本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌肠膜亚种、其制备方法和应用。
背景技术：
明串珠菌是乳酸菌的一个属，是一类异型乳酸发酵的革兰氏阳性细菌，存在于植物的表面和根部，是乳或植物材料的自然发酵食品中的优势细菌。发酵能够代谢产生有机酸、醇类和双乙酰等多种芳香化合物，提高产品风味；生成葡聚糖可以作为血液增稠剂、舒展剂和稳定剂；生成甘露醇可作为低热量甜味剂；产生细菌素可作为生物防腐剂；生成低聚糖可维持人体肠道正常菌群的生态平衡，具有益生效果，明串珠菌有望成为新的微生态制剂。
肠膜明串珠菌是明串珠菌属的重要菌种，是一类无芽孢革兰氏染色阳性细菌的总称，肠膜明串珠菌对人和动物均无毒性和致病作用，尤其是肠膜明串珠菌肠膜亚种已被我国卫生部(2012年第8号公告)与美国食品药品监督管理局(fda)列为可食用菌种之一。肠膜明串珠菌肠膜亚种具有调节肠道菌群平衡，促进营养物质吸，改善产品风味，同时也具有抗氧化能力和拮抗致病菌能力。因其能够产生特殊风味物质，在乳和泡菜等食品领域广泛应用。
泡菜是一种有着悠久历史的传统食品，目前世界上流行的泡菜按产地及口味主要分为中国泡菜、韩国泡菜和日本泡菜，日本泡菜属于非发酵型，中国泡菜和韩国泡菜是发酵型。朝鲜族泡菜是极具民族特色的中国泡菜之一，品种繁多，选料广泛，依原料、制法、用法和时间的不同，口味各异，具有独特浓厚的风味且富含乳酸菌活性和乳酸。樱菜是朝鲜族人种植的特色蔬菜，生长期短且具有季节性，营养丰富，味道适合大众口味。目前从河南林州泡菜、四川泡菜、辣白菜中分离出明串珠菌属的居多，但在朝鲜族传统发酵樱菜中尚未发现分离肠膜明串珠菌。同种微生物因菌源、分离和培养方法不同，其特性及功能性存在一定差异。在传统的发酵食品中，如泡菜，其在发酵过程中由于乳酸菌的生长缓慢或降解亚硝酸盐的能力较弱导致某些发酵食品中生成许多杂菌影响了泡菜的保质期，且泡菜中会生产生亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种对人体非常有害的物质，过多或长期食用容易致癌。因此需要一种能够解决此类问题的菌。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种肠膜明串珠菌肠膜亚种及其制备方法和应用，该肠膜明串珠菌肠膜亚种具有高产酸能力和降解亚硝酸盐能力，且耐盐和耐酸碱，通过该肠膜明串珠菌肠膜亚种能够在泡菜的发酵中降解亚硝酸盐，且高产酸能力能够抑制有害菌的繁殖，延长泡菜的保质期。
为实现上述目的，本发明提出第一方面的技术方案：一种肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)，其保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：cctccno：m2018129。
从吉林延边朝鲜族的樱菜泡菜中分离而得，获得所述的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)。对该菌株进行鉴定，结果为肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)。该菌株已于2018年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉武汉大学），并收到保藏中心登记入册，编号cctccno：m2018129，并于2018年3月28日确定检测结果为存活。
本发明提出第二方面的技术方案：一种肠膜明串珠菌肠膜亚种肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129的制备方法，包括以下的步骤：以泡菜为菌源，优选地，泡菜为樱菜。在有氧条件下培养基中培养肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129。
本发明的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129即可。优选地，培养基包括mrs液体培养基、lmm固体培养基和在含万古霉素的mrs固体培养基，优选地，万古霉素浓度为30ug/ml。采用该浓度的万古霉素时既能够保证获得最佳的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129，而且其他菌在这个浓度无法生长，更有利于获得纯种的肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003。具体的培养分离步骤依次为，首先，在mrs液体培养基中增殖培养肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129，其次，在lmm固体培养基上分离培养肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129，再次，在含万古霉素的mrs固体培养基中分离纯化培养肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129，其中，在固体培养基上分离培养采用平板划线法。
