本发明属于免疫学和细胞生物学领域，涉及一种构建特异性靶向肿瘤并杀伤肿瘤的t细胞及其构建方法和用途。
背景技术：
目前有多种方法用来治疗和预防肿瘤，但是肿瘤依然是世界范围内的一个重要死因。传统的针对分裂期细胞的放化疗的方法也会影响正常细胞，对肿瘤患者产生了不可忽略的副作用。免疫治疗是一种可以利用特异性免疫系统对肿瘤进行靶向杀伤同时也不影响正常细胞的治疗方法。过继性细胞回输的被动免疫治疗策略是将体外刺激培养的淋巴细胞过继回输到肿瘤病人治疗肿瘤的方法。过继回输的淋巴细胞能直接杀伤肿瘤，不需要体内免疫系统的激活，从而能克服疫苗治疗中需要体内激活免疫系统发挥作用这一重要限制。目前主要包括两种获得肿瘤特异性细胞的方法：一种是存在于患者肿瘤组织内的浸润性淋巴细胞的体外培养、扩增及肿瘤特异性的筛选；另一种是修饰外周血细胞使其获得肿瘤特异性并在体外迅速扩增。由于获得肿瘤特异性t细胞相对困难，因此可以通过基因修饰的方法获得肿瘤特异性t细胞，使其能特异性杀伤肿瘤。其中，利用基因工程修饰t细胞使其表达嵌合性抗原受体(chimericantigenreceptor,car)，用来特异性识别肿瘤相关性抗原的方法，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。
car主要由胞膜外抗原结合区、铰链区和胞内信号传导区三部分构成。膜外区是一段单链可变区结构域(singlechainfvdomain,scfv)，具有特异性识别并结合肿瘤相关抗原(tumorassociatedantigen,taa)的功能。铰链区通常是由免疫球蛋白超家族组成，胞内信号传导区主要是由cd3复合体中的ζ链组成。近年来的深入研究发现在胞内区的信号传导区加入共刺激分子如cd28或和cd137可以加强细胞的抗肿瘤免疫反应活性，因此出现了二代及三代的car。表达car的细胞可以直接识别并结合肿瘤细胞表面的taa，将信号传入细胞内，激活细胞分泌细胞因子包括穿孔素、颗粒酶、ifn-γ、tnf-α等，从而发挥杀伤肿瘤细胞作用。因此car-t将抗体-抗原特异性结合能力及t细胞杀伤功能集于一身。除此之外，car还有其他优势，比如car识别的抗原不需要apc进行加工和提呈；car不仅可以识别短的抗原肽，还可以识别碳水化合物和糖脂类非蛋白抗原；高亲和力的scfv可以使得t细胞对低浓度的抗原依然敏感，临床应用案例已取得令人振奋的结果。
目前，许多关于car-t细胞治疗肿瘤的早期临床试验正在进行，也有一些已经完成了过继性回输car-t细胞安全性和可行性的评估。例如，cd19car-t细胞治疗淋巴瘤和白血病、gd2car-t细胞治疗神经胶质瘤、psmacar-t细胞治疗前列腺癌、her2/neucar-t细胞治疗肺癌等已经进入临床试验阶段，并取得了良好成果。
car载体系统是影响car-t细胞质量的一个重要因素，不同载体系统在成本、安全性和car表达水平方面的优缺点各不相同，目前临床试验中应用较为成功的γ-逆转录病毒和慢病毒载体系统用于car基因转导，但是病毒载体有许多缺陷，如致癌性、有限的目的基因包装能力和生产过程复杂且成本较高等。其致癌作用是在一次临床试验中发现的，1例患者在接受治疗30个月后发生了t细胞白血病。因此研究者试图采用非病毒载体进行基因编辑，包括rna-based电转以及最近较热的转座子系统，尽管这些方法为t细胞的修饰提供可行性，但是仍然有许多问题要考虑：包装基因片段的大小和数量受到限制，蛋白表达水平无法预测。同时由于慢病毒转染这一技术限制，car-t的制备周期较长，费用昂贵。同时病毒载体的质量严重影响了car-t细胞的功能，成为car-t的gmp一大难题。另一方面，现有的car-t细胞(cd19靶向的car-t，ctl019)经基因编辑后，永久性的存在于患者体内，造成b细胞缺失这一副作用。因此寻找和研发非基因编辑的t细胞修饰方法成为肿瘤免疫治疗的又一热点。
双特异性抗体，是肿瘤免疫治疗领域另一个备受关注的技术，通过同时识别两个靶标，如cd19和cd3，可以作为一个媒介重定向免疫效应细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤功能。同时，通过靶向同一种细胞上的两种不同受体，双特异性抗体可以诱导细胞信号的改变，如细胞增殖、细胞迁移和炎症反应等。利用双特异性抗体进行t细胞的激活也是对t细胞进行非基因编辑的一种方法。
然而双特异性抗体在应用中也具有以下缺陷：1.免疫原性。抗体药物最初的将2株表达不同单克隆抗体的杂交瘤融合而获得，随着分子生物学的发展，特别是转基因小鼠、抗体库的噬菌体展示技术的应用，人们对传统的鼠源抗体进行改造，得到了各种类型的抗体，但这些抗体均会引发不同程度的过敏反应和抗抗体反应，包括人抗鼠抗体反应，人抗嵌合抗体反应，人抗人源化抗体反应等，这些反应有时会导致严重的临床后果。2.分子量太大。即便是小分子量的双特异性抗体，其分子量也达到～50kda，不易穿过血管壁或是组织屏障以达到靶点发挥疗效；同时要求低温保存，对药物的保存和运输条件要求较高。3.生产工艺复杂。抗体的生产涉及许多环节，包括高表达细胞株筛选、培养基研发、纯化技术研发等等诸多方面，使得抗体药物的研发周期长达十数年，成本数十亿美元，如何缩短研发周期，降低生产成本是制约抗体药研发的重要因素。
