本发明属于农业和环境污染治理技术领域，涉及一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂及促进超积累植物生长及其萃取复合污染土壤重金属的植物-微生物联合修复方法。
背景技术：
随着工农业生产的快速发展和城市化进程的不断加快，土壤重金属污染日益严重。我国农田重金属的主要污染源是污水灌溉、农药和肥料的施用、固体废弃物垃圾的堆积、矿山开采与冶炼等。重金属污染对农作物的生产、产量和品质均有较大的影响，尤其被作物吸收富集后，可以通过食物链危及人类的健康与生命安全。重金属污染已成为我国土壤质量下降的重要因素，已经成为最重要的农业生产问题，因此，修复重金属污染土壤己经成为环境学界和土壤学界研究的热点。
在植物修复技术中，超积累植物因其对重金属离子有特殊的富集能力，是目前研究较多的修复植物，但是其多为野生型植物，种类稀少、区域性分布较强，而且生物量小、生长缓慢、地区适应性差，因此不适合大规模应用。由于植物对土壤重金属提取效率较低、修复时间长等问题，实际应用受到很大限制。而微生物修复即利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程，微生物修复常应用于水或土壤的重金属修复。
在土壤生态系统中，植物、微生物和土壤紧密联系，相互依存，相互作用，共同维持着生态系统的平衡和“健康发展”。仅凭植物修复或者微生物修复方式过于单一，效果不显著，在实际应用过程中受到诸多制约。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种促进超积累植物生长及强化超积累植物萃取土壤重金属的细菌菌株。
本发明的另一目的是提供一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂。
本发明的又一目的是提供利用该生物修复试剂的促进超积累植物生长及其萃取复合污染土壤重金属的植物-微生物联合修复方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一种促进超积累植物生长及强化超积累植物萃取土壤重金属的细菌菌株，分类命名为arthrobactersp.pgp41，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年02月02日，菌种保藏号为cctccno：m2018082。
该植物根际细菌是从中国湖北省房县铅锌污染矿区植物根际土壤中分离得到，经鉴定为节杆菌属。主要生物学特性为观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，湿润，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，无芽孢，无鞭毛。生物学实验中淀粉水解，vp实验，h2s产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，但不能利用柠檬酸盐，脲酶活性及甲基红反应为阴性，综合鉴定菌株为节杆菌属。
一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂，所述的生物修复试剂含有节杆菌属菌株，所述的节杆菌属菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2018年02月02日，菌种保藏号为cctccno：m2018082。
该生物修复制剂为液体制剂，其中液体制剂中节杆菌属菌株有效活菌数为2亿个/毫升以上，优选7.3亿个/毫升以上。所述的液体制剂通过常规的液体发酵方法发酵所述的节杆菌属菌株制备得到。
或者，该生物修复制剂为固体制剂，其中保藏号为cctccno：m2018082的节杆菌属菌株的有效活菌数为3.329×1011个/g以上。通过冷冻干燥的方法，将所述的节杆菌属菌株发酵液配制成粉剂，即得到固体制剂。
一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复方法，其特征在于，在原位污染土壤中种植超积累植物，并在超积累植物根际接种所述的促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂，利用生物修复试剂促进植物生长并提高植物萃取污染土壤重金属的能力，大大提升植物对重金属的转移和吸收。
超积累植物为龙葵和/或美洲商陆。