所述培养的温度为本领域常规的温度和常规时间，以能够生长肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129，优选地，在mrs液体培养基中培养温度为25～36℃，培养时间为24～72h，进一步地，在mrs液体培养基中培养温度为30℃，培养条件为120-160r/min恒温震荡培养24～72h。最佳的，在mrs液体培养基中培养温度为30℃，培养条件为140r/min恒温震荡培养48h，该条件下能够获得性能更加优异的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129。
优选地，所述在lmm固体培养基中和在含万古霉素的mrs固体培养基中培养温度为25～36℃，培养时间为24～72h，进一步地，在lmm固体培养基中和在含万古霉素的mrs固体培养基中培养温度为30℃，培养条件为倒置恒温静置培养以获得性能最优的肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129。
本发明提出第三方面的技术方案：肠膜明串珠菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cctccno：m2018129在泡菜生产中的应用。
本发明的有益效果是：从朝鲜族传统发酵樱菜中分离的肠膜明串珠菌肠膜亚种肠膜亚种具有高产酸能力和降解亚硝酸盐能力，且耐盐和耐酸碱。能提高产品营养品质的同时又能够延长产品贮藏期，开发了乳酸菌资源。有利于泡菜产业的发展，具有广阔的市场前景。
附图说明
图1是本发明的菌株jnjb003在lmm培养基上分离的菌落形态图；
图2是本发明的菌株jnjb003在mrs培养基上纯化的菌落形态图；
图3是部分菌株革兰氏染色镜检照片；
图4是图3中的菌株经过过氧化氢酶实验后的菌株形态图；
图5a是菌株在37℃条件下生长试验鉴定图片；
图5b是菌株在含有30μg/ml万古霉素的培养基中生长试验鉴定图片；
图5c是菌株的耐盐试验鉴定图片；
图5d是菌株的精氨酸水解试验鉴定图片；
图5e是菌株的七叶甘水解试验鉴定图片；
图5f是菌株的柠檬酸代谢试验鉴定图片；
图5g是菌株的葡聚糖生成鉴定图片；
图5h是菌株的碳水化合物发酵试验鉴定图片；
图6是筛选出的株菌pcr扩增产物结果图；
图7是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003在不同温度下生长条形图；
图8是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003在不同盐浓度条件下生长的条形图；
图9是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003的od值随培养时间变化曲线图；
图10是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003随时间变化产酸的曲线图；
图11是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003在不同ph值下光密度生长的曲线图；
图12是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003对不同浓度亚硝酸盐降解能力的曲线图；
图13是肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003降解亚硝酸盐能力鉴定试验图片。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明的对照菌株选为肠膜明串珠菌菌株(bncc195309)，通过该菌株的对比以获得肠膜明串珠菌菌株，该菌株(bncc195309)购自于北纳创联生物技术有限公司；mrs固体培养基、mrs液体培养基、1％万古霉素购自于青岛高科园海博生物技术有限公司；扁桃苷、熊果糖、水杨甘、赤藓醇购自于macklin；甘露糖购自于merck；l-鼠里糖购自于上海试剂二厂；半乳糖、山梨醇、纤维二糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、果糖、l-阿拉伯糖、海藻糖、d-木糖，棉子糖、l-山梨糖、密二糖购自于sigma；ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒，sanprep柱式dna胶回收试剂盒购自于生工生物工程(上海)股份有限公司。