而利用小分子修饰t细胞使其既可以靶向结合肿瘤细胞，又能够激活细胞内信号通路从而发挥杀伤功能，将解决上述问题，采用这一策略将为肿瘤的免疫治疗提供新的思路。唾液酸(sialicacid)是一种九碳糖，它作为构成糖链的重要单糖之一，广泛存在于各种生物组织中，是构成细胞表面糖缀合物的重要组成成分，是人体免疫系统中聚糖最为重要的组成部分之一。研究显示，唾液酸直接参与免疫细胞的迁移，免疫信号传导和免疫细胞激活，使得唾液酸及其衍生物成为用于修饰t细胞的候选化合物。
技术实现要素：
本发明提供了一种t细胞，所述t细胞的表面修饰有唾液酸衍生物，其中所述唾液酸衍生物含有叠氮基团；
在本发明的一种优选实施方案中，所述唾液酸衍生物为ac4mannaz。
在本发明的一种实施方案中，所述ac4mannaz与dibo-c(rgdfk)或dibo-folate连接；
本发明还提供了唾液酸衍生物修饰的t细胞的制备方法，包括将t细胞与唾液酸衍生物共同孵育生成修饰后t细胞，并随后清洗；在本发明的一个优选实施方案中，所述唾液酸衍生物为ac4mannaz；
进一步地，所述ac4mannaz的浓度为10μm-25μm，孵育时间为72-120个小时；优选地，所述ac4mannaz的浓度为20μm，孵育时间为96小时，然后用pbs清洗3次，除去培养液中游离的ac4mannaz；更进一步地，在加入ac4mannaz之前调整活化的t细胞数量，优选为1×106/ml；
进一步地，该制备方法还包括将修饰后的t细胞中加入dibo-c(rgdfk)或dibo-folate孵育，清洗；具体操作方法为加入终浓度为100μm的dibo-c(rgdfk)或dibo-folate，室温孵育2h，pbs清洗3次；
本发明还提供了一种药物组合物，其包含上述t细胞，以及任选的药学上可接受的辅料。
本发明还提供了上述t细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗肿瘤细胞的药物中的用途；
在本发明的一个优选实施方案中，其中所述肿瘤细胞为整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞；进一步地，所述整合素αvβ3高表达的肿瘤细胞为u87细胞。
在本发明的另一优选实施方案中，其中所述肿瘤细胞为叶酸受体高表达的肿瘤细胞；进一步地，所述叶酸受体高表达的肿瘤细胞为skov3细胞。
本发明基于非天然糖代谢工程策略对t细胞进行修饰，向t细胞表面修饰有非天然糖唾液酸衍生物，模拟双特异性抗体(cd3靶向)活化t细胞的方法，构建一种car-t-liket细胞，使能够与肿瘤特异性抗原结合，并活化发挥肿瘤杀伤作用。下面将详述本发明的原理：
本发明选择唾液酸衍生物对t细胞表面进行修饰，优选为ac4mannaz，其中叠氮和端炔(dibo)为生物反应基团，二者可进行生物正交反应，从而偶联上一系列功能基团。
在靶点的选择上，在本发明的一个实施方案中，本发明选择胶质瘤细胞中高表达的整合素αvβ3，其中整合素αvβ3的α链胞膜外区能特异性识别含rgd序列的多肽，从而被用于肿瘤的诊断和治疗。本发明选用dibo-c(rgdfk)多肽，其中dibo-基团可以通过生物正交反应与唾液酸衍生物的叠氮基团相连，-c(rgdfk)可以与整合素αvβ3以高亲和力特异性结合，从而可以进行靶向整合素αvβ3高表达的u87胶质瘤细胞。
在靶点的选择上，在本发明的另一个实施方案中，本发明选择叶酸受体α，其中叶酸受体α能特异性结合叶酸(folate)，从而被用于肿瘤的诊断和治疗。本发明选用dibo-folate，其中dibo-基团可以通过生物正交反应与唾液酸衍生物的叠氮基团相连，-folate可以与叶酸受体α以高亲和力特异性结合，从而可以特异性靶向叶酸受体α高表达的skov3肿瘤细胞。
本发明构建的t细胞能够特异性识别并结合肿瘤抗原。与car-t相比，制备过程更加简单，car-t构建过程需要21天左右，而本技术中，非天然糖的标记仅需4天；而第二步进行靶向分子连接仅需2h。同时非天然糖修饰的免疫细胞在未经抗原刺激的条件下，约7天左右即能够代谢成为正常的免疫细胞，表明该技术不会对免疫细胞造成永久性的改造。
本发明相对于现有技术具有如下特点：
1.利用非病毒载体对t细胞进行非基因编辑方式修饰，增加了应用的安全性；
2.t细胞表面承载的靶向分子的量可调控，即t细胞的杀伤能力可调控，增加了应用的灵活性；
3.用于t细胞标记的化合物均为小分子，而非抗体或多肽，为t细胞靶向性修饰提供了更大的可能；
4.代谢到t细胞表面的唾液酸衍生物在一段时间内可代谢下膜，不会对t细胞造成永久性的改变，降低副作用(如car-t导致的b细胞再生障碍)；
