本发明涉及细胞培养技术领域，具体而言，涉及一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基及其制备方法。
背景技术：
现有的动物细胞培养中，一般将动物细胞培养基干粉组合物分散于载剂(如重蒸水)中形成液体培养基组合物，然后与终浓度大于10v/v％的动物血清配合使用；或者将不含动物血清的动物细胞液体培养基组合物与终浓度大于10v/v％的动物血清配合使用；或者直接使用包括终浓度至少10体积％的动物血清的液体培养基组合物，才能保证细胞的正常生长传代。
然而动物血清是成分不明确的复杂混合物。一方面动物血清含有携带激素、矿物质、微量元素、脂类物质的转运蛋白；细胞贴壁因子和扩散因子等可以促进细胞生长、稳定解毒、维持培养基的ph值，并抑制蛋白酶直接或间接的酶解。但另一方面，动物血清存在很多问题，添加及补充过程中导致培养基ph值变化大，存储过程中易受其他微生物污染，低温贮存解冻后易产生沉淀，不同批次差异大，成本高，以及难以从细胞下游产品中去除，安全性差等。因此现有技术在动物细胞培养中使用的培养基尽量不用或少用动物血清。
此外，现有技术中的培养基的配方通常是对常见的细胞种类进行设计，而对某些特异性的细胞缺少针对性的优化。
有鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有mdck细胞培养基(以下简称gj-pyj201培养基)必须与高含量动物血清配合使用才能促进动物细胞生长、安全性差的缺点，提供一种mdck细胞培养基，该培养基能促进mdck细胞生长、安全性好。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素1～10×10-8m、氯化钙1～5×10-3m、硫酸铜2.8～12.8×10-9m、氰钴胺1～10×10-7m、d-泛酸钙2～8×10-5m、d-葡萄糖1.6～2.0×10-2m、硫酸亚铁2～10×10-6m、叶酸0.5～1.5×10-4m、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7m、氢化可的松3～7×10-8m、次黄嘌呤1～5×10-5m、肌醇1～10×10-5m、硝酸铁0.3～2×10-7m、l-丙氨酸1～20×10-5m、l-精氨酸1～20×10-4m、l-天冬酰胺1～20×10-5m、l-天冬氨酸1～20×10-5m、l-半胱氨酸0.1～10×10-4m、l-胱氨酸0.1～10×10-4m、l-谷氨酸1～20×10-5m、l-谷氨酰胺1～10×10-3m、甘氨酸1～10×10-4m、l-组氨酸0.5～10×10-4m、l-异亮氨酸0.5～10×10-4m、l-亮氨酸0.5～10×10-4m、l-赖氨酸1～20×10-4m、l-蛋氨酸1～10×10-4m、l-苯丙氨酸1～10×10-4m、l-脯氨酸0.1～10×10-4m、l-丝氨酸1～20×10-4m、l-苏氨酸1～20×10-4m、l-色氨酸1～20×10-5m、l-酪氨酸1～10×10-4m、l-缬氨酸1～20×10-4m、硫辛酸1～20×10-7m、氯化镁1～20×10-5m、硫酸镁1～20×10-4m、烟酰胺1～20×10-5m、对氨基苯甲酸0.5～5g、氯化钾1～10×10-3m、腐胺1～10×10-7m、吡多辛1～10×10-7m、核黄素1～10×10-7m、碳酸氢钠1～10×10-2m、氯化钠0.5～10×10-1m、磷酸氢二钠1～10×10-4m、磷酸二氢钠1～10×10-4m、丙酮酸钠0.1～10×10-3m、硫胺素1～20×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～10×10-6m、硫酸锌0.1～10×10-6m、氯化胆碱0.1～10×10-4m、胰岛素5～15mg、转铁蛋白5～15mg、三典甲状腺氨酸1～20×10-12m以及二硫苏糖醇1～20×10-6m。
根据本发明的一方面，本发明还涉及前述任一项权利要求所述的培养基的制备方法，包括：将所有培养基成份混在一起成培养基干粉后分散于溶剂中。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明所提供的gj-pyj201培养基用于mdck的全悬浮培养，不产生伴随蛋白成分的副作用，安全性好，不同批次差异小，成本低，利于分离细胞下游产品、安全性好，适于用作生产疫苗等生物制品。
(2)本发明所提供的gj-pyj201培养基尤其适合于保藏编号为cctccno:c201857的mdck细胞的培养，不仅能够减少该细胞培养时团聚的现象，还可进一步增加其耐低氧的特性，增加该细胞活率。
具体实施方式