本发明的仪器和设备：presoclave-ⅱ高压灭菌器西班牙selecta；2720thermalcyclerpcr仪appliedbiosystems；hc-2518r冷冻高速离心机bbi；cx41-rf荧光显微镜日本olympus。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明制备方法中未提及的方法均为常规的方法。
实施例1、菌株jnjb003的分离与纯化
菌种来源：分别取自延边朝鲜族自治州金刚山泡菜专卖店、农贸市场和超市的传统发酵樱菜，采用分离、纯化方法，筛选出单一的肠膜明串珠菌菌株，具体方法为：无菌条件下，取延边朝鲜族传统发酵樱菜汁1ml，置于灭菌的试管中，采用平板划线法在含有lmm固体培养基的培养皿中划线，划线结束后将培养皿倒置，在30℃、有氧条件下，恒温培养48h。从含有lmm固体培养基的培养皿中挑取周围产生水滴状粘稠性多糖的菌落，在含有30ug/ml万古霉素的mrs固体培养基的培养皿中划线分离纯化3次，挑取单个菌落，经过镜检，并与肠膜明串珠菌菌株(bncc195309)对比，确认获得单一的纯培养物，命名为jnjb003，如图1和2所示。
实施例2、菌株jnjb003的鉴定
一、菌株jnjb003的初步鉴定
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别方法，过氧化氢酶实验是鉴定革兰氏阳性菌的重要实验，来进一步鉴定菌株，对从朝鲜族传统发酵樱菜中分离纯化20株疑似明串珠菌的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，如图3所示，部分菌株革兰氏染色镜检照片，其中，a为菌株jnzb003；b为菌株jnzb005；c为菌株jnzb011，d为jnzb020。如图4所示，过氧化氢酶试验照片。经镜检20株菌为革兰氏染色阳性，17株过氧化氢酶阴性，将17株过氧化氢酶阴性菌进一步鉴定。
二、菌株jnjb003的生理生化鉴定
菌株的生理特性鉴定
将筛选的17株菌株进行了生理特性鉴定，其中包括37℃生长试验、1℃生长试验、过氧化氢酶试验、耐万古霉素试验、3％氯化钠生长试验和6.5％氯化钠生长试验，鉴定结果见表1。从表1中可以看出，所筛选的17株菌株均对30ug/ml万古霉素具有耐受性，且可以在3％氯化钠和6.5％氯化钠溶液中生长，但每个菌株间的生长程度表现有很大差异，jnzb003、jnzb009、jnzb011、jnzb012、jnzb015和nzb019这6株菌在3％氯化钠和6.5％氯化钠溶液中生长良好且程度接近，jnzb005和jnzb017在3％氯化钠生长良好，但在6.5％氯化钠溶液中微弱生长；17株菌株在1℃下均不生长，37℃下11株菌株生长，6株菌株不生长。
其中，对30ug/ml万古霉素的耐受性试验方法如下：
(1)取活化的培养物，在含有30ug/ml万古霉素mrs固体培养基上划线，37℃培养24-72h，若生长，将生长的菌落再重复一次接种、培养，若仍有菌落，表示37℃能生长。
(2)取活化的培养物，在含有30ug/ml万古霉素mrs固体培养基上划线，1℃培养48h，若生长，将生长的菌落再重复一次接种、培养，若仍有菌落，表示1℃能生长。
耐盐性试验方法如下：
在含有30ug/ml万古霉素的固体培养基上挑取菌落，接入含3.0％和6.5％nacl的mrs液体培养基中，30℃下培养24h后，摇匀，测定其od600值，以mrs液体培养基为空白对照。
过氧化氢酶试验方法如下：
在灭菌、干净的载玻片上，滴上3％的过氧化氢，挑取mrs固体培养基上的菌落，与3％的过氧化氢混匀，若有气泡表示阳性反应，无气泡表示阴性反应。
表1菌株生理特性鉴定结果
“+”代表生长；“-”代表不生长
菌株jnjb003的生化鉴定结果
在上述生理特性鉴定的基础上，对筛选的17株菌株进行基础生化鉴定，具体包括精氨酸水解试验、柠檬酸利用试验、葡聚糖生成试验、七叶苷水解试验，鉴定结果见表2。从表2中可以看出，17株菌精氨酸水解试验均为阳性反应，这与《伯杰氏细菌鉴定手册》中描述的明串珠菌属的特性不一致；筛选的17株菌种中7株能够代谢柠檬酸，10株不能代谢柠檬酸；6株能水解七叶苷，11株不能水解七叶苷；3株能够利用蔗糖产生葡聚糖。在明串珠菌属中只有肠膜明串珠菌肠膜亚种能够利用蔗糖产生葡聚糖，在培养基上形成粘稠状菌苔，其它种不具备此特征，根据这一特性对照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，结合生理特性鉴定，将菌株jnzb003、jnzb005、jnzb009、jnzb011、jnzb015和jnzb018这6株菌进一步做碳水化合物发酵试验和16srdna分子鉴定。
6株菌都可以利用纤维二糖、蜜二糖、蔗糖、果糖、l-阿拉伯糖、熊果糖、海藻糖、甘露糖、d-木糖、水杨苷、扁桃苷；6株菌都不能利用赤藓醇、山梨醇、l-山梨糖和l-鼠李糖；此外菌株jnzb003可以利用半乳糖、麦芽糖和核糖，结果见表3。根据《伯杰氏细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》中对明串珠菌属的描述，再结合形态学特征、生理特性鉴定、基础生化鉴定和碳水化合物发酵鉴定。初步判断菌株jnzb003是肠膜明串珠菌肠膜亚种，jnzb005、jnzb009和jnzb011是冷明串珠菌，jnzb015和jnzb018是肉明串珠菌。