5.对t细胞表面的唾液酸进行修饰从而达到促进t细胞激活的作用，发现了t细胞信号通路活化的新机制。
附图说明
图1为ac4mannaz在jurkat细胞内的代谢特征，其中，a为荧光检测ac4mannaz代谢上膜时间曲线，b为荧光检测ac4mannaz代谢下膜时间曲线，c为荧光检测ac4mannaz代谢上膜剂量曲线；
图2为ac4mannaz在t细胞内的代谢特征，其中，a为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和时间曲线，b为荧光检测ac4mannaz代谢下膜的图片和时间曲线，c为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和剂量曲线；d为不同剂量ac4mannaz细胞毒性实验；
图3为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的jurkat细胞对integrinαvβ3高表达的u87肿瘤细胞具有特异性靶向结合。
图4为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对integrinαvβ3高表达的u87肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤，其中，a为不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育18h后光学显微镜照片，b为检测不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育18h后细胞杀伤效果，c为检测不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育2、4、8、12和24h后细胞上清中细胞因子分泌量，d为不同效靶比的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-t细胞与靶细胞共孵育18h后光学显微镜照片，e为检测不同效靶比的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-t细胞与靶细胞共孵育18h后细胞杀伤效果，f为检测不同效靶比的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-t细胞与靶细胞共孵育18h后细胞上清中细胞因子分泌量；
图5为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰促进t细胞激活并且依赖integrinαvβ3的表达；流式细胞术检测与靶细胞共培养后的t细胞cd25(晚期活化marker)和cd69(早期活化marker)表达量；
图6为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰促进t细胞免疫突触形成；不同方法修饰的jurkat细胞cd3ζ(t细胞受体活化指标)定位的荧光照片；
图7为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对integrinαvβ3高表达细胞的结合和杀伤具有特异性，其中，a为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞(绿色荧光标记)分别与u87细胞(红色荧光标记)和hela细胞(红色荧光标记)共培养18h的荧光显微镜拍照，b为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞以e:t为2:1的比例与u87细胞(红色荧光标记)和hela细胞(绿色荧光标记)共培养18h的荧光显微镜拍照；c为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞以e:t为5:1的比例与u87细胞和hela细胞共培养18h的荧光显微镜拍照；
图8为ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞对叶酸受体α高表达的skov3肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤。，其中，a为不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育24h后光学显微镜照片，b为检测不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育24h后细胞杀伤效果，c为检测不同方式修饰的t细胞与靶细胞共孵育2、4、8、12和24h后细胞上清中细胞因子分泌量，d为不同效靶比的ac4mannaz-dibo-folate-t细胞与靶细胞共孵育24h后光学显微镜照片，e为检测不同效靶比的ac4mannaz-dibo-folate-t细胞与靶细胞共孵育24h后细胞杀伤效果，f为检测不同效靶比的ac4mannaz-dibo-folate-t细胞与靶细胞共孵育24h后细胞上清中细胞因子分泌量；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明中涉及的非天然糖为ac4mannaz；免疫细胞为t细胞；靶向分子为dibo-c(rgdfk)和dibo-folate，其分别靶向整合素αvβ3和叶酸受体(folatereceptor)α；进行ac4mannaz-dibo-rgd修饰t细胞杀伤实验时，u87细胞为整合素αvβ3高表达细胞系，hela细胞为整合素αvβ3低表达细胞系；进行ac4mannaz-dibo-folate修饰t细胞杀伤实验时，skov3细胞为叶酸受体α高表达细胞系，a549细胞为叶酸受体α低表达细胞系。
本发明所使用的肿瘤细胞jurkat细胞，u87细胞，hela细胞，skov3细胞和a549细胞均购于上海中科院细胞库；人外周血单个核细胞(pbmcs)购于北京血液中心。
本发明所使用试剂来源如下：
rpmi1640培养液厂家为gibco，型号为a1049101；dmem培养液厂家为迈晨，15019；fbs厂家为pan，p30-3302；hil-2为r&d；cd3/cd28磁珠厂家为invitrogen，11161d；ac4mannaz来自于thermo，88904；dibo-alex488来自于invitrogen，c10405；dibo-rgd购自吉尔生化有限公司，在本发明中dibo-rgd等同于dibo-c(rgdfk)；ldh细胞毒检测试剂盒来自于promega，g1708；humanil-2elisa试剂盒来自于biolegend，431804；humanifn-γelisa试剂盒来自于biolegend，430104；humanil-6elisa试剂盒来自于biolegend，430504；humantnf-αelisa试剂盒来自于biolegend，430204；anti-humancd69pe来自于ebioscience，12-0699；anti-humancd25pe来自于ebioscience，12-0259；anti-humancd3fitc来自于ebioscience，11-0039；cd3ζ(6b10.2)来自于santacruz，sc-1239。
实施例1细胞培养
1.细胞培养
贴壁细胞：u87细胞，hela细胞和a549细胞在dmem培养液(含10％胎牛血清；100u/ml青霉素；100μg/ml链霉素)37℃培养，skov3细胞用rpim-1640培养液，细胞以2×104个/ml的浓度种到60-mm细胞培养皿中，每3天传代1次。
悬浮细胞：jurkat细胞在rpmi-1640培养液(含10％胎牛血清；100u/ml青霉素；100μg/ml链霉素)37℃培养，细胞以2×104个/ml的浓度种到60-mm细胞培养皿中，每3天传代1次。
2.流式细胞检测肿瘤细胞肿瘤抗原(整合素αvβ3和叶酸受体α)表达
收集生长对数期的u87和hela细胞(检测整合素αvβ3)，skov3和a549细胞(检测叶酸受体α)，调整细胞数量为1×106，4％多聚甲醛室温固定15min，pbs清洗，5％bsa室温封闭1h；抗整合素αvβ3(或叶酸受体α)抗体37℃孵育2h，以pbs为阴性对照；pbs清洗，fitc标记的二抗室温孵育1h，清洗，流式细胞仪检测。
3.外周血单个核细胞的分离与激活
采健康志愿者外周血，用pbs以1:1稀释血液，沿离心管壁缓慢加入到己装有淋巴细胞分离液的15ml离心管中，2000rpm离心20min，吸取白膜层即为pbmcs，用pbs洗一次细胞，rpmi-1640培养液重悬细胞，并转移至10cm细胞培养皿，37℃、5％co2培养2h，使单核细胞贴壁，收集悬浮细胞即为外周血淋巴细胞。
t细胞体外激活：将1×106/ml上述所得的外周血淋巴细胞置于10％fbs的rpmi-1640完全培养基中，按照细胞:磁珠为1:3的比例加入适量cd3/cd28磁珠，每2天加入100iu/mlil-2，37℃、5％co2条件下培养。刺激3d后，可以看到细胞成聚团现象，显示细胞已经被活化，用此状态的细胞进行后续实验。
实施例2检测ac4mannaz在细胞内的代谢特征
为检测ac4mannaz在jurkat细胞和t细胞膜表面的标记效率，具体采用以下方法：
1×106/mljurkat细胞或t细胞接种在60-mm细胞培养皿中，加入不同剂量(终浓度为0μm、5μm、10μm、20μm、40μm、80μm、160μm和320μm)的ac4mannaz孵育48h(用于剂量曲线)或20μmac4mannaz孵育不同时间(0h、24h、48h、72h和96h，用于时间曲线)。细胞用pbs清洗3次，除去培养液中游离的ac4mannaz，加入终浓度为200μm的alexafluor488-dibo，室温孵育2h，pbs清洗3次，荧光显微镜拍照或流式细胞仪检测。