龙葵种子用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min，美洲商陆种子用浓硫酸破壁10-20分钟后，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后浇hogland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中。
重金属原位污染农田土壤从南京栖霞山铅锌矿区采集获得，其土壤为铅、锌、镉复合污染土壤，其中含量分别为pb：919.46mg/kg、zn：2087.62mg/kg、cd:10.23mg/kg。
所述的生物修复试剂配制过程如下：将节杆菌pgp41菌株接入lb培养基活化18-20h，得到的菌液为菌株种子液，然后按接种量5-10％v/v接入含lb培养基的发酵罐液体培养24-36h，28-35℃，200-300rmp/min发酵培养后下罐，所得的发酵液为含节杆菌pgp41的生物修复制剂；将发酵液接种于植物根际，每千克土壤接种108个细菌/ml的发酵液30-50ml，分1-2次接种。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：通过本发明的生物修复试剂及方法进行修复处理后，地上部的株高与地下部的根长均呈明显的增加，且地上部与地下部的生物量均有明显的提高，表明pgp41能够促进超积累植物龙葵的生长；美洲商陆接菌以后也呈现了相同的趋势，而且植物促生作用更为明显，因此，菌株pgp41对龙葵和美洲商陆有明显的促生作用。两种植物在接菌后发现与对照相比对重金属铅、锌、镉的提取效果明显增强。但是单位质量的铅和锌的提取效果有下降趋势，表明接入菌株pgp41后提取铅和锌重金属效果增加，而两种超积累植物的促生作用强烈，所以会导致单位提取重金属效果减弱，但总提取量增加，表明菌株pgp41能够促进超积累植物龙葵和美洲商陆萃取复合污染土壤中的重金属，对重金属污染的修复有重大意义。同时土壤有效态的结果表明，接菌pgp41后龙葵根际土壤zn、pb、和cd的有效态都有明显的提高，美洲商陆在接菌后土壤的zn、pb、和cd有效态都有所下降，这是因为美洲商陆根际提取了更多的重金属，导致有效态有所下降，这些都表明菌株pgp41对超积累植物龙葵和美洲商陆有很强的促生作用，同时能强化超积累植物龙葵、美洲商陆萃取污染土壤重金属。
总之，本发明使得植物与微生物共同作用，利用土壤一微生物植物的共存关系，充分发挥植物和微生物修复各自的优势，取长补短，可以起到克服植物修复周期长的缺点，从而提高植物修复效率，达到彻底修复土壤重金属污染的目的。此技术安全、绿色、廉价、环保。因此，选用植物-微生物联合应用于复合污染土壤治理领域，使这两种修复技术能够最大程度展现联合优势，在土壤重金属修复领域具有更大的修复潜力。
附图说明
图1为节杆菌pgp41在adf固体培养基上生长情况示意图；
本图为测定节杆菌pgp41是否具有acc脱氨酶活性，如具有，则可以在以acc做唯一氮源的固体培养基上生长。
具体实施方式
以下实施例所用的微生物细菌为节杆菌属
实施例1节杆菌pgp41的筛选、鉴定及生物学特征(结果详见表1、表2、图1)
1)土壤样品来源：湖北房县铅锌矿植物根际土壤。采集人：张周，联系电话：025-84396391，采集单位：南京农业大学。
2)菌株筛选：取采集的植物根系土壤样品10g，放入含90ml无菌水的锥形瓶内，摇床中振荡20min，静置20-30s，制成菌悬液。无菌条件下取1ml菌悬液放入盛9ml无菌水试管中，混合均匀，依次用无菌水稀释制成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6各种浓度稀释液。
取0.1ml上述浓度的稀释液分别涂布于富集培养基上，每个浓度分别设置三个重复。30℃倒置培养24h-36h，挑取不同形态的单菌落，经多次划线进行纯化。
3)耐镉性筛选：将经过多次划线分离纯化完全的菌株接种于耐镉培养基平板上，其中镉的浓度分别为0，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1(单位为mm)。对菌株进行耐镉性的筛选。
4)iaa产生实验：将色氨酸配成2.5mg·ml–1的溶液，避光过滤除菌。将有氮液体培养基分装与于15cm×15mm的玻璃试管中，每管4ml，121℃高压蒸汽灭菌，冷却后，加入过滤除菌的色氨酸溶液1ml，使色氨酸的浓度为0.5mg·ml–1。挑取纯化后的菌株接种于上述培养液中，摇床培养3d，用无菌枪头取出置于灭菌的10ml离心管中，6000r/min离心10min，用无菌枪头取出1ml上清液加50ul10mm的正磷酸，并加入2ml的sackowki′s显色剂(250ml去离子水﹢150ml浓硫酸﹢7.5ml0.5mol·l–1的fecl3·6h2o)充分混合，室温黑暗处显色30min，出现粉红色为阳性，说明有iaa产生。采用salkowski′s比色法测可定性测定菌株利用色氨酸产iaa的能力。暗处反应后取出立即用分光光度计测定530nm波长处的吸光值。以不接菌的培养基做对照调零。结果表明pgp41菌株产iaa量高达13.14mg/l。