其中，精氨酸水解试验方法如下：
取活化的培养物，接种到精氨酸水解培养基内，上面滴1滴无菌石蜡矿物油，30℃下培养24-72h。若培养基仍是紫色，表示精氨酸被水解，产生碱性物质，阳性反应；若变黄色，表示产酸，阴性反应。
葡聚糖生成试验方法如下：
挑取mrs固体培养基上的菌落，在葡聚糖生成培养基上划线，30℃下培养24-72h。观察菌落，若在菌落周围生成水滴状、粘稠菌苔，表示生成葡聚糖，阳性反应；无水滴状、粘稠菌苔生成为阴性反应。
柠檬酸利用试验方法如下：
取活化的培养物，在柠檬酸利用培养基上划线，30℃下培养24-72h，若形成蓝色菌落，表示具有柠檬酸代谢能力；若不显色，表示不代谢柠檬酸。
七叶苷水解试验方法如下：
取活化的培养物，接种于七叶苷培养基中，30℃下培养72h后，取七叶苷培养液置于比色盘，滴加少许柠檬酸铁，若显黑色表示七叶苷水解，为阳性反应；不显色为阴性反应。以未接种的培养液作对照。
碳水化合物发酵试验方法如下：
取活化的培养物，分别接种于含不同碳水化合物的发酵培养基中，30℃下培养24-72h，培养液变黄，表示碳水化合物被代谢产酸，为阳性反应；否则为阴性反应。
表2菌株基础生化特性鉴定结果
精氨酸水解：“+”代表精氨酸被水解，显紫色为阳性反应；“-”代表不水解精氨酸，显黄色为阴性反应。
柠檬酸利用：“+”代表代谢柠檬酸，形成蓝色菌落；“-”代表不代谢柠檬酸，形成白色菌落。
葡聚糖生成：“+”代表生成粘稠状菌苔；“-”代表不生成粘稠状菌苔。
七叶苷水解：“+”代表七叶苷水解，显黑色为阳性反应；“-”代表不水解七叶苷，不显色为阴性反应。
表3菌株碳水化合物发酵生化鉴定结果
“+”代表利用碳水化合物产酸，显黄色为阳性反应；“-”代表阴性反应。
三、肠膜明串珠菌肠膜亚种16srdna分子鉴定
为了更准确、更有效鉴定菌株jnjb003，在传统生理生化鉴定基础上，采用分子生物学16srdna序列分析技术进行鉴定。用ezup柱式细菌基因组dna抽提试剂盒提取筛选出的6株菌株dna，pcr扩增获得了1400±100bp条带，将pcr扩增产物的条带再进行回收、连到takarapmd*18-tvector载体克隆转化进行蓝白斑筛选、再使用m13+/-引物测序。扩增产物如图6，16srdna基因序列如序列表中序列1所示。
对测序结果在ncbi数据库中的blast程序进行序列同源性比对，比对结果见表4。从表4可以看出，菌株jnzb003与肠膜明串株菌肠膜亚种(leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides)cp020731.1、lc119136.1、lc119132.1、cp015442.1、lc260037.1、lc260035.1和lc260034.1的16srdna基因序列的相似性达到99％，鉴定菌株jnzb003为肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003；并于2018年03月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2018129，并于2018年3月28日确定检测结果为存活。
表4菌株16srdna基因序列比对
实施例3、肠膜明串珠菌肠膜亚种jnzb003的特征
同种微生物因来源不同，在某些特性上存在一定的差异。为了掌握本发明的肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129的特性，将筛选的肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129活化后，以体积比为2％和3％将培养液接种于mrs液体培养基中。
通过在不同温度条件下培养考察菌株最适生长温度，结果见图7，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129生长温度范围很宽，在28℃和30℃均能良好生长，最适生长温度为30℃。
耐盐性，观察不同盐浓度对肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129生长的影响，从图8可以看出，随着盐浓度的增加，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129生长能力逐渐减弱，当盐浓度在4％和6％时,能够良好生长,当盐浓度增加到8％时,肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129生长缓慢,当盐浓度达到10％时,肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129微弱生长。