ac4mannaz在jurkat细胞内的代谢特征见图1所示，其中a为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和时间曲线；b为荧光检测ac4mannaz代谢下膜的图片和时间曲线；c为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和剂量曲线。
这一检测结果显示了ac4mannaz在jurkat细胞内代谢具有剂量依赖和时间依赖的特征，当剂量达到40μm时，ac4mannaz代谢上膜量达到平台；孵育时间达到48h时，ac4mannaz代谢上膜量达到平台；已经代谢到jurkat细胞细胞膜上的ac4mannaz在培养(无ac4mannaz的培养基)48h后，几乎全部代谢下膜。
ac4mannaz在t细胞内的代谢特征见图2所示，其中a为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和时间曲线；b为荧光检测ac4mannaz代谢下膜的图片和时间曲线；c为荧光检测ac4mannaz代谢上膜的图片和剂量曲线；d为不同剂量ac4mannaz的细胞毒性实验。
这一检测结果显示了ac4mannaz在t细胞内代谢具有剂量依赖和时间依赖的特征，当剂量达到80μm时，ac4mannaz代谢上膜量达到平台，标记效率约55％；孵育时间达到96h时，ac4mannaz代谢上膜量达到平台；类似的，下膜时间约96h。结果表明低剂量的ac4mannaz(≤300μm)无明显细胞毒性，较为安全。
实施例3制备ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t淋巴细胞
收集实施例1所得的激活的t淋巴细胞，调整细胞数量为1×106/ml，加入终浓度为20μm的ac4mannaz孵育96小时，细胞用pbs清洗3次，除去培养液中游离的ac4mannaz，得到表面修饰有ac4mannaz的t细胞。
随后，向上述修饰后t细胞加入终浓度为200μm的dibo-c(rgdfk)，室温孵育2h，pbs清洗3次，得到ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t淋巴细胞，用于后续功能检测。
实施例4制备ac4mannaz-dibo-folate修饰的t淋巴细胞
收集实施例1所得的激活的t淋巴细胞，调整细胞数量为1×106/ml，加入终浓度为20μm的ac4mannaz孵育96小时，细胞用pbs清洗3次，除去培养液中游离的ac4mannaz，得到表面修饰有ac4mannaz的t细胞。
随后，向上述修饰后t细胞加入终浓度为200μm的dibo-folate，室温孵育2h，pbs清洗3次，得到ac4mannaz-dibo-folate修饰的t淋巴细胞，用于后续功能检测。
实施例5免疫荧光检测ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的jurkat细胞和靶细胞结合
按照实施例3所述的方法将jurkat细胞改造为ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-jurkat细胞，进行cfse(绿色)荧光标记，u87细胞或hela细胞(阴性对照)进行mitotrackerred(红色)荧光标记，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-jurkat细胞与u87细胞或hela细胞以1:1比例共孵育，于37℃、5％co2培养箱中培养4h，pbs轻柔的吹打3次，荧光显微镜观察，绿色和红色荧光叠加后发生相连即认为jurkat细胞和u87细胞靶向结合。如图3所示，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-jurkat细胞与u87细胞发生聚集，形成细胞团，而ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)-jurkat细胞与hela细胞未见明显的细胞聚集。
实验例1ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对整合素αvβ3高表达的u87肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤
为检测ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对整合素αvβ3高表达的u87肿瘤细胞具靶向杀伤功能，我们通过使用cytotox96non-radioactivecytotoxicity方法检测肿瘤细胞死亡情况，具体方法如下：
