本发明属于分子生物学技术领域，具体提供一种来源于不可培养微生物嗜盐古细菌scgc-aaa259i14的转座酶高活性突变体及其应用。
背景技术：
tn5转座酶是is4家族的复合转座子tn5内部由is50序列编码的转座酶，包含476个氨基酸残基，分子量53kda。转座酶能够识别成对的末端序列（endsequence），经过“剪切和粘贴”的方式，完成转座反应。
转座酶的转座反应包括以下几个步骤：首先，tn5转座酶识别供体dna片段中的末端序列，两个tn5转座酶分子结合，形成活性二聚体；活性二聚体在末端序列的外侧切割双链dna，将末端序列和其间的dna从供体dna上切割下来；之后，活性二聚体同受体dna结合，二聚体切割受体dna，形成9bp的粘性末端；活性二聚体随后催化末端序列同受体dna片段的粘性末端连接，完成转座反应。在体外的反应条件下，完成反应的tn5转座酶依然同受体dna片段紧密结合，需要使用变性剂等失活tn5转座酶才能将其同受体dna片段分离。目前在体内介导这一分离过程的机理还不太清楚。
目前，tn5转座酶已被广泛的应用于分子生物学领域的体外转座、二代测序建库等领域。当使用两端包含me接头序列的目的基因作为底物时，可以使用tn5转座进行体外转座反应，将目的基因序列插入到目标微生物的基因组中，达到对目标微生物基因组改造的效果。当使用分立式的两段me接头序列时，可以使用tn5转座酶完成建库反应，将目标dna打断成一定大小的片段，当me接头同时连接有二代测序用接头序列时，将目标dna片段化的过程即包含了目标dna打断和测序接头连接两个步骤，能够快速的完成二代测序建库。
现有的tn5转座酶，在纯化的过程中，其n末端序列容易被大肠杆菌內源的蛋白酶降解，形成无活性的tn5转座酶片段，这些片段还能在一定程度上抑制全长tn5转座酶的活性。鉴于上述现象，在纯化tn5转座酶的过程中，往往需要全程添加昂贵的蛋白酶抑制剂，这使得转座酶的纯化成本增加，也是目前市售转座酶价格高昂的因素之一。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种具有更高稳定性的转座酶高活性突变体及其应用。本发明通过构建大肠杆菌工程菌，能够高效的重组表达转座酶高活性突变体，该转座酶高活性突变体在纯化过程中能够更好耐受大肠杆菌內源蛋白酶的降解，省去了添加昂贵蛋白酶抑制剂的工序，同现有tn5转座酶高活性突变体相比，显著降低了纯化成本。
本发明提供了一种来源于不可培养微生物嗜盐古细菌scgc-aaa259i14的转座酶高活性突变体，包括：
氨基酸序列为seqidno:1的酶，以及与seqidno:1序列相似性高于90%，且具有转座酶活性的酶。编码所述转座酶高活性突变体的一种核苷酸序列为seqidno:2。
本发明将上述转座酶高活性突变体导入大肠杆菌中，构建了重组表达该转座酶高活性突变体的大肠杆菌工程菌。所述大肠杆菌工程菌能够高效的表达转座酶高活性突变体。
重组表达的转座酶高活性突变体，在纯化的过程中，同tn5转座酶相比，对大肠杆菌的內源蛋白酶降解具有更好的耐受性，能够在不使用多功能蛋白酶抑制剂的情况下，纯化获得全长序列，显著降低了纯化成本。
本发明还涉及上述转座酶高活性突变体在分子生物领域的应用。
附图说明
图1，tn5转座酶纯品，泳道1为蛋白质marker，泳道2为tn5转座酶纯品，其中主条带下方的两条条带为纯化过程中的降解条带。
图2，嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体纯品，泳道1为蛋白质marker，泳道2为嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体纯品，其中主条带下方的一条带为纯化过程中的降解条带。
具体实施方式
实施例1转座酶高活性突变体大肠杆菌工程菌的构建
在不可培养微生物嗜盐古细菌scgc-aaa259i14的转座酶（genbank:kxa97509.1）基因中引入高活性突变w64k，并参照大肠杆菌的密码子偏好对突变后的基因序列进行密码子优化，所得的序列经金唯智公司合成，并构建至ptyb4表达载体中，得到ptyb4w64k质粒
将ptyb4w64k质粒转化到大肠杆菌er2566表达菌株中，使用lb培养基，37度培养至od600=0.6，加入0.1mmiptg，降低培养温度至23度，继续培养6h，离心收集菌体。
实施例2转座酶高活性突变体的纯化
取25-30g表达转座酶高活性突变体的大肠杆菌菌体，按1:17-20的比例加入缓冲液a（20mmtris-hcl，ph7.5，1mmedta，10%glycerol）500ml，混匀后进行均质破菌（1000bar/2次），破菌后将样品进行离心处理（14000rpm、20min、4℃），离心后保留上清弃掉沉淀。
向离心上清缓慢加入到5mlchitin柱中；待全部破菌上清通过chitin柱之后，使用缓冲液a进行冲洗柱子5-7倍柱体积，确保柱子中一些非特异结合蛋白被冲洗出去，此时转座酶高活性突变体结合于chitin填料上。
称取dtt固体使用20ml缓冲液a溶解（dtt终浓度为50mm），缓慢将上述缓冲液添加到chitin柱中；待3倍柱体积流穿之后，堵上下端出水口；4度放置过夜（约16h），隔日准备好收集管，调整好位置，上端进水口连接好之后，打开下端出水口，开始收集，每管约1.8ml，收集7管，之后电泳检测每管含量；根据电泳结果合并样品。
将合并后的转座酶高活性突变体样品透析，样品透析操作在超净台中进行。使用超净台之前，需按照超净台使用规范对超净台进行擦拭和紫外照射处理。在紫外灭菌结束后，将置于4℃预冷的冰盒上的转座酶高活性突变体样品，1l大烧杯，转子，储液buffer，透析袋等物品放入超净台中。分别将缓冲液b（20mmtris-hclph7.5，50%glycerol，0.5mmedta,1mmdtt）和转子放入1l大烧杯中。使用灭菌枪头吸取样品，加入到一段封闭的透析袋中。此过程尽量在短时间结束。加完所有样品后，封闭透析袋另一端，置入前述大烧杯中。盖上盖子。将磁力搅拌器置于4℃药品保存柜中。将前述大烧杯置于磁力搅拌器上，开动磁力搅拌程序。600rpm，过夜透析。透析后的样品即为转座酶高活性突变体纯品。
实施例3转座酶高活性突变体在分子生物学领域的应用
转座酶高活性突变体在二代测序建库中的应用：
3.1构建转座体（transposome）
3.1.1准备如下反应体系：
3.1.2.将反应物混匀，25°c反应30分钟。
3.1.3.反应后的转座体可立即进行后续反应，也可-20°c保存。
3.2片段化反应（tagmentation）
3.2.1.准备如下的反应体系
3.2.2.37°c反应2h或56°c反应10~15分钟。
3.3上一步骤所的产物经纯化、nicktranslation、pcr富集、纯化等步骤后可上机进行测序。
序列表
<110>天津强微特生物科技有限公司
<120>一种嗜盐古细菌中的转座酶高活性突变体
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>471
<212>prt
<213>转座酶高活性突变体蛋白序列(人工序列)
<400>1
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<213>转座酶高活性突变体基因序列(人工序列)
<400>2
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