本发明涉及免疫学
技术领域：
，特别涉及制备一种制备分泌抗ompc的单克隆抗体杂交瘤细胞株，以及基于该杂交瘤细胞株制备的ompc嵌合抗体在炎症性肠病检测中的应用。
背景技术：
：炎症性肠病(inflammatoryboweldisease，ibd)是一种慢性非特异性肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，uc)和克罗恩病(crohn’sdisease，cd)，近10多年来在我国发病率呈逐步增高趋势。ibd的临床表现复杂多样，不仅有消化道症状，还可有肠外表现。由于症状为腹痛、腹泻、便血等非特异性肠炎表现，cd与uc，以及ibd与结核性肠炎等其他肠道慢性疾病很难鉴别诊断。目前鉴别ibd与其他慢性肠道炎症的生物标志物主要集中在自身免疫抗体与抗微生物抗体。大肠杆菌是人体肠道内的正常细菌之一，一般情况下不致病。但在某些特殊情况下，当机体对大肠杆菌的某种蛋白过激反应时，可发生腹痛、腹泻等肠炎症状。研究表明，ibd与机体对大肠杆菌外膜孔道蛋白c(outermembraneproteinc，ompc)的过激反应有关，大约有50％的ibd患者血清抗ompc的iga或igg抗体呈阳性，因此，通过检测血清中抗ompc的iga和igg抗体可以辅助诊断ibd。应用免疫检测技术，如酶联免疫法、化学发光法、免疫层析法等测定样品中抗体的浓度是常用的检测方法。在此类试验中，必须设立阳性对照孔，阳性对照多用临床病人的血清或其他形式的人血清。但人源性血制品，很可能含有致病性传染物质，对操作者存在潜在的威胁，同时在配制阳性对照过程中需要大量血清或血浆，而有些病的血清或血浆又比较难得到。因此应用人源血液作为阳性对照，对于制备大量检测试剂盒产品而言，原料受到客观的限制。所以需寻求一种阳性对照替代品应用于ompc的iga或igg抗体检测试剂盒。技术实现要素：本发明的目的在于，提供一种抗ompc单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。本发明的另一个目的是：提供一种基于ompc单克隆抗体杂交瘤细胞株的工程抗体及其在医学检验领域的用途。本发明提供的ompc单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏于中国典型培养物保藏中心(简称为cctcc)，保藏日期为2016年8月12日，保藏编号为cctccno：c2016161。本发明提供了如下的技术方案：研制ompc单克隆抗体杂交瘤，基于此杂交瘤细胞株制备人源化嵌合抗体，即将ompc的单克隆抗体的轻、重链可变区基因插入到含有人源iga或igg抗体恒定区基因的表达载体中，转入动物细胞中表达得到的ompc的人源化igafc或人源化iggfc的嵌合抗体，这两种ompc人源化igafc或人源化iggfc嵌合抗体可分别作为检测抗ompc的iga或igg抗体的阳性对照物。本发明方案包括如下步骤：(1)ompc抗原蛋白制备；(2)ompc蛋白多次免疫balb/c小鼠，elisa法检测免疫小鼠血清效价；(3)免疫balb/c小鼠脾脏细胞与sp2/0细胞进行融合，(4)有限稀释法获得单克隆，elisa法筛选阳性杂交瘤细胞；(5)杂交瘤的单克隆抗体鉴定：终获得能分泌抗ompc特异性抗体的杂交瘤细胞株，亚型鉴定为igg1，elisa测效价为1∶320000；(6)基于ompc单克隆抗体杂交瘤细胞株，通过工程抗体技术，用人源化igafc或人源化iggfc段替换ompc单克隆抗体的鼠源fc段，制备抗ompc的嵌合抗体；(7)ompc嵌合抗体配制的校准品及其应用。本发明的优点是：(1)本发明所述杂交瘤细胞株染色体稳定，能稳定地分泌抗体。(2)本发明所述杂交瘤细胞株分泌的抗体效价高，培养上清效价达1∶32万。(3)基于本发明所述杂交瘤细胞株制备的嵌合抗体可替代人源血液作为阳性对照，对于制备大量检测试剂盒产品而言，避免了人血液原料来源的客观限制，也更安全。保藏信息用于保藏的杂交瘤细胞株的科学描述为：抗人ompc单克隆抗体杂交瘤细胞株hr00213-5；保藏单位全称：中国典型培养物保藏中心；保藏单位简称：cctcc；保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山路武汉大学；保藏日期：2016年8月12日；保藏编号：cctccno：c2016161。附图说明图1纯化后单抗的电泳图；图2ompc抗体iga荧光定量免疫层析校准曲线。