本发明涉及一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素1～10×10-8m、氯化钙1～5×10-3m、硫酸铜2.8～12.8×10-9m、氰钴胺1～10×10-7m、d-泛酸钙2～8×10-5m、d-葡萄糖1.6～2.0×10-2m、硫酸亚铁2～10×10-6m、叶酸0.5～1.5×10-4m、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7m、氢化可的松3～7×10-8m、次黄嘌呤1～5×10-5m、肌醇1～10×10-5m、硝酸铁0.3～2×10-7m、l-丙氨酸1～20×10-5m、l-精氨酸1～20×10-4m、l-天冬酰胺1～20×10-5m、l-天冬氨酸1～20×10-5m、l-半胱氨酸0.1～10×10-4m、l-胱氨酸0.1～10×10-4m、l-谷氨酸1～20×10-5m、l-谷氨酰胺1～10×10-3m、甘氨酸1～10×10-4m、l-组氨酸0.5～10×10-4m、l-异亮氨酸0.5～10×10-4m、l-亮氨酸0.5～10×10-4m、l-赖氨酸1～20×10-4m、l-蛋氨酸1～10×10-4m、l-苯丙氨酸1～10×10-4m、l-脯氨酸0.1～10×10-4m、l-丝氨酸1～20×10-4m、l-苏氨酸1～20×10-4m、l-色氨酸1～20×10-5m、l-酪氨酸1～10×10-4m、l-缬氨酸1～20×10-4m、硫辛酸1～20×10-7m、氯化镁1～20×10-5m、硫酸镁1～20×10-4m、烟酰胺1～20×10-5m、对氨基苯甲酸0.5～5g、氯化钾1～10×10-3m、腐胺1～10×10-7m、吡多辛1～10×10-7m、核黄素1～10×10-7m、碳酸氢钠1～10×10-2m、氯化钠0.5～10×10-1m、磷酸氢二钠1～10×10-4m、磷酸二氢钠1～10×10-4m、丙酮酸钠0.1～10×10-3m、硫胺素1～20×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～10×10-6m、硫酸锌0.1～10×10-6m、氯化胆碱0.1～10×10-4m、胰岛素5～15mg、转铁蛋白5～15mg、三典甲状腺氨酸1～20×10-12m以及二硫苏糖醇1～20×10-6m。
优选的，如上所述的培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素2～5×10-8m、氯化钙1～3×10-3m、硫酸铜5.8～9.8×10-9m、氰钴胺1～5×10-7m、d-泛酸钙2～7×10-5m、d-葡萄糖1.3～2.2×10-2m、硫酸亚铁1～8×10-6m、叶酸0.5～1.5×10-4m、谷胱甘肽3.5～9.5×10-7m、氢化可的松3～8×10-8m、次黄嘌呤1～5×10-5m、肌醇5～9×10-5m、硝酸铁0.8～1.6×10-7m、l-丙氨酸2～8×10-5m、l-精氨酸4～10×10-4m、l-天冬酰胺2～8×10-5m、l-天冬氨酸2～8×10-5m、l-半胱氨酸0.5～2×10-4m、l-胱氨酸0.5～2×10-4m、l-谷氨酸2～8×10-5m、l-谷氨酰胺1～4×10-3m、甘氨酸1～4×10-4m、l-组氨酸0.5～2.5×10-4m、l-异亮氨酸3～5×10-4m、l-亮氨酸3～6×10-4m、l-赖氨酸2～8×10-4m、l-蛋氨酸0.8～1.6×10-4m、l-苯丙氨酸1～4×10-4m、l-脯氨酸1～4×10-4m、l-丝氨酸1～4×10-4m、l-苏氨酸2～6×10-4m、l-色氨酸2～6×10-5m、l-酪氨酸1～4×10-4m、l-缬氨酸2～6×10-4m、硫辛酸2～8×10-7m、氯化镁2～9×10-5m、硫酸镁2～12×10-4m、烟酰胺1～4×10-5m、对氨基苯甲酸0.5～4.5g、氯化钾2～6×10-3m、腐胺2～8×10-7m、吡多辛0.5～3×10-7m、核黄素3～8×10-7m、碳酸氢钠1～6×10-2m、氯化钠0.5～2.5×10-1m、磷酸氢二钠2～8×10-4m、磷酸二氢钠2～7×10-4m、丙酮酸钠0.3～1.8×10-3m、硫胺素3～9×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5～4×10-6m、硫酸锌0.5～3×10-6m、氯化胆碱0.1～2×10-4m、胰岛素5～10mg、转铁蛋白5～10mg、三典甲状腺氨酸2～7×10-12m以及二硫苏糖醇2～9×10-6m。
