二免前和免疫后14天采集血清，用idexx抗体检测试剂盒测定抗体效价。抗体效价结果如下表所示：

由表中结果可以看出，疫苗2免疫组阻断率在一免后21天(二免前)明显高于疫苗1免疫组，阻断率平均值约高20％左右。在二免后14天，疫苗2免疫组阻断率比疫苗1免疫组阻断率稍高，约高8％左右。这说明，在免疫后，含有猪gm-csf的疫苗在产生抗体时的速度和高度都要比不含猪gm-csf的疫苗强，即猪gm-csf在疫苗中作为免疫增强剂有很好的增强免疫的作用。

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方法。

序列表

110浙江海隆生物科技有限公司

120猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的制备方法及应用

1604

170patentinversion3.3

2104

211387

212dna

213密码子优化后的猪gm-csf蛋白基因序列

4001

ggtgcgccgacccgtccgccgagcccggtgacccgtccgtggcagcacgttgacgcgatc60

aaagaggcgctgagcctgctgaacaacagcaacgataccgcggcggtgatgaacgaaacc120

gttgacgtggtttgcgagatgttcgatccgcaggaaccgacctgcgtgcaaacccgtctg180

aacctgtacaaacaaggtctgcgtggcagcctgacccgtctgaagagcccgctgaccctg240

ctggcgaaacactatgagcagcactgcccgctgaccgaggaaaccagctgcgaaacccaa300

agcatcaccttcaagagctttaaagacagcctgaacaagttcctgtttaccattccgttt360

gattgctggggtccggttaagaaataa387

2104

211387

212dna

213密码子优化前的猪gm-csf蛋白基因序列

4002

ggtgctcccacccgcccacccagccctgtcacccggccctggcagcatgtggatgccatc60

aaagaagccctgagccttctaaacaacagtaatgacacagcggctgtgatgaatgaaacc120

gtagacgtcgtctgtgaaatgtttgacccccaggagccgacatgcgtgcagactcgcctg180

aacctgtacaagcagggcctgcggggcagcctcactaggctcaagagccccttgactctg240

ttggccaagcactatgagcagcactgccccctcaccgaggaaacttcctgtgaaacccag300

tctatcaccttcaaaagtttcaaagacagtctgaacaaatttctttttaccatccccttt360

gactgctgggggccagtcaaaaagtaa387

2101

21148

212dna

212人工序列

4003

gagaatttatacttccaaggt21

2101

211128

212prt

213猪gm-csf蛋白氨基酸序列

4004

glyalaprothrargproproserprovalthrargprotrpglnhisvalaspalailelysglualaleu

15101520

serleuleuasnasnserasnaspthralaalavalmetasngluthrvalaspvalvalcysglumet

2530354045

pheaspproglngluprothrcysvalglnthrargleuasnleutyrlysglnglyleuargglyser

5055606570

leuthrargleulysserproleuthrleuleualalyshistyrgluglnhiscysproleuthrglu

75808590

gluthrsercysgluthrglnserilethrphelysserphelysaspserleuasnlyspheleuphe

95100105110115

thrilepropheaspcystrpglyprovallyslys

120125