具体实施方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。实施例1：ompc抗原蛋白制备1.试剂与仪器1)试剂大肠杆菌宿主菌dh5α、bl21(de3)，克隆载体pcr2.1t-vector，表达质粒pet28a(+)，dna聚合酶rtaq，t4dna连接酶，dna聚合酶rtaq、lataq以及限制性内切酶bamhi、hindiii和ecori、bamhi，dl2000dnamarker、t4dna连接酶，低分子量标准蛋白，dna胶回收试剂盒，iptg等2)仪器普通摇床scs-24；隔水式恒温电热培养箱；biophotometer分光光度计、台式冷冻离心机centrifuge5810r、台式离心机minispin；高速冷冻离心机；蛋白质电泳仪以及凝胶成像系统；pcr仪；超声裂解仪；恒温金属浴；his蛋白纯化柱等。2实验方法1)载体构建：设计引物catgccatggatgcatcatcatcatcaccat(ncoi)和cgcggatccttagaactggtaaaccaggcc(bamhi)从模板dna中pcr扩增出ompc片段，胶回收试剂盒回收片段后连接到pcr2.1克隆载体进行测序鉴定。将鉴定正确的序列克隆至表达载体pet28a(+)中，酶切位点为ecori、bamhi，同时载体上有6×his标签，便于后续的蛋白纯化。2)表达将得到的质粒转化至大肠杆菌bl21(de3)，通过抗性筛选阳性表达菌株。将筛选出来的阳性菌液按1∶1000的比例接种加有kan抗性的lb培养基中，每个菌接种两管，一管用于诱导，另一管用于非诱导对照，同时要接种一管空质粒菌作对照。37℃过夜培养至od600值约为0.4-0.6时，诱导管和空质粒对照管加入iptg至终浓度为1mmol/l，非诱导对照不加，最终选择表达能力高的两个菌，用于大量的蛋白的表达。并按照常规的sds-page方法对表达产物进行鉴定。3)纯化将表达的产物用his蛋白纯化柱纯化蛋白，并透析脱盐，经测定纯化后的蛋白浓度为490mg/l。实施例2：抗ompc杂交瘤的制备1.ompc免疫抗原的乳化首免：ompc抗原与完全弗氏佐剂等体积混和乳化，加强免疫：ompc抗原与不完全弗氏佐剂等体积混和，用双注射器互推法乳化。2.动物免疫采用皮下或腹腔注射方法免疫6-8周龄balb/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔两周后进行第二次免疫，以不完全弗氏佐剂乳化，免疫剂量为50μg/只。免疫两次后取尾血以elisa法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫。融合前3天进行加强免疫，每只小鼠腹腔注射不加佐剂的100μg抗原，3天后进行细胞融合。3.细胞融合融合前将peg1500置于37℃培养箱中预温，吸取1×107个sp2/0骨髓瘤细胞悬液和5×107个来源于spf级balb/c小鼠脾脏b淋巴细胞悬液(细胞数1∶5)至一个50ml离心管中，补加30mlimdm不完全培养基，充分混匀，1500rpm离心5min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状，将离心管37℃水浴，用滴管吸取0.8ml预温的50％peg1500溶液，在离管底约2cm处沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管，在1min左右加完，然后静置90s，逐滴加入37℃预温的不完全培养基imdm8ml终止融合，2min之内加完，速度先慢后快，动作轻柔，将离心管在37℃培养箱中静置5min，取出离心管，1000rpm离心5min，弃去上清，加入10mlhat(sigma)培养基重悬细胞，轻轻吹打，混匀，将融合细胞接种至已铺有滋养细胞的96孔细胞培养板，按100μl/孔，每块培养板留6孔接种sp2/0细胞，作为hat选择的阴性对照，置37℃，5％co2培养箱中培养。4.筛选和克隆融合后第5天即可在倒置显微镜下观察细胞的生长情况，并补加hat培养基100μl，第10天可用间接elisa法测杂交瘤效价，第14天换ht(sigma)培养基(含饲养细胞和1％ht液体)的96孔板中。放入5％co2细胞培养箱。一筛：挑克隆后3天左右，观察细胞量大约占底面积2/3时，取100μl上清elisa筛选。阳性克隆进行换液，添加200μl完全培养基(含1％ht液体)；二筛：2天后重复步上述步骤进行二次筛选。阳性株转入预先准备好培养基(含饲养细胞和1％ht液体)的24孔板。