本发明涉及一种水蛭胞体外培养方法，属于生物工程领域。
背景技术：
随着生命科学的迅速发展，不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个必不可少的过程，并推动着细胞生物学、分子生物学、生物化学等领域的发展。
水蛭（whitmaniapigrawhitman）属于环节动物门蛭纲水蛭科，据统计，分布在全世界的蛭类动物共有600多种，分布在我国的也有近100种。水蛭属冷血环节动物，在中国南北方均可生长繁殖，它主要生活在淡水中的水库、沟渠、水田、湖沼中，以有机质丰富的池塘或无污染的小河中最多。生长适温为10-40℃，北方地区低于3℃时在泥土中进入蛰伏冬眠期，次年3-4月份高于8℃左右出蜇活动。水蛭为杂食性动物，以吸食动物的血液或体液为主要生活方式，常以水中浮游生物、昆虫、软体动物为主饵，人工条件下以各种动物内脏、熟蛋黄、配合饲料、植物残渣，淡水螺贝类、杂鱼类、蚯蚓等作饵。
研究发现，水蛭唾液腺分泌物中含有水蛭素等多种生物活性物质并且在医药上具有广阔应用前景。水蛭素、水蛭透明质酸酶、安替斯塔辛、麻醉剂、血管扩张剂、前列腺素等，具有降血脂、保护心脑血管、抗凝血和抗肿瘤等功效，具有重要的研究意义。因此，临床上对天然水蛭素需求很大。现有的水蛭素提取主要是生物工程手段重组合成和刺激水蛭唾液腺分泌水蛭素，这两种方法不仅成本高而且所得到的水蛭素产量也极低。随着细胞体外培养技术的发展，通过体外培养水蛭细胞获得水蛭素成为一项热门的研究课题，研究发现从这种方法中获得的水蛭素不仅产量高同时其效果可以与刺激水蛭唾液腺分泌所得的水蛭素相媲美。但是，目前水蛭细胞体外培养技术还处于萌芽阶段，其培养基的选择、培养条件的确定、抗生素的选择等等都是急需攻克的难题。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种水蛭细胞体外培养方法。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种水蛭细胞体外培养基，其特征在于，所述培养基配方如下：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；ph用1.0nkoh调节至7.4。
一种水蛭细胞体外培养方法，将剪碎后的水蛭组织块接种于细胞封闭培养瓶中，加入上述insect-cculture昆虫细胞培养基，细胞培养箱中静置培养，再配合组织块回收法进行分离培养，最后通过胰酶消化法获得纯化的水蛭体细胞进一步培养。具体步骤如下
1）取水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；
2）将步骤1）中进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有无菌pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；
3）将步骤2）中的头部组织转移到另一个装有pbs缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；将头部组织用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用无菌pbs缓冲液冲洗；
4）将步骤3）中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用无菌pbs缓冲液漂洗，重复三次；
5）将步骤4）中的组织置于盛放有无菌pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；
6）将步骤5）中的细小组织块弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5ml枪头吸取组织块糊状物，将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布于25ml的细胞封闭培养瓶中，加入5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置贴壁培养60min。
7）将步骤6）静置贴壁培养60min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基，覆没组织块，继续原代培养，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；原代培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。
8）将步骤7）得到的细胞弃去培养液，经无菌pbs清洗后，加入2ml胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，待成纤维细胞收缩变圆浮起，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即加入5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4mlpbs液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2ml消化液，消化3min后，弃去1ml消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞。
9）将步骤8得到的细胞得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d。
本发明所使用的培养基insect-cculture昆虫细胞培养基配方为：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；
ph用1.0nkoh调节至7.4,使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本发明所用无菌pbs缓冲液内加入青霉素的含量为600u/ml，链霉素的含量为600u/ml，两性霉素b的含量为15μg/ml；剪碎后组织块的大小为1mm3。
本发明所使用含抗生素insect-cculture昆虫细胞培养基另加入青霉素的含量为600u/ml，链霉素的含量为600u/ml，两性霉素b的含量为15μg/ml，灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本发明的有益效果为：本发明所提供的一种水蛭细胞原代培养的细胞体外培养方法，同时提供了一种优化后的昆虫细胞培养基，与其他昆虫细胞培养基相比更加快速成功的获得水蛭纯化体细胞，为进一步进行水蛭细胞体外传代培养做准备，并且建设一套体外原代培养水蛭细胞体系。本发明为以后的水蛭细胞体外培养提供了精确可靠的实验依据。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然后，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体物料比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应该也不会限制本发明。
