本发明涉及两株产减毒类脂a的cronobacter突变株及其应用，属于基因工程技术领域。
背景技术：
阪崎克罗诺肠杆菌(c.sakazakiibaa894)是一种自然界中广泛存在的食源性革兰氏阴性致病菌，存在食品安全隐患。而内毒素分子(类脂a)与这些菌的致病能力密切相关。近些年的研究表明，类脂a的磷酸基团和它的酰基脂肪酸链是刺激tlr4/md2受体的必须因素。不完整的类脂a结构相对于完整的类脂a结构对宿主细胞的免疫原性大大减弱。很多学者通过异源表达或者敲除来改造类脂a结构，从而开发疫苗。
疫苗佐剂是在疫苗接种过程中辅助疫苗作用、改善或增强疫苗作用效果的一类物质。利用某些结构改进的内毒素分子可以被开发为免疫佐剂。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供cronobacter的类脂a分子改造的基因工程菌，检测该分子改造对菌株的影响。
本发明的第一个目的是提供一种新型的cronobacter的基因工程菌，所述基因工程菌敲除了lpxm基因片段。
在本发明的一种实施方式中，所述cronobacter的基因工程菌是以conobactersakazakiibaa894或cronobactermuytjensiiatcc51329为出发菌株。
在本发明的一种实施方式中，所述c.sakazakiibaa894的lpxm基因片段和cronobactermuytjensiiatcc51329的lpxm基因片段核苷酸序列分别是seqidno:1和seqidno:2序列。
在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌的构建方法如下：将人工构建的lpxm敲除片段电转化入含pkd46质粒的c.sakazakiibaa894，获得突变株c.sakazakiibaa894△lpxm-loxpkan，再化转入pkd-cre质粒，通过位点特异性重组敲除卡那霉素抗性基因；去除pkd-cre质粒后获得无抗性类脂a的基因结构突变的基因工程菌。用同样的方法构建atcc51329△lpxm基因工程菌。
本发明的第二个目的是提供一种降低c.sakazakiibaa894和atcc51329对阳离子抗菌肽抗性和/或降低c.sakazakiibaa894和atcc51329在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力的方法，所述方法是敲除c.sakazakiibaa894和atcc51329菌的lpxm基因片段。
本发明的第三个目的是提供一种降低c.sakazakiibaa894和atcc51329对hek4细胞刺激作用的方法和降低菌株在巨噬细胞中的侵染水平，所述方法是敲除菌株lpxm基因片段。
本发明的第四个目的是提供所述基因工程菌在阳离子抗性肽及疫苗佐剂方面应用。
本发明的有益效果：
本发明通过敲除c.sakazakiibaa894和atcc51329菌的lpxm基因片段，菌株的外模渗透性有所提高、对阳离子抗菌肽抗性有所降低、更容易被抗菌肽杀死，和降低c.sakazakiibaa894和atcc51329在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力和对hek4细胞刺激作用，和降低菌株在巨噬细胞中的侵染水平，减弱了细胞毒性，对后期开发疫苗佐剂有一定的帮助。
附图说明
图1c.sakazakiibaa894和c.sakazakiibaa894△lpxm的类脂a的esi/ms分析；
图2atcc51329和atcc51329△lpxm的类脂a的esi/ms分析；
图3c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm敲除突变株的类脂a的tlc分析；1:c.sakazakiibaa894类脂a样品；2:c.sakazakiibaa894△lpxm类脂a样品；3:atcc51329类脂a样品；4:atcc51329△lpxm类脂a样品；
图4c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm敲除突变株的外膜渗透性；
图5c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm敲除突变株在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力。
图6c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm敲除突变株对tlr4信号通路的激活能力。
图7c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm敲除突变株侵染caco-2细胞。
具体实施方式
类脂a的的结构鉴定与分析：
esi/ms分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在thermofisherltq-xl质谱进行质谱检测。采用esi离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。
实施例1突变株c.sakazakiibaa894△lpxm和atcc51329△lpxm的构建
1、lpxm基因敲除片段的获得