三筛：5天后，再次筛选，符合要求的克隆转入细胞培养瓶扩大培养。经多次克隆筛选，最终得到培养上清抗体效价为1∶32万的抗ompc的阳性杂交瘤细胞株，命名为hr00213-55.杂交瘤细胞株保存发明人将符合要求的杂交瘤细胞株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，保藏号为cctccno：c2016161。实施例3：由保藏号为cctccno：c2016161的杂交瘤细胞制备抗ompc单克隆抗体1.腹水制备10-12周龄的雄性balb/c小鼠腹腔注射0.5ml液体石蜡，一周后每只小鼠用1ml注射器腹腔注射经pbs洗涤重悬的单克隆细胞悬液，细胞用量为5×106/只。待小鼠腹水积聚后收集腹水。2.单克隆抗体纯化将腹水在4℃条件下，10000转/分钟离心10分钟，去除脂类物质。离心后吸取上清，并用用0.45μm膜过滤。proteing进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-20℃。3.elisa法鉴定单克隆抗体亚类用100mmpbs(ph7.4)稀释包被羊抗鼠igg(中杉金桥)稀释至0.5μg/ml，每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％tween的pbs(pbst)洗3次，每孔加入200μl封闭液，37℃孵育1小时。倾空液体，用pbst清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1小时。倾空液体用pbst清洗3次。用封闭液1∶1000稀释hrp标记的羊抗鼠(κ，λ)抗体或1∶2000稀释hrp标记的羊抗鼠(igm，igg1，igg2a，igg2b，igg3，iga)抗体0.1ml每孔，分别加入适当的孔中，37℃用孵育1小时。倾空液体，用pbs-t清洗3次。每孔加50μl底物溶液，10-20分钟内测450nm波长下的od值。实验结果显示，本发明单克隆抗体为igg1型鼠源单克隆抗体，命名为hr00213-5。实施例4：ompc工程抗体制备用trizol试剂从抗ompc单克隆抗体的杂交瘤细胞株(hr00213-5)中提取总rna，用一对特异性引物通过rt-pcr扩增mabvh和vl的dna编码区基因。根据序列分析的结果，设计引物扩增vh和vl基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术，将hr00213-5的vh、vl基因及其相应信号肽序列与人iga或igg的ch基因、cκ链基因进行拼接，构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pires/hr00213-5。用脂质体法将其导入293t细胞株中进行瞬时表达，利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。ncbi基因数据库blast的结果显示，克隆的基因序列符合小鼠vh、vl基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pires/hr00213-5的构建正确，并在293t细胞株中获得瞬时表达。表达的抗ompc的人-鼠嵌合抗体和mabhr00213-5具有相同的抗原结合位点。克隆鼠抗ompcmabv区编码基因，并实现了可溶性抗ompc的人-鼠嵌合抗体在293t细胞中的瞬时表达。进一步用该重组载体转染中国仓鼠卵巢细胞(cho)，获得能稳定表达抗ompc的人-鼠嵌合抗体iga或igg。实施例5：elisa检测ompciga抗体在本实施例中，用实施例4中得到的ompc嵌合抗体分别配制阳性质控、参考品和阴性质控，自制的ompc抗原作为包被抗原。ompc体外诊断试剂盒的制备和操作如下：1.各种缓冲液及试剂的配制：a包被缓冲液：0.050m、ph9.6的cb(碳酸盐缓冲液)；b封闭液：0.1mpbs+0.5％bsa+0.5％tween-20+0.04％proclin300+2％蔗糖；c样品/洗涤缓冲液：ph7.2的10×pbs-tween-20；d校准品稀释液ph7.60.1mpbs+20％fbs+0.04％proclin300e酶标记物稀释液：ph7.40.1mpbs-tween20+20％fcs+0.04％proclin300ftmb单组份显色液：购买于湖州英创生物公司2.