以下实施例中所采用的水蛭来源于：日本医蛭。
实施例1
本发明所提供的一种水蛭活体生长周期选择方法，具体步骤如下
步骤一：分别取1、2、3年生水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；
步骤二：将步骤一中分别进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有无菌pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；
步骤三：将步骤二中的头部组织转移到另一个装有pbs缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；
步骤四：将步骤三中的头部组织分别用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用无菌pbs缓冲液冲洗；
步骤五：将步骤四中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用无菌pbs缓冲液漂洗，重复三次；
步骤六：将步骤五中的组织置于盛放有无菌pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；
步骤七：将步骤六中的细小组织块弃掉漂浮在上部的组织碎屑，分别用5ml枪头吸取组织块糊状物，将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布于25ml的细胞封闭培养瓶中，加入5mlinsect-cculture含抗生素昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置培养60min。
步骤八：将步骤七静置贴壁培养60min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入5mlinsect-cculture含抗生素昆虫细胞培养基，覆没组织块，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；原代培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。
步骤九：将步骤八得到的细胞各自弃去培养液，经无菌pbs清洗后，加入2ml胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即加入5ml含抗生素insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4mlpbs液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2ml消化液，消化3min后，弃去1ml消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入6ml含抗生素insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞。
步骤十：将步骤九得到的细胞得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d后，继续转接于另一含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，重复上一操作。
本发明所使用的培养基insect-cculture昆虫细胞培养基配方为：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，
kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；
ph用1.0nkoh调节至7.4,使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本发明所用无菌pbs缓冲液内加入青霉素的含量为600u/ml，链霉素的含量为600u/ml，两性霉素b的含量为15μg/ml；剪碎后组织块的大小为1mm3。
本发明所使用含抗生素insect-cculture昆虫细胞培养基另加入青霉素的含量为600u/ml，链霉素的含量为600u/ml，两性霉素b的含量为15μg/ml，灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本实施例表明选择2年生样本在进行原代培养10h后可以获得游离细胞，并且随后进行的传代培养细胞贴壁生长，1、3年生样本在原代培养15h后没有出现游离细胞。本发明可以为选择水蛭活体时作为精准的依据。
实施例2
本发明所提供的一种水蛭细胞原代培养优化后的昆虫细胞培养基，具体步骤如下
步骤一：取水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；
步骤二：将步骤一中进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有600u/ml不同种类抗生素的pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；
步骤三：将步骤二中的头部组织转移到另一个装有pbs缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；
步骤四：将步骤三中的头部组织用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用无菌pbs缓冲液冲洗；
步骤五：将步骤四中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用有600u/ml不同种类抗生素的pbs缓冲液漂洗，重复三次；
步骤六：将步骤五中的组织置于盛放有600u/ml不同种类抗生素的pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；
步骤七：将步骤六中的细小组织块弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5ml枪头吸取组织块糊状物，将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布于25ml的细胞封闭培养瓶中，加入5ml含600u/ml不同种类抗生素的insect-cculture昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置培养60min。