取u87细胞和实施例3制备的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞各100μl(效靶比10:1)，加入96孔培养板中；u87细胞自然释放孔加u87细胞和培养液各100μl；u87细胞最大释放孔加u87细胞和裂解液各100μl；t细胞自然释放孔加t细胞和培养液各100μl；上述各项均设三个复孔，于37℃、5％co2培养箱中培养18h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清50μl置平底96孔培养板中，同时加入检测液50μl，反应30min，每孔加入反应终止液50μl，在酶标仪490nm处测定光密度值(od)。
计算：
以未经处理的t细胞、仅孵育ac4mannaz的t细胞和仅孵育dibo-c(rgdfk)的t细胞组作为对照，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞为实验组。各组细胞共培养18小时后，光学显微镜拍照，结果见图4a，结果发现ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞形成了明显的克隆，并且观察到明显的u87细胞碎片，而各对照组(包括hela细胞)中未见此现象。cytotox96non-radioactivecytotoxicity方法检测结果证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对u87细胞杀伤效果达到～80％，见图4b。
使用elisa试剂盒检测上清中细胞因子分泌量，计算ifn-γ、il-2、tnf-α和il-6浓度值。结果显示ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞与u87细胞共培养后，ifn-γ和il-2大量增加，与各对照组(包括hela细胞)有明显的统计学差异；而与ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞和hela细胞共培养组相比，tnf-α分泌量没有明显差异；由于u87细胞能够合成大量的il-6，与未经处理的t细胞和u87细胞共培养组相比，il-6分泌量没有明显差异，见图4c。
不同效靶比的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞和u87细胞共培养实验结果表明，如图4d所示，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞与u87细胞以效靶比为2:1共孵育时，就发生一定程度的杀伤作用，随着效靶比的升高，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对u87细胞的杀伤能力也升高；而ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞与hela细胞以效靶比为2:1共孵育时，则没有明显的杀伤作用，当效靶比升高到10:1时，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对hela细胞的杀伤仅为40％。同时ifn-γ分泌量也升高，但其他细胞因子并没有明显改变，见图4e、图4f。这一结果表明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞的杀伤功能依赖整合素αvβ3的表达，通过ifn-γ和il-2分泌增加实现的，而对tnf-α和il-6的分泌影响较小，表明该种t细胞修饰方法引起的细胞因子风暴较弱。
实验例2ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰t细胞促进t细胞激活
未经处理的t细胞、实施例3的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞分别与u87细胞或hela细胞共培养，收集细胞进行cd3/cd25(中晚期活化指标)或cd3/cd69(早期活化指标)双重染色，进行流式检测，结果见图5。发现与未经处理的t细胞相比，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞cd25和cd69表达明显上调，证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰方法可促进t细胞的活化。与hela组相比，与u87共培养的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞cd25和cd69表达均有所上调，证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞活化是整合素αvβ3依赖的。
实验例3ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰t细胞促进t细胞免疫突触形成