包被板的制备：将ompc抗原溶于ph＝9.6的0.05m的碳酸盐缓冲液中，制成预包被液，在酶标板上每孔按0.5μg/孔加入100μl，置4℃放置20小时，取出，甩掉包被液，洗涤，经bsa封闭16小时、过夜干燥后装入铝铂袋中抽真空密封，并置于4℃保存。3.hrp标记的羊抗人iga：hrp标记的羊抗人iga购买于abcam，工作液按1∶2万倍稀释。4.阳性质控品、临界参考品和阴性质控品的配制。elisa法同时检测20例临床阴性样本，算出临床阴性样本的od平均值，根据p/n≥2.1，可确定阴阳性临界od值。同一酶标板内检测阴性样本和不同稀释度的ompc嵌合抗体，根据表1.的检测结果，阴性样本平均od值为0.432，据此计算出临界值参考品的od值为0.9，稀释度为1∶8.5万倍ompc嵌合抗体可作为临界参考品的配制稀释度，此临界值参考品的浓度设定100u/l。阳性质控品的od值应大于临界参考品od值的1.5倍，阴性质控品的od值应接近阴性样本的平均od值，用校准品稀释液分别配制阳性质控品、临界参考品和阴性质控品，实验结果见表1。表1.阴性样本均值阴性质控临界参考品阳性质控稀释度1∶2001∶35万1∶8.5万1∶2万od0.4280.4060.912.2045.elisa操作步骤样本需200倍稀释每孔加入阴性质控、阳性质控及校准品和稀释后的样本100ul，均为双孔，37℃孵育60分钟，用洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。在各孔内加入hrp标记的羊抗人iga，100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。再在各孔内加入酶联物100μl/孔，37℃孵育30分钟，用1×洗涤缓冲液洗涤5次，拍干。加入tmb底物液，每孔各100μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，用酶标仪检测(450nm)检测吸光度值(od)，检测od值见表2。6.检测结果结果解释：临界值为100u/l检测数值＜100u/l时，判断为阴性；检测数值100u/l-120u/l时，判断为弱阳性；检测数值＞120u/l时，判断为强阳性。由表2结果可知：病人阳性样本符合率＝(12/12)*100％＝100％，病人阴性样本符合率＝(15/15)*100％＝100％。表2.检测测样od检测测样od检测测样od阳性参考品2.160阴性样本80.384阳性样本31.623阴性参考品0.418阴性样本90.391阳性样本42.070临界值参考品0.902阴性样本100.467阳性样本52.652阴性样本10.521阴性样本110.581阳性样本61.085阴性样本20.406阴性样本120.406阳性样本72.422阴性样本30.530阴性样本130.536阳性样本82.114阴性样本40.319阴性样本140.319阳性样本91.686阴性样本50.352阴性样本150.352阳性样本101.935阴性样本60.448阳性样本11.860阳性样本111.243阴性样本70.362阳性样本22.362阳性样本122.226实施例6：免疫印迹法检测ompcigg抗体1.制备ompcigg免疫印迹试纸条制备ompcigg免疫印迹试纸条，碱性磷酸酶(ap)标记羊抗人igg抗体，检测条带包被ompc抗原，质控条带包被抗ap抗体，根据实施例6所制备的临界值参考品来调试。1.各种缓冲液配制：a.划膜缓冲液：10mmpbsph7.4+1％海藻糖b.封闭液：0.1mpbs+1％bsa+0.1％tween-20+0.04％proclin300+5％蔗糖c.通用缓冲液：0.01mph7.2pbs+0.1％bsa+0.1％tween20d.酶标记物稀释液：ph7.2的10×pbs-tween20+2％fcs+0.1％酶稳定剂、0.04％proclin300e.bcip/nbt底物：购买于湖州英创生物公司2.膜条的制备：将nc膜贴至背衬底板的制定位置，用划膜缓冲液将ompc抗原稀释至1mg/ml，用于制备检测线；划膜缓冲液将抗ap抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备质控线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗原和抗体均匀的划至nc膜上对应位置；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中，干燥过夜；干燥完毕后，将试剂条整体放入封闭液中浸泡30s，待完全湿润后，拿出至37℃干燥箱中，干燥过夜，干燥完毕后，将大块板用切条机裁切成5mm宽小试剂条，干燥环境包装，待用。