采用化学全合成或pcr分步扩增的方法获得lpxm基因敲除片段，其两端分别为基因上下游同源臂、中间为带有loxp位点的kan片段，c.sakazakiibaa894和atcc51329的lpxm基因片段的核苷酸序列分别如seqidno.1、seqidno.2所示。将lpxm基因敲除片段克隆到pbluescriptiisk(+)，获得重组质粒pbluescriptiisk(+)-lpxmu-lkan-lpxmd。以该质粒为模板，可以扩增获得敲除片段lpxmu-lkan-lpxmd。
2、敲除感受态的制备及电转化
接种带有red重组辅助质粒pkd46(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa,2000,97(12):6640-6645)的c.sakazakiibaa894(luliu,xiaoyuanwang,yanyanli,wenguo.aphosphoethanolaminetransferasespecificforthe4′-phosphateresidueofcronobactersakazakiilipida.journalofappliedmicrobiology,2016,121(5),1444-1456)或atcc51329(张婵.阪崎肠杆菌脂多糖的结构分析及其相关基因czlpxl的研究.[硕士论文].无锡：江南大学)于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中，30℃，200rpm过夜培养。按2％接种量转接100mllb液体培养基，30℃，200rpm培养至od600＝0.2时加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导重组酶的表达，继续培养od600＝0.5，将培养液冰浴半小时后转入预冷的50ml离心管中，4℃，4000rpm离心10min收集菌体，沉淀用预冷的10％甘油洗涤3次，最后用1ml10％甘油悬浮，每管80μl分装至预冷的无菌ep管中。
将500-1000nglpxm敲除片段加入感受态细胞中，混匀，冰浴15min，1.5kv电击5ms，30℃孵育2h，涂布30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，30℃培养，挑取转化子于含30μg/ml卡那霉素及100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，pcr验证结果。
3、突变株抗性标记的去除
将pcr验证阳性的菌株接种含30μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，42℃过夜培养，将培养液划线30μg/ml卡那霉素的lb固体平板，37℃培养，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素的敏感性，将含有卡那霉素抗性并对氨苄青霉素敏感的菌株命名为c.sakazakiibaa894△lpxm::kan和atcc51329△lpxm::kan并保藏。以此为出发菌株做感受态，转入pkd-cre质粒，42℃热激表达flp酶，将阳性菌株于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中培养，加入l-阿拉伯糖(终浓度为30mmol/l)诱导cre重组酶的表达，介导loxp位点特异性重组，pcr验证挑选转化子。将pcr验证正确的菌株42℃热激后划线lb平板，挑取单菌落验证其对氨苄青霉素及卡那霉素的敏感性，选取对两种抗生素均敏感的菌株命名为c.sakazakiibaa894△lpxm和atcc51329△lpxm并保藏。
实施例2c.sakazakiibaa894和atcc51329及其lpxm缺失突变株的类脂a结构esi/ms分析
类脂a的提取方法采用氯仿/甲醇/h2o溶液混合相萃取法。将过夜培养的菌液按初始od600＝0.02转接到200mllb液体培养基中，37℃培养至菌体对数期后期时，4000rpm离心30min收集菌体，ddh2o洗涤菌体一次后用bligh-dyer一相体系(氯仿/甲醇/水溶液，1:2:0.8，v/v/v)76ml悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm离心30min分相，使用一相体系洗涤细胞碎片2-3次；加入27ml12.5mm的醋酸钠(ph4.5)溶液，超声震荡2min，100℃水浴30min裂解糖链。冷至室温后加入30ml氯仿和30ml甲醇配成bligh-dyer二相体系(氯仿/甲醇/水，2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心30min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发。加入氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)将lipida洗出。
类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(4:1，v/v)中，在thermofisherltq-xl质谱仪上进行质谱检测。采用esi离子源，阴离子检测模式，检测范围小于m/z2500。
