本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种突变型taqdna聚合酶及其纯化方法。
背景技术：
taqdna聚合酶是a.chien从一种水生栖热菌(thermusaquaticus)yti株分离提取的。所述yt1株是一种嗜熟真细菌于1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的，适合生长在70-75℃生长，。taqdna聚合酶基因全长2496个碱基，编码832个氨基酸，酶蛋白分子为94kda,80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，70℃延伸率大于60个核苷酸/秒。taqdna聚合酶在95℃酶活性可以持续40分钟，而97.5℃加热5-6分钟可以保持大约50%的酶活。taqdna聚合酶的热稳定性是该酶用于pcr反应的自动连续循环的前提条件，也是pcr反应能在生物技术领域迅速发展和广泛应用的原因。
dna聚合酶作为分子生物学的工具酶，在生物技术和医学临床上的应用十分广泛，具有较高的市场价值。然而随着医药科技的发展，新领域的应用对dna聚合酶的性能不断提高，原有的野生型taqdna聚合酶已经不能满足新的应用要求，如taqdna聚合酶容易被血液、粪便中的化学成分所抑制，导致实验或检测的失败。因此需要对野生型taqdna聚合酶进行改造和筛选，得到新的突变体来适应科研、医学应用和工业生产的需求。
传统的野生型taqdna聚合酶纯化步骤较多，生产过程中所需多步柱上层析，费时长且产率低。1993年francesc.lawyer等人采用肝素柱对taqdna聚合酶进行亲和纯化，肝素柱虽然特异性比较高，但是载量比较低，不利于放大生产。1994年harrell和hart报导的taqdna聚合酶纯化方法中提到了用离子交换的方法，1995年edithgrim报道taqdna聚合酶纯化方法中也包含了离子交换的方法。在此以后的大多数关于taqdna聚合酶纯化方法的文章中也都采用了离子交换的工艺.离子交换的工艺虽然能提高载量，但是由于他本身的非特异性洗脱会导致杂蛋白的含量会增多，如果达到一定的纯度要求还需进行其他步骤的纯化，这会增加工艺的复杂度以及提高成本。鉴于此，开发简便、快速、高效、低成本的工业化可行的taqdna聚合酶纯化方法是十分必要的。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种突变型taqdna聚合酶及其制备方法。和野生型taqdna聚合酶，对样品中不纯的化学成分具有更强的抗抑制作用。
根据上述目的，本发明提供一种突变型taqdna聚合酶，其核苷酸和氨基酸序列为seqidno.1和seqidno.2所示。突变的氨基酸位置根据野生型taqdna聚合酶所定，野生型taqdna聚合酶为seqidno.3所示。
本发明提供了一种蛋白表达载体，该载体包含了可编码此突变型taqdna聚合酶的核苷酸序列；此载体可由大肠杆菌表达载体，如pet15b等表达载体经重组得到。
本发明提供了一种大肠杆菌蛋白表达菌株，该菌株包含上述的一种蛋白表达载体可编码上述突变型taqdna聚合酶的核苷酸序列，如seqidno.1所示的核苷酸序列。
上述表达菌株可以为bl21(de3)等。
本发明还提供了一种上述突变型taqdna聚合酶的制备方法,其包括：
（1）破菌：将含突变型taqdna聚合酶表达菌株用超声或高压均质的方法裂解菌体；
（2）热处理：加热裂解液使不耐热蛋白变性析出；
（3）盐析：40%的硫酸铵盐析浓度可保留突变型taqdna聚合酶在上清而去除大部分杂质蛋白；
（4）ni离子金属螯合亲和层析：特异性吸附和特异性洗脱实现了快速制备大量的突变型taqdna聚合酶；
（5）制剂分装：测量纯化的突变型taqdna聚合酶的酶活并根据活性酶量进行分装。
本发明公开了该突变型taqdna聚合酶在pcr中的应用。
本发明具有以下有益效果：它可以比野生型taqdna聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。本发明提供的突变型taqdna聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。
附图说明
图1为突变型taqdna聚合酶纯化结果。1.野生型taqdna聚合酶，2.突变型taqdna聚合酶。
图2为检测粪便dna中的16srrna基因时突变型taqdna聚合酶和野生型taqdna聚合酶的对比图。1，2野生型taqdna聚合酶（neb）；3，4野生型taqdna聚合酶（强微特）；5,6突变型taqdna聚合酶（强微特）。
图3为检测血液dna中的b-actin基因时突变型taqdna聚合酶和野生型taqdna聚合酶的对比图。图中上曲线：突变型taq,下曲线：野生型taq。
具体实施方式
本发明采用分子生物学技术，将天然taqdna聚合酶的5‘-3’外切酶活性部分去除，并进行多个位点的氨基酸进行突变，经过测序确认突变型后重组到表达载体中，该突变型taqdna聚合酶可以比野生型taqdna聚合酶具有更高的热稳定性，而且对血液或者粪便等生物样品中的不纯物质，具有更强的抗抑制作用。该突变型taqdna聚合酶可满足各种不断提高的科研、临床和工业应用需求。