3.ap标记羊抗人igg：购自abcam，工作液1∶2.5万稀释。4.阴阳性质控品制备：同实施例6。5.检测操作步骤：将待测膜条放入放入温育槽内，加入1.0ml通用缓冲液，摇床慢速孵育5min；吸去液体，在温育槽内加入1.0ml未稀释的样本，37℃摇床慢速孵育1小时；反应完毕后吸去多余的液体，用1ml通用缓冲液清洗5min，重复清洗三次，每次5min；吸去液体，在温育槽内加入1.0ml酶结合物，摇床慢速孵育1小时；吸去多余液体，在温育槽内加入1.0mlbcip/nbt底物，摇床慢速孵育10min；吸去多余液体，用蒸馏水把膜条冲洗干净，再将膜条固定在结果判定模板上，风干后判断结果。6.检测结果：将不同浓度质控品用膜条进行测试，结果见表3：表3阴性样本均值阴性质控临界参考品阳性质控强阳性质控稀释度/1∶45万1∶9.2万1∶3万1∶1万显色信号--++++++取同一浓度阳性质控，连续测10条，显色均为++，显色均一。实施例7：胶乳免疫层析检测ompciga抗体1.制备ompc抗体iga彩色胶乳免疫层析试纸条制备ompc抗体iga彩色胶乳免疫层析试纸条，红色胶乳微球分别标记羊抗人iga和羊抗鸡igy，检测带t线包被ompc抗原，质控带c线包鸡igy，根据实施例5所制备的临界值参考品来调试。1)胶乳微球的标记取胶乳微球1000ul(210nm)(1％原液)，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1000ul去离子水超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer(50mm，ph6.0)1000ul，超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer1000ul，超声混匀，称量50mgedc，缓慢加入微球混合液中，混匀，反应中会有部分团聚，及时超声混匀，室温反应15分钟；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)1000ul，超声10秒混匀；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液1000ul，超声10秒混匀，加入标记抗体120ug(标记浓度120ug/ml)，室温摇床中速反应2小时；离心，弃上清，加入1000ul封闭液，冰水超声混匀，室温摇床中速反应1小时；离心，弃上清，加入1000ul硼酸盐缓冲液(20mmph8.0)，冰水超声10-30秒混匀，做好标签，4℃保存待用。2)样品结合垫的处理玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mmph7.4pb，其中含有2％nacl，2％bsa、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％s9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，50℃干燥过夜；通过金标hm3035喷金划膜仪的喷头，将标记有胶乳微球的羊抗人iga和羊抗鸡igy抗体按照8μl/cm的量超声喷雾至宽为1cm的玻璃纤维素膜上，37℃(湿度小于30％)干燥，干燥时间至少3小时，制备得到样品结合垫。3)硝酸纤维素膜(nc膜)处理将nc膜贴至背衬底板的制定位置，用50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将ompc抗原稀释至1mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗原和抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于50℃干燥箱中，干燥过夜。4)组装将步骤2)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。2.阳性质控品、临界参考品和阴性质控品的配制根据实施例5的方法，用cbirl嵌合抗体配制不同浓度的校准品500u/l、300u/l、150u/l、100u/l、50u/l。3.检测线性检测：配制好的不同浓度质控品用胶体金试纸条进行检测，15min后读取结果，对应结果见表格4，浓度由低到高，显色强度逐渐增强，整体反应线性良好，浓度低于100u/l显示阴性，浓度高于100u/l显示阳性。