5)固氮能力检测：用灭菌的牙签将分离得到的细菌接种于低氮培养基中，28℃培养7d，转接三次观察是否生长，结果表明pgp41在缺氮培养基上生长良好。
6)铁载体
铁载体量测定利用菌体产生的铁载体与加入物质产生的结合产物在固定波长下的吸收值进行半定量，从而比较菌株产铁载体量的能力。具体实验步骤如下：
(1)溶液的配制：
a(10mm的hdtma)：称取0.182g的试剂50ml容量瓶中定容即得；
b(1mm的三氯化铁)：0.020g试剂容量瓶中定容至50ml；
c(2mmcas)：0.061g试剂容量瓶中定容至50ml；
取a15ml加入250ml容量瓶中，用双蒸水适度稀释；将3.75mlb与18.75mlc混合均匀，沿玻璃棒缓慢加入到之前的容量瓶中；称取10.7675g污水哌嗪溶于75ml双蒸水中，再小心加入15.25ml的12m的浓盐酸，即得ph＝5.6的缓冲液，将此溶液加入容量瓶中最终定容即为显色反应液。
(2)实验步骤：菌体接入有氮液体培养基中30℃摇床下培养48h，离心取上清4ml于10mlep管中，加入4mlcas检测液混合充分，1-2h后于630nm波长下测定吸光度，以di调零，以未接菌的培养基上清为对照。
7)acc脱氨酶测定
将菌株接入新鲜的yn培养基中进行活化，过夜培养约16h后，按5％接种量接种至50ml锥形瓶中，比例为df:yn＝20:1，摇床培养24h后将df培养液中的菌株接种到adf固体培养基上，28℃培养箱培养7天观察菌落生长情况，结果表明pgp41在adf固体培养基上生长良好。
8)解p
用灭菌的牙签分将上述分离得到的菌株分别点接于pko培养基上，28℃培养5d，观察菌株的生长情况，选择菌落周围透明圈直径较大、透明圈与菌落直径之比较大的溶磷菌株，接种到nbrip液体培养基中，30℃往复摇床170r·min-1培养7d，测定培养液中有效磷浓度。
将培养液以3000r·min-1离心，上清液经适当稀释后，用钼锑抗比色法直接测定培养液中的有效磷浓度。标准曲线的绘制：分别准确吸取5ppm磷标准液0ml、1ml、2ml、3ml、4ml、5ml于25ml容量瓶中，同时加入与显色测定所用的样品溶液等体积的空白溶液，二硝基酚指示剂2～3滴，并用4n的氢氧化钠溶液调解至溶液呈微黄色，准确加入2.5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，即得含磷量分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg·l-1的磷标准液。室温15℃以上，放置30min。在波长700nm处测定溶液吸光值，以吸光度为纵坐标，磷浓度(mg·l-1)为横坐标，绘制标准曲线。显色与比色：将样品(离心后去除菌体的nbrip培养液)1ml转移至25ml容量瓶中，用水稀释至约15ml，加入二硝基酚指示剂2-3滴，并用4n的氢氧化钠溶液调解至溶液呈微黄色，准确加入2.5ml钼锑抗显色剂，摇匀，加水定容，室温15℃以上，放置30min。比色测定过程于磷标液测定过程相同，从标准曲线上计算出相应磷含量。结果表明菌株解p能力为64.21mg/l。
9)菌株鉴定：
通过16srna序列分析法鉴定菌种，pcr扩增采用16srna通用引物：
27f：5’-agagtttgatcctggctcag-3’；
1429r：5’-ggttaccttgttacgactt-3’；
pcr反应体系(25ul)：mix12.5ul、引物f1ul、引物r1ul、基因组dna2ul、无菌水8.5ul。反应条件94℃预变性5min，94℃变形15s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，72℃充分延伸10min。扩增产物送南京金唯智生物技术有限公司测序。测序结果经ncbi网站上blast进行碱基序列比对，比对结果与节杆菌亲缘关系最近。通过一系列生理生化反应，观察到菌落在培养基上生长良好，单个菌落圆形，湿润，边缘整齐，白色，不透明，革兰氏阳性，无芽孢，无鞭毛。生物学实验中淀粉水解，vp实验，h2s产生实验，接触酶反应均呈阳性反应，但不能利用柠檬酸盐，脲酶活性及甲基红反应为阴性，综合鉴定菌株为节杆菌属。
表1节杆菌pgp41耐镉性测定
表2节杆菌pgp41的植物促生特性研究
实施例2液体制剂