对于c.sakazakiibaa894的类脂a主峰值为依次m/z1716.3、1744.3、1796.3和1824.3，m/z1716.3和1744.3为1796.3和1824.3掉一个磷酸基团的峰值(结果如图1)；而c.sakazakiibaa894△lpxm的主峰值m/z依次为1534.3、1614.3、1772.3和1852.3，其中1534.3和1772.3分别1614.3和1852.3掉一个磷酸基团的峰值，m/z1614.3比1796.3少182da(一个c12:0脂肪酸基团)，比1824.3少210da(一个c14:0脂肪酸基团)，说明c.sakazakiibaa894的lpxm基因不发挥作用，图中还出现了m/z1852.3，比m/z1614.3多出约为238da(一个c16:0脂肪酸基团)，说明lpxm基因敲除以后，它的类脂a出现了修饰。
同时对于atcc51329的类脂a主峰值为依次m/z1716.3、1744.3、1796.3和1824.3，m/z1716.3和1744.3为1796.3和1824.3掉一个磷酸基团的峰值(结果如图2)；而atcc51329△lpxm的主峰值m/z依次为1534.3、1614.3、1772.3和1852.3，其中1534.3和1772.3分别1614.3和1852.3掉一个磷酸基团的峰值，m/z1614.3比1796.3少182da(一个c12:0脂肪酸基团)，比1824.3少210da(一个c14:0脂肪酸基团)，说明atcc51329的lpxm基因不发挥作用，图中还出现了m/z1852.3，比m/z1614.3多出约为238da(一个c16:0脂肪酸基团)，说明lpxm基因敲除以后，它的类脂a出现了修饰。
实施例3c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及lpxm缺失突变株薄层层析(tlc)检测
进行类脂a的tlc，将样品点于gel60tlc板上，展层剂为氯仿/甲醇/水/氨水(25:15:4:2，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展层剂，用溶于乙醇的10％硫酸进行碳化，置于加热板上显色(结果如图3)。
tlc结果显示该方法提取c.sakazakiibaa894、atcc51329及lpxm缺失突变株类脂a，在tlc板上，类脂a脂肪酸链数越多其疏水性越大，迁移速率越大，在图上突变株类脂a的迁移速率低于野生菌株，说明突变株类脂a的主要结构缺失一条脂肪酸链。
实施例4c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及lpxm缺失突变株细菌外膜渗透性
npn是一种非极性荧光探针分子，它可以在疏水环境中表现出荧光吸收特性，因此这种物质可以作为研究细菌外膜渗透性的探针分子。
将过夜培养的菌液按照初始od600＝0.02转接到50mllb液体培养基中，37℃，200rpm/min培养至od600＝1.0，离心收集菌体，用pbs缓冲液洗涤一次并重悬。将1.92ml重悬菌液和80μl1mmol/l的npn溶液加入石英比色皿中，混合之后测定荧光吸收值，这一数值的大小代表细胞外膜渗透性的大小。荧光分光光度计激发波长为350nm，发射波长为420nm，缝宽5mm。结果如图4所示，可知：lpxm基因缺失之后，细胞膜的通透性变强，对一些抗生素的抵抗能力会减弱，更容易被杀死。
实施例5c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及lpxm缺失突变株对阳离子抗性肽的抗性
采用微量肉汤稀释法分别测定c.sakazakiibaa894、atcc51329及其突变株菌株对阳离子抗性肽的mic值。
粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素。其环形多肽部分的氨基与细菌外膜脂多糖的2价阳离子结合点产生静电相互作用，使外膜的完整性破坏，导致胞浆内的磷酸、核苷等小分子外溢，引起细胞功能障碍直至死亡。
抗生素用lb液体培养基倍比稀释，使浓度分别为50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39、0.19μg/ml加入96孔板中，留一排新型lb培养基作生长对照；另将等体积od600＝0.01的稀释菌液加入96孔板中，盖上盖子，37℃静置培养12h，用酶标仪测定菌液od600。结果如表1所示。由表1可知，lpxm基因缺失之后对阳离子抗菌肽的抗性减弱，说明lpxm对阳离子抗菌肽的抗性起作用。
表1c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及突变株对多粘菌素b和colistin的mic值
实施例6c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及突变菌株在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力
c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及突变菌株在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力的检测方法如下：