表格4浓度50u/l100u/l150u/l200u/l250u/l显色强度--/+++++++阴阳性符合率：配制50例不同浓度阳性质控品(浓度＞100u/l)，50例不同浓度阴性质控品(浓度＜u/l)，与某品牌胶体金试纸条进行测试，阴阳性质控品用两种胶体金试纸条测试符合率一致，阴阳性符合率均为100％，对检测结果见表5.表格5我公司胶乳试纸条某品牌试剂盒50例阴性质控品结果50例结果均为阴性50例结果均为阴性50例阳性质控品结果50例结果均为阳性50例结果均为阳性实施例8：荧光免疫层析检测ompciga抗体3.制备ompc抗体iga荧光免疫层析试纸条制备ompc抗体iga荧光免疫层析试纸条，荧光微球分别标记羊抗人iga和羊抗鸡igy，检测带t线包被ompc抗原，质控带c线包鸡igy，根据实施例5所制备的临界值参考品来调试。1)荧光微球的标记取荧光微球1000ul(210nm)(1％原液)，13000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入1000ul去离子水超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer(50mm，ph6.0)1000ul，超声10s混匀；离心，弃上清，加入mesbuffer1000ul，超声混匀，称量50mgedc，缓慢加入微球混合液中，混匀，反应中会有部分团聚，及时超声混匀，室温反应15分钟；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液(20mm，ph8.0)1000ul，超声10秒混匀；离心，弃上清，加硼酸盐缓冲液1000ul，超声10秒混匀，加入标记抗体120ug(标记浓度120ug/ml)，室温摇床中速反应2小时；离心，弃上清，加入1000ul封闭液，冰水超声混匀，室温摇床中速反应1小时；离心，弃上清，加入1000ul硼酸盐缓冲液(20mmph8.0)，冰水超声10-30秒混匀，做好标签，4℃保存待用。2)样品结合垫的处理玻璃纤维素膜用含有表面活性剂的缓冲液(配方：100mmph7.4pb，其中含有2％nacl，2％bsa、0.5％酪蛋白、0.1％吐温-20、0.5％s9和5％蔗糖)浸泡进行预封闭后，50℃干燥过夜；通过金标hm3035喷金划膜仪的喷头，将标记有胶乳微球的羊抗人iga和羊抗鸡igy抗体按照8μl/cm的量超声喷雾至宽为1cm的玻璃纤维素膜上，37℃(湿度小于30％)干燥，干燥时间至少3小时，制备得到样品结合垫。3)硝酸纤维素膜(nc膜)处理将nc膜贴至背衬底板的制定位置，用50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将ompc抗原稀释至1mg/ml，用于制备t线；50mm的ph7.4磷酸盐缓冲液将鸡igy抗体稀释至0.5mg/ml，用于制备c线；按1μl/cm划液量，通过金标hm3035喷金划膜仪将上述两种稀释后的抗原和抗体均匀的划至nc膜上制备t线和c线；将划好的nc膜放置于37℃干燥箱中，干燥过夜。4)组装将步骤2)得到的样品结合垫固定叠压在步骤1)得到的硝酸纤维素膜的一端，并将吸水膜固定叠压在硝酸纤维素膜的另一端，用裁膜仪按每条4mm的宽度进行裁剪，并装入层析条壳体中，即得成品。2.检测2.1标准曲线制作2.1.1取实施例6中阳性校准品，浓度为400u/ml，并将其用实施例6中校准品稀释液依次梯度稀释，浓度值见表6。表6编号c0c1c2c3c4c5c6浓度(u/ml)01025501002004002.1.2检测方法取校准品100μl，加入层析条中样品窗口；10分钟之后，用分辨荧光定量分析仪定量检测发光值。每个校准品检测2次，取t/c值的平均值。具体结果见表7：表72.1.3标准曲线制备根据上述检测结果，以t/c值的对数值为x轴，以浓度的对数值为y轴进行线性回归，得到线性方程y＝0.4262x+2.184，r2＝0.9961，校准曲线见图2。2.2精密度测试：2.2.1取制备好的10张层析条，配置一个浓度(100u/ml)的ompc工作校准品；2.2.2取100μl校准品，加入试剂条加样孔中；2.2.3待校准品层析10min之后，用荧光定量分析仪对结果进行扫描分析，并将上述方程输入仪器，仪器根据方程测得10个试剂条的结果，结果如下表，说明本发明的ompc时间分辨荧光免疫层析定量检测试纸条精密度良好。当前第1页12