将节杆菌pgp41接入lb培养基活化18-20h，按接种量5-10％(v/v)接入lb培养基30℃，150-200rmp/min摇床培养20h-24h为发酵种子液，液体种子lb培养基：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph＝7.0。
发酵罐发酵：
发酵罐培养基配方：胰蛋白胨5-10％，酵母提取物5-10％，氯化钠5-10％，其余为水，ph值消毒前7.0-7.8，消毒后ph6.8-7.5所述培养基配方成分的百分比含量均为重量百分比；将上一步得到的种子液以待接种培养基体积百分比5％-10％的接种量接种到发酵罐，通入无菌空气和搅拌，在28-35℃条件下培养24-36h，通气量1-2vols/vol·min，搅拌转速200-300rpm，发酵完成后的发酵液即为微生物液体菌液制剂。
本实施例只是一种建议的生物修复制剂制备方法，实际上本发明生物修复制剂可通过常规的微生物发酵培养方法制备得到，只要培养液中菌体数量达到2亿/ml以上即可，经测定发酵液中菌体数量为7.3亿/ml。
实施例3固体制剂
将实施例所得的培养液采用离心机，8000rpm离心15-20min，获得pgp41纯菌体，其中加入保护剂(蔗糖4.51mg/g、海藻糖0.9mg/g、葡萄糖9.6mg/g的方式比例)，采用冷冻干燥的方法即可制成固体菌剂原粉。每升发酵液可制备pgp41菌体固体菌粉1.9951g。经检测，该固体生物修复制剂中测定有效活菌数为3.329×1011个/g。
实施例4接种节杆菌pgp41后超积累植物龙葵、美洲商陆生长及萃取土壤中的重金属情况
通过在南京栖霞山铅锌矿采集重金属复合污染农田土壤，风干磨碎过筛后，装入塑料盆钵，每盆0.6kg，加水使其含水量为田间持水量的60％，保持2天，龙葵种子用0.5％的次氯酸钠消毒20-30min，美洲商陆种子用浓硫酸破壁10-20分钟后，均匀撒在灭菌蛭石上，待种子露白后可浇hogland营养液，待长至四叶一心时，移苗至原位污染土壤中，每盆播入2株苗。接种含节杆菌pgp41的液体生物制剂30-50ml/kg土壤，分1-2次接种，对照接等量无菌水。植株生长期间每天以称重法加入去离子水，保持土壤湿度为田间持水量的60％，种植20天收苗。将盆钵内植株小心取出，并收集根际土壤，将植株用清水冲洗三遍，用去离子水冲洗三遍已去除植物表明残留的土壤杂质，小心擦干植株表面水分，用剪刀将其地上部地下部相连部位剪断，用带刻度直尺测量其长度并称重，记录数值。植株在105℃下杀青30min，80℃烘干至恒重后称其地上部及根系干重。同时收集植物表面根际土壤，35℃烘干至恒重。
植物重金属含量测定：烘干的植物样品用玛瑙研钵磨碎混匀，称取植物干样0.2000g置于消煮管中，用hno3–hclo4(v：v＝87：13)混合液消煮，icp测定pb、zn、cd含量。
土壤有效态的测定：用ph为4.8的1mol/l的乙酸铵溶液提取有效态重金属。具体为取4g过20目筛的风干土样于100ml锥形瓶中，加入20ml的乙酸铵溶液，在水平摇床上以150rpm/min的速度震荡15min，然后静置10min，用双层定量滤纸过滤，取5ml滤液加入5ml5％的硝酸，混匀。用icp-oes来测定提取液中重金属zn、pb、和cd的含量。
实验结果表明，龙葵接菌pgp41(+pgp41)后与对照(ck)相比，地上部的株高与地下部的根长均呈明显的增加，且地上部与地下部的生物量均有明显的提高，表明pgp41能够促进超积累植物龙葵的生长；美洲商陆接菌以后也呈现了相同的趋势，而且植物促生作用更为明显(详见表3)，因此，菌株pgp41对龙葵和美洲商陆有明显的促生作用。两种植物在接菌后发现与对照相比对重金属铅、锌、镉的提取效果明显增强。但是单位质量的铅和锌的提取效果有下降趋势，表明接入菌株pgp41后提取铅和锌重金属效果增加，而两种超积累植物的促生作用强烈，所以会导致单位提取重金属效果减弱，但总提取量增加，表明菌株pgp41能够促进超积累植物龙葵和美洲商陆萃取复合污染土壤中的重金属，对重金属污染的修复有重大意义(详见表4、5)。同时土壤有效态的结果表明(表6)，接菌pgp41后龙葵根际土壤zn、pb、和cd的有效态都有明显的提高，美洲商陆在接菌后土壤的zn、pb、和cd有效态都有所下降，这是因为美洲商陆根际提取了更多的重金属，导致有效态有所下降，这些都表明菌株pgp41对超积累植物龙葵和美洲商陆有很强的促生作用，同时能强化超积累植物龙葵、美洲商陆萃取污染土壤重金属。
表3龙葵、美洲商陆接菌pgp41后生物量的变化
其中“ck”表示未接菌，“pgp41”表示接菌pgp41，下同。
表4龙葵、美洲商陆接菌pgp41后提取重金属的情况