免疫突触作为t细胞和apc之间形成的一种特化的接触表面，其形成是免疫细胞之间的膜表面分子相互识别和信号得以传递的先决条件，在t细胞的活化过程中发挥着重要的功能。为了检测ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰方法是否促进免疫突触形成，我们进行了以下实验：
u87细胞和hela细胞胰酶消化，不含血清的dmem培养液重悬，计数，取3×105u87和hela细胞，加入5μmcfse染料，37℃孵育30分钟。洗涤，重悬u87和hela细胞于25μl含10％血清的rpmi-1640，备用。3×105jurkat细胞，重悬于25μl含10％血清的rpmi-1640；将jurkat细胞和ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的jurkat细胞分别与u87细胞和hela细胞混匀置于1.5mlep管中，37℃孵育10min。将共培养的细胞均匀铺于激光共聚焦培养皿中，37℃孵育30min。甲醛室温固定15min，羊血清室温封闭30min。加入200μlcd3ζ单抗，4℃过夜。pbs清洗，加入200μlgoatantimousealex488染料，室温避光染色1h。pbs清洗后，在激光共聚焦显微镜下观察dish中细胞免疫突触的形成，并拍照。
结果见图6，发现与未经处理的jurkat细胞相比，ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的jurkat细胞cd3ζ主要定位在与u87细胞相互接触部位，证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰方法促进t细胞免疫突触形成。而未经修饰的t细胞与u87细胞共培养后，cd3ζ定位没有发生明显改变，证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰促进t细胞免疫突触形成。
实验例4ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞特异性结合并杀伤整合素αvβ3高表达细胞
为了验证ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞靶向杀伤的特异性，我们将u87细胞(红色)和hela细胞(绿色)分别标记不同荧光，与实施例3的ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞共培养18h，荧光显微镜拍照，结果见图7b。发现当效靶比为2:1时，红色荧光减弱，而当效靶比提高到5:1时，红色荧光几乎消失，表明u87细胞发生裂解，而绿色荧光无明显变化，表明hela细胞并未受到影响，这一结果证明ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞对integrinαvβ3高表达细胞的杀伤具有明显的特异性。
实验例5ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞对叶酸受体α高表达的skov3肿瘤细胞具有特异性靶向杀伤
具体操作方法同上，结果见图8，实施例4的ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞对skov3细胞(叶酸受体α高表达)的杀伤效果达到60％，而对a549细胞(叶酸受体α低表达)的杀伤效果仅为14％。ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞与skov3细胞共培养后上清中ifn-γ和il-2大量增加，与各对照组(包括a549细胞)有明显的统计学差异，结果见图8b；不同效靶比的ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞和skov3细胞共培养实验结果表明，如图8c所示，ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞和skov3细胞以效靶比为2:1共孵育时，就发生一定程度的杀伤作用，随着效靶比的升高，ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞和skov3细胞的杀伤能力升高，上清中ifn-γ和il-2分泌增加；而ac4mannaz-dibo-c(rgdfk)修饰的t细胞与a549细胞以效靶比为10:1共培养时，也未见杀伤活力升高。这一结果表明ac4mannaz-dibo-folate修饰的t细胞和skov3细胞的杀伤功能依赖叶酸受体的表达，通过ifn-γ和il-2分泌增加实现的。
证明非天然糖-靶向分子修饰的t细胞对肿瘤抗原高表达的肿瘤细胞具有明显增强的杀伤效果，同时这种杀伤效果是依赖肿瘤抗原的表达的。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。