通过测定菌株在mrs液体培养基中生长过程od600值和ph值动态变化来评价生长状况和产酸能力，从图9可以看出，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129具有良好的生长特性，培养14h后进入稳定期，此时od600值达到1.52；培养48h时，od600值最高，高达1.909，之后od600值开始缓慢降低，进入衰减期；肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129产酸较快，培养12h，ph值降到4.60,培养24h，ph值降到4.16，培养28h，ph值降到4.0左右之后不再降低，详见图10。
观察肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129在不同ph值条件下生长状况，考察肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129的耐酸碱性，结果见图11，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129最适生长ph值为6。当ph值＜4和ph值＞10时，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129生长缓慢；肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129较耐酸碱，当ph值为2和11时，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129也能微弱生长。
筛选肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129对亚硝酸盐降解能力，见图12和13，从中可以看出，随着亚硝酸盐浓度的增加，肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129对亚硝酸盐降解率是先增加再降低。肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129对150ug/ml亚硝酸盐24h的降解率最高，达到95.92％，75ug/ml次之，达到94.18％。
实施例4、肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003在泡菜中的应用
本发明的泡菜可以选择常规的制作方法，泡菜的原料可以选择常规的原材料，并不作为本发明的限制，优选地，泡菜原料为成熟期樱菜，整棵，制作方法可以采用以下步骤。
(1)肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129菌悬液的制备，该制备方法同上述肠膜明串珠菌肠膜亚种分离提纯的方法相同，无菌条件下，取肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129接种于mrs液体培养基中30℃培养48h，得到肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129菌悬液，菌悬液中肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129的含量为118cfu/ml。
其中，mrs液体培养基的溶剂为水，溶质及其浓度如下：蛋白胨10g/l，牛肉膏10g/l，酵母膏5g/l，葡萄糖20g/l，三水合乙酸钠5g/l，吐温801g/l，磷酸氢二钾2g/l，柠檬酸铵2g/l，硫酸镁2g/l，硫酸锰0.25g/l；ph6.8。
(2)将整棵成熟期樱菜用6％盐水浸泡12小时后取出，将樱菜中的水分控出，取500g放入坛子中，将步骤(1)获得的肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129菌悬液每袋300μl加入坛子中，混匀，密封，放入4℃冰柜内发酵以得到传统的樱菜泡菜。
由于肠膜明串珠菌肠膜亚种主要富集在泡菜发酵前期，迅速发酵并产生大量的乳酸，使发酵环境的ph值降低，抑制有害微生物的生长和抑制亚硝酸盐的形成，从而达到长期保存，提高营养品质和保证食用安全目的。且肠膜明串珠菌肠膜亚种jnjb003cctccno：m2018129具有较高的产酸能力和降解亚硝酸盐能力使得泡菜的品质和食用更加健康和安全。
本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。
<110>吉林省农业科学院
<120>肠膜明串珠菌肠膜亚种、制备方法和应用
<160>1
<210>1
<211>1385
<212>dna
<213>肠膜明串珠菌肠膜亚种（leuconostocmesenteroidessubsp.mesenteroides）
<400>1
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