表5龙葵、美洲商陆接菌pgp41后单位重金属提取量
表6龙葵、美洲商陆接菌pgp41后根际土壤有效态
附件1节杆菌pgp41的测序结果
cccacaaggggttaggccaccggcttcgggtgttaccaactttcgtgacttgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcagcgttgctgatctgcgattactagcgactccgacttcatggggtcgagttgcagaccccaatccgaactgagaccggctttttgggattagctccacctcacagtatcgcaaccctttgtaccggccattgtagcatgcgtgaagcccaagacataaggggcatgatgatttgacgtcgtccccaccttcctccgagttgaccccggcagtctcctatgagtccccaccatcacgtgctggcaacatagaacgagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgacacgagctgacgacaaccatgcaccacctgtaaaccgaccgcaagcggggcacctgtctccaggcgtttccggttcatgtcaagccttggtaaggttcttcgcgttgcatcgaattaatccgcatgctccgccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagttttagccttgcggccgtactccccaggcggggcacttaatgcgttagctacggcgcggaaaacgtggaatgtcccccacacctagtgcccaacgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctccccatgctttcgctcctcagcgtcagttaatgcccagagacctgccttcgccatcggtgttcctcctgatatctgcgcatttcaccgctacaccaggaattccagtctcccctacatcactctagtctgcccgtacccaccgcagatccggagttgagccccggactttcacggcagacgcgacaaaccgcctacgagctctttacgcccaataattccggataacgcttgcgccctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccggcgcttcttctgcaggtaccgtcactttcgcttcttccctactgaaagaggtttacaacccgaaggccgtcatccctcacgcggcgtcgctgcatcaggcttgcgcccattgtgcaatattccccactgctgcctcccgtaggagtctgggccgtgtctcagtcccagtgtggccggtcaccctctcaggccggctacccgtcgtcgccttggtaagccattacctcaccaacaagctgataggccgcgagtccatccaaaaccacaaaaagctttccaccccccaccatgcgatgaggagtcatatccggtattagacccagtttcccaggcttatcccagagttaagggcaggttactcacgtgttactcacccgttcgccactaatcccccagcaagctgggatcatcgttcga
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110>南京农业大学
<120>一种促进超积累植物生长及强化萃取土壤重金属的生物修复试剂及修复方法
<130>xhx2018022201
<141>2018-02-22
<160>3
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>20
<212>dna
<213>arthrobactersp.
<400>1
agagtttgatcctggctcag20
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>arthrobactersp.
<400>2
ggttaccttgttacgactt19
<210>3
<211>1375
<212>dna
<213>arthrobactersp.
<400>3
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