步骤八：将步骤七静置贴壁培养60min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入加入5ml含600u/ml不同种类抗生素的insect-cculture、sfx-insect、mgm-450昆虫细胞培养基，覆没组织块，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液，并观察细胞生长状况。
步骤九：将步骤八得到的细胞弃去培养液，经无菌pbs清洗后，加入2ml胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即分别加入5ml含600u/ml不同种类抗生素的insect-cculture、sfx-insect、mgm-450昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4mlpbs液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2ml消化液，消化3min后，弃去1ml消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再分别加入5ml含600u/ml不同种类抗生素的insect-cculture、sfx-insect、mgm-450昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞。
步骤十：将步骤九得到的细胞得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d后，继续转接于另一含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，重复上一操作。
本发明所使用的培养基insect-cculture昆虫细胞培养基配方为：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，
kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；
ph用1.0nkoh调节至7.4，使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本实例表明在含有600u/ml三抗混合液的insect-cculture昆虫细胞培养基原代培养第11h，组织块周缘游离出少量细胞，形态为圆形，透明；培养基没有出现污染情况，细胞存活时间长，并且随后的传代培养实验中细胞大量贴壁生长；sfx-insect昆虫细胞培养基原代培养第15h后，显微镜下观察培养液依旧澄清，细胞暂无生长迹象；mgm-450昆虫细胞培养基原代培养第15h后，显微镜下观察培养液污染呈淡黄色并且内有黑点出现，组织周围无游离细胞出现，细胞暂生长迹象。所以本发明优化改良的insect-cculture昆虫细胞培养基可以作为水蛭细胞培养所需的培养基。
实施例3
本发明所提供的抗生素种类选择，具体步骤如下
步骤一：取水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；
步骤二：将步骤一中进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；
步骤三：将步骤二中的头部组织转移到另一个装有不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；
步骤四：将步骤三中的头部组织用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液冲洗；
步骤五：将步骤四中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液漂洗，重复三次；
步骤六：将步骤五中的组织置于盛放有不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；
步骤七：将步骤六中的细小组织块弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5ml枪头吸取组织块糊状物，将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布于25ml的细胞封闭培养瓶中，加入5ml含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置培养60min。
步骤八：将步骤七静置贴壁培养60min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入5ml含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基，覆没组织块，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；原代培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。
步骤九：将步骤八得到的细胞弃去培养液，经含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs清洗后，加入2ml胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即加入5ml含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4ml含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2ml消化液，消化2-3.5min后，弃去1ml消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入5ml含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞。
步骤十：将步骤九得到的细胞得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含不同种类抗生素（青霉素、链霉素和两性霉素b）5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d后，继续转接于另一含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，重复上一操作。
本发明所使用的培养基insect-cculture昆虫细胞培养基配方为：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，
kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；
ph用1.0nkoh调节至7.4,使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本实例表明在同一类型培养基中抗生素浓度为600u/ml时，只有在同时含有青霉素、链霉素和两性霉素b存在的情况下，原代培养时组织周围细胞生长并且有游离细胞出现，培养液无污染，并且在传代培养中细胞大量贴壁，生长状况良好；单独的青霉素、链霉素和两性霉素b或者两两组合皆会出现污染现象。
实施例4本发明所提供的抗生素浓度选择，具体步骤如下
步骤一：取水蛭活体在生理盐水中浸泡1h，初步去除体内杂质并最大限度保证其体细胞活力，再用生理盐水清洗其表面粘膜至干净，最后用蒸馏水清洗三遍后置于70%的酒精中浸泡5min，去除体表细菌，用蒸馏水重复多次冲洗去酒精；
步骤二：将步骤一中进行表皮消毒处理后的水蛭转移至超清工作台内，并将其放入盛放有不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪去蛭体两端取头部组织；
步骤三：将步骤二中的头部组织转移到另一个装有不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液的无菌培养皿内，浸过蛭体；
步骤四：将步骤三中的头部组织用无菌手术刀剖开头部组织，并在取表皮中间的组织后用不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液冲洗；
步骤五：将步骤四中的组织置于75%的酒精内浸泡1min后，取出后用不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs缓冲液漂洗，重复三次；
步骤六：将步骤五中的组织置于盛放有不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs的无菌培养皿内，用无菌剪刀和镊子剪碎成小组织块，并浸泡5min；
步骤七：将步骤六中的细小组织块弃掉漂浮在上部的组织碎屑，用5ml枪头吸取组织块糊状物，将吸取的糊状组织，铺于瓶底，大小一致，均匀分布于25ml的细胞封闭培养瓶中，加入5ml不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基，25℃细胞培养箱中静置培养60min。
步骤八：将步骤七静置贴壁培养60min后的培养瓶，用吸管吸除瓶底多余液体，使用移液枪在瓶口缓慢加入5ml含不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基，覆没组织块，培养液颜色变深时及时更换新鲜培养液；原代培养6-12h后，待细胞将要铺满瓶底时，移除组织块，并将移除的组织块重新接种于新的培养瓶中，于培养箱中培养并及时更换新鲜培养液。
步骤九：将步骤八得到的细胞弃去培养液，经不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs清洗后，加入2ml胰酶消化液，消化50s，轻轻晃动培养瓶，显微镜下观察，水蛭体细胞已有收缩但未浮起时，立即加入5ml含不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，轻轻晃动后弃去培养液，加入4ml不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）pbs液，轻轻洗除残余的成纤维细胞后，加入2ml消化液，消化2-3.5min后，弃去1ml消化液，从底部拍打瓶底使细胞完全脱落，再加入5ml含不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）insect-cculture昆虫细胞培养基终止消化，反复吹打细胞，使细胞团分散成单个细胞。
步骤十：将步骤九得到的细胞得到的细胞用八层纱布过滤后接种于含不同浓度三抗混合液（青霉素、链霉素和两性霉素b）5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，培养温度25℃，培养时间3d后，继续转接于另一含5mlinsect-cculture昆虫细胞培养基的25ml培养瓶内，重复上一操作。
本发明所使用的培养基insect-cculture昆虫细胞培养基配方为：
无机盐：
nacl1420mg/l，zncl2876.54mg/l，mgso4·7h2o1743.48mg/l，
kcl2080mg/l，kh2po4·2h2o1000mg/l；
氨基酸：
dl-丝氨酸9000mg/l，甘氨酸620mg/l，l-精氨酸盐酸盐700mg/l，l-天冬酰胺400mg/l，l-天冬氨酸350mg/l，l-半胱氨酸二盐酸盐160mg/l，l-谷氨酸3500mg/l，l-组氨酸盐酸盐2000mg/l，l-异亮氨酸200mg/l，l-亮氨酸150mg/l，l-赖氨酸盐酸盐850mg/l，l-甲硫氨酸100mg/l，l-苯丙氨酸100mg/l，l-脯氨酸500mg/l，l-苏氨酸200mg/l，l-色氨酸150mg/l，l-酪氨酸磷酸氢二钠580mg/l，l-缬氨酸200mg/l，ß-丙氨酸400mg/l，l-丙氨酸225mg/l；
维生素：
d-生物素0.15mg/l，d-泛酸钙0.15mg/l，叶酸盐0.15mg/l，氰钴胺0.10mg/l，烟酸0.15mg/l，盐酸吡哆胺0.15mg/l，核黄素0.15mg/l，硫胺素0.10mg/l，对氨基苯甲酸0.15mg/l；
其它：
蔗糖2000mg/l，d-葡萄糖1500mg/l，d-果糖500mg/l，麦芽糖600mg/l，α-酮戊二酸330mg/l，富马酸90mg/l，琥珀酸90mg/l，l-苹果酸90mg/l；
ph用1.0nkoh调节至7.4,使用前加入灭活的15%的昆虫专用特级胎牛血清。
本实例表明在同一类型培养基中青霉素的含量为600u/ml，链霉素的含量为600u/ml，两性霉素b的含量为15μg/ml时，细胞生长状况最好，且不会出现污染现象同时细胞存活时间长；青霉素的含量为200u/ml，链霉素的含量为200u/ml，两性霉素b的含量为5μg/ml时，原代培养10h后培养液出现浑浊现象，组织周围为细胞游离，细胞不生长；青霉素的含量为400u/ml，链霉素的含量为400u/ml，两性霉素b的含量为5μg/ml时，原代培养15h后培养液呈淡黄色，并且组织周围有黑色颗粒状物质，无细胞游离，细胞不生长；青霉素的含量为800u/ml，链霉素的含量为800u/ml，两性霉素b的含量为20μg/ml时，原代培养15h后培养液澄清，并且组织周围无细胞游离，细胞不生长；培养20h后培养液澄清，并且组织周围无细胞游离，细胞不生长。