本发明中，上述突变具体涉及野生型taqdna聚合酶的c端281-氨基酸，并且在天然taqdna聚合酶氨基酸序列中引入e507r,e742a和a743h突变。在本发明的一种实施方式中，其突变型taqdna聚合酶的氨基酸序列如seqidno.2所示，包括了去除具有5‘-3’外切酶活性部分的1-280氨基酸，第507位由谷氨酸突变为精氨酸，第742位由谷氨酸突变为丙氨酸，第743位由丙氨酸变为组氨酸。
本发明中还进一步提供了可编码上述突变型taqdna聚合酶的核苷酸序列，如seqidno.1所示。本领域技术人员可以运用分子生物学的方法，进行克隆或者点突变而得到此突变型taqdna聚合酶。上述seqidno.1所示的核苷酸序列，并不是唯一得到上述突变型taqdna聚合酶的序列。本领域技术人员可以利用密码子的同义突变核苷酸序列，得到具有相同氨基酸序列而不同核苷酸序列的dna片段。
我们为了简化纯化、提高产率，针对含有6个组氨酸标签的突变型taqdna聚合酶，开发了一种简便、高效的纯化方法，纯化的突变型taqdna收率高、生产成本低，有利于工业化生产的特点。
纯化采用以下的技术方案：
破菌：离心获得表达突变型taqdna聚合酶的重组大肠杆菌菌体，以1：10比例加入破菌缓冲液，搅拌20min使之混合均匀，通过高压均质的方法裂解菌体，使之破碎；其中破菌缓冲液为50mmtris-hcl,ph7.5,0.5mmedta,0.5mkci,1％tween,1％np-40，溶菌酶2mg/ml,新鲜pmsf至0.02mm。将菌体和破菌缓冲液的混合液放入高压均质机中，在4℃、工作压力为500bar时均质3遍。
热处理:先将水浴锅加热到70℃，将破菌离心上清液装入一玻璃容器中一并放入预先加热好的水浴锅中。热处理时间是60min,热处理后会有很多不耐热蛋白变性析出。离心力控制在10000g,时间20min,温度4℃。
盐析:硫酸铵盐析浓度为40％左右，导致目的蛋白收率轻微下降，对后续纯化纯度没有影响。具体操作为：事先将硫酸铵盐用研钵研碎，向破菌上清液中一次性加入，搅拌至完全溶解，确保不会出现局部浓度过高，100ml破菌上清液加入36.1～45.1g硫酸铵，沉淀温度控制在10℃以下，沉淀时间为大于2h，10000g离心，离心时间为10～20min，离心温度控制在0～10℃，离心沉淀按金属螯合层析每批处理量分装并冷冻保存。
金属螯合层析：金属螯合层析用缓冲液i平衡色谱柱，上样后冲洗约5～10cv。从缓冲液i到缓冲液ii梯度洗脱目的蛋白,收集uv280大于100mau组分。其中缓冲液i为50mmtris-hci,ph7.5，0.5mnacl，5~10mm咪唑；缓冲液il为50mmtris-hcl,ph7.5,0.5mnacl,300~600mm咪唑。通过优化缓冲液成分和洗脱方法，实现了目的蛋白与杂质最大程度的分离。
质检、制剂及分装金属螫合层析收集样品，加入等体积甘油一20℃暂时保存，bradford法检测蛋白浓度，利用neb公司的dna聚合酶活测定方法检测蛋白活性，计算比活，按照neb公司的dna聚合酶的dna内切酶检测方法对我们的终产品进行检测。
实施sds-page检测突变型taqdna聚合酶蛋白纯度。将野生型taqdna聚合酶和突变型taqdna聚合酶进行sds-page蛋白电泳检测，确认taqdna聚合酶的大小和纯度。
方法：取纯化好的taqdna聚合酶样品，加入5xloadingbuffer10微升，100摄氏度加热5分钟后上样50微克/泳道。电泳后用考马氏亮蓝染色。
sds-page蛋白电泳检测结果:参考图1，野生型和突变型taqdna聚合酶纯度均达95%以上。
比较野生型taqdna聚合酶和突变型taqdna聚合酶的性能，特别是受粪便dna中的pcr抑制剂的影响。
研究粪便中pcr抑制剂对野生型taqdna聚合酶和突变型taqdna聚合酶的影响：在加入同等酶活的同一实验条件下，以人粪便提取的dna为pcr模板，16srrna基因的引物来pcr扩增。具体的，将等活力的不同taqdna聚合酶在相同的dna模板，相同的pcr反应试剂，相同的pcr引物浓度，相同的pcr反应温度变化下，各自进行2次重复检测。
上述人粪便dna提取：新鲜人的粪便由天根公司试剂盒粪便基因组dna提取试剂盒提取，测od值定量并跑胶确认。
16srrna基因pcr结果：如图2所示，两种不同来源的野生型taqdna聚合酶，均无法扩增16srrna基因，而突变型taqdna聚合酶得到清晰的扩增产物。
血液样品pcr直扩：一般的血液pcr工作流程包括dna的纯化，以去除血液中的pcr抑制剂，如血红素分子和常用在血液中的抗凝剂（edta和肝素）。dna提取过程有可能引入样品污染、样品混淆等人工误差，而且浪费时间和资源。本发明所述的突变型taqdna聚合酶可以直接以血液进行pcr扩增，加快流程并减少实验错误。
人b-actin基因实时荧光pcr:以含edta血液样品为模板，模板约占反应体系的20%体积比.如图3所示，图中每一个曲线代表一个pcr反应在不同时间段的荧光值，横坐标代表pcr的循环次数，纵坐标为荧光值，荧光曲线越早出现表示此时pcr反应产物越多。由图3可知，突变型taqdna聚合酶不受血液中的抑制剂影响，而野生型taqdna聚合酶显示明显的抑制。
以上所述仅为本发明的优选实施例而己，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>天津市强微特生物科技有限公司
<120>一种突变型taqdna聚合酶及其纯化方法
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