raw264.7细胞是小鼠单核巨噬细胞，源自abelson鼠科白血病病毒诱导的肿瘤。raw264.7细胞使用dmem培养基+10％胎牛血清(含100u·ml-1青霉素，100μl·ml-1链霉素，4500mg·l-1d-葡萄糖，2mmol·l-1l-谷氨酰胺)，37℃，5％co2培养箱培养。将活化好的菌体转接入5mllb培养基中，菌体长到od600为1后进行实验。收集raw264.7细胞，控制量为2×105个·ml-1，然后加入到24孔板中，每孔500μl，培养12h。倒掉上清，然后加入含有菌体的新鲜培养基500μl，菌体的浓度控制在2×107cfu·ml-1。细菌侵染细胞2h后，pbs洗三次，用100ng·ml-1庆大霉素除去胞外菌体，每隔几小时取样一次。取样时，先用pbs洗细胞3次，然后加入0.01％的皂素，裂解细胞10min，梯度稀释进行涂布，培养20h后在平板计数。
c.sakazakiibaa894和atcc51329是一种食源性致病菌，具有在巨噬细胞中生存繁殖的能力。细菌在巨噬细胞中的生存，与其自身毒性有必要的关联。细菌毒性越小在巨噬细胞中繁殖能力越弱；当细菌表现出强度性时，细菌自身在巨噬细胞中的生存和繁殖能力也会有所提高。本发明测定了c.sakazakiibaa894和atcc51329及其突变菌株在小鼠raw264.7细胞内复制存活能力，从而反应该基因对于细菌自身毒性的影响。
结果显示(图5)，c.sakazakiibaa894和atcc51329野生型在细胞中繁殖速率较快，c.sakazakiibaa894△lpxm和atcc51329△lpxm均比其相应野生型菌株在巨噬细胞中的繁殖水平有明显的降低，c.sakazakii在细胞中繁殖速率高于atcc51329，在12h和24h时间段，细菌繁殖速度最快。同时c.sakazakiibaa894△lpxm和atcc51329△lpxm相对于野生型在细胞内细菌繁殖速度有所减慢，说明不完整的类脂a对宿主细胞的免疫原性有所减弱。
实施例7c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及lpxm缺失突变菌株对tlr4信号通路激活的能力
hek-bluehtlr4细胞因转染表达了人类tlr4及nf-kb诱导分泌的seap报告基因，能够特异性地识别培养体系中活细菌体表明的lps而分泌蓝色的seap激酶，实时监测lps诱导的tlr4免疫通路的强弱，通过seap显色的深浅指示出菌体对tlr4的刺激能力和对细胞的毒性。吸光值越大，对细胞毒性越大。
基因工程菌成功构建后，菌体表明lps结构均发生了较大的变化，通过用活菌体直接刺激hek-bluehtlr4细胞，能最直观地反映出菌体及其合成的lps的细胞毒性变化趋势。
图6为野生型c.sakazakiibaa894和atcc51329与突变株的实验结果。如图，野生型和突变株各菌株都能有效激起tlr4信号通路；在菌浓为在活菌浓度为104～106cfu/ml范围内，各菌株的hek-blue的显色反应线性最明显。在菌浓为105cfu/ml时，对tlr4通路的刺激能力c.sakazakiibaa894>atcc51329>c.sakazakiibaa894△lpxm＞atcc51329△lpxm。由此可见lipida部分的精细结构是决定菌体对tlr4的刺激能力和对细胞的毒性的主要因素。
由对tlr4通路的激活能力，lpxm基因对于开发减毒的疫苗佐剂有作用。
实施例8c.sakazakiibaa894、atcc51329野生型及lpxm缺失突变菌株的caco-2细胞侵染实验
caco-2细胞使用mem培养基+10％胎牛血清(含100u/ml青霉素，100μl/ml链霉素，4500mg/l葡萄糖，2mmol/ll-谷氨酰胺)，37℃，5％co2培养箱培养，800r/min离心5min收集细胞，并用pbs缓冲液洗去胰酶；细胞计数后重悬在无抗的细胞培养基中，向24孔组织培养板各个孔中加入500μl细胞(约1×105个细胞)；在37℃，5％co2培养箱中过夜培养；过夜培养的菌液按1％的接种量转接，37℃，200r/min培养3h；取1ml菌液，5000r/min离心5min收集菌体；将菌体重悬至pbs缓冲液，并测定od600值；用无抗的细胞培养基将菌液稀释至菌体浓度大约为107cfu/500μl；倒掉过夜培养细胞的培养基，添加菌液500μl至24孔组织培养板中，37℃，5％co2培养箱中静置培养3h，弃掉之前的培养基，加入含有100μɡ/ml庆大霉素的新鲜培养基，培养1h。用pbs清洗细胞两次，然后加200μl0.25％含edta的胰酶消化细胞2min，加入300μl的0.5％tritonx-100裂解细胞；将细胞裂解液稀释至合适的浓度，涂平板37℃培养过夜并统计菌落数，每个样品三个平行。
caco-2细胞是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，是被广泛应用于肠道吸收的细胞模型。2002年被fda批准认定为动物实验代替方法。c.sakazakii属于肠道菌，可以穿透血脑屏障引起脑膜炎等疾病。实验结果如图7所示，结果显示lpxm突变株的入侵caco-2细胞的能力减弱，其毒性减弱。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<110>江南大学
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