优选的，如上所述的培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8m、氯化钙2×10-3m、硫酸铜7.8×10-9m、氰钴胺3×10-7m、d-泛酸钙5×10-5m、d-葡萄糖1.8×10-2m、硫酸亚铁5×10-6m、叶酸1×10-4m、谷胱甘肽6.5×10-7m、氢化可的松5×10-8m、次黄嘌呤3×10-5m、肌醇7×10-5m、硝酸铁1.2×10-7m、l-丙氨酸5×10-5m、l-精氨酸7×10-4m、l-天冬酰胺5×10-5m、l-天冬氨酸5×10-5m、l-半胱氨酸1×10-4m、l-胱氨酸1×10-4m、l-谷氨酸5×10-5m、l-谷氨酰胺2.5×10-3m、甘氨酸2.5×10-4m、l-组氨酸1.5×10-4m、l-异亮氨酸4.2×10-4m、l-亮氨酸4.5×10-4m、l-赖氨酸5×10-4m、l-蛋氨酸1.2×10-4m、l-苯丙氨酸2.2×10-4m、l-脯氨酸1.5×10-4m、l-丝氨酸2.5×10-4m、l-苏氨酸4.5×10-4m、l-色氨酸4.4×10-5m、l-酪氨酸2.1×10-4m、l-缬氨酸4.5×10-4m、硫辛酸5.1×10-7m、氯化镁6×10-5m、硫酸镁7×10-4m、烟酰胺1.7×10-5m、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3m、腐胺5×10-7m、吡多辛1.5×10-7m、核黄素5.8×10-7m、碳酸氢钠2.9×10-2m、氯化钠1.19×10-1m、磷酸氢二钠5×10-4m、磷酸二氢钠4.5×10-4m、丙酮酸钠1×10-3m、硫胺素6.4×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6m、硫酸锌1.5×10-6m、氯化胆碱1×10-4m、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12m以及二硫苏糖醇6.5×10-6m。
优选的，如上所述的培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基还包括：
亚油酸0.5～4.5×10-7m、苯酚红1～6×10-5m、泊洛沙姆0.5～3.5g、前列腺素e23～10×10-8m、h2seo31～5×10-8m以及na2sio32～9×10-7m；
优选的，如上所述的培养基，以溶解后为1升溶液计算，所述培养基还包括：
亚油酸2×10-7m、苯酚红3.6×10-5m、泊洛沙姆2g、前列腺素e27×10-8m、h2seo33×10-8m以及na2sio35×10-7m。
优选的，如上所述的培养基，所述培养基溶解时所用的溶剂选自蒸馏水、超纯水、去离子水、注射用水、能与水以任意比互溶的醇、碱性水溶液和酸性水溶液中的一种或几种。
优选的，如上所述的培养基，所述培养基溶解时所用的溶剂选自注射用水。
优选的，如上所述的培养基，所述mdck细胞保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno:c201857，保藏时间为2018年2月10日。
本发明所提供的mdck细胞系，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学中国典型培养物保藏中心。培养物名称(分类命名)：犬肾细胞mdck-g01。
根据本发明的一方面，本发明还涉及前述任一项权利要求所述的培养基的制备方法，包括：将所有培养基成份混在一起成培养基干粉后分散于溶剂中。
优选的，在制备时刻将将培养基大量组份进行精加工混在一起成培养基干粉，微量组份单独配成微量组份液。
优选的，如上所述的制备方法，所述方法还包括调节ph、过滤除菌。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用超纯水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素1×10-8m、氯化钙5×10-3m、硫酸铜2.8×10-9m、氰钴胺1×10-7m、d-泛酸钙2×10-5m、d-葡萄糖2.0×10-2m、硫酸亚铁2×10-6m、叶酸0.5×10-4m、谷胱甘肽9.5×10-7m、氢化可的松3×10-8m、次黄嘌呤1×10-5m、肌醇10×10-5m、硝酸铁0.3×10-7m、l-丙氨酸20×10-5m、l-精氨酸20×10-4m、l-天冬酰胺1×10-5m、l-天冬氨酸20×10-5m、l-半胱氨酸0.1×10-4m、l-胱氨酸10×10-4m、l-谷氨酸1×10-5m、l-谷氨酰胺10×10-3m、甘氨酸1×10-4m、l-组氨酸10×10-4m、l-异亮氨酸0.5×10-4m、l-亮氨酸10×10-4m、l-赖氨酸1×10-4m、l-蛋氨酸10×10-4m、l-苯丙氨酸1×10-4m、l-脯氨酸10×10-4m、l-丝氨酸1×10-4m、l-苏氨酸20×10-4m、l-色氨酸1×10-5m、l-酪氨酸1×10-4m、l-缬氨酸20×10-4m、硫辛酸1×10-7m、氯化镁20×10-5m、硫酸镁1×10-4m、烟酰胺20×10-5m、对氨基苯甲酸0.5g、氯化钾10×10-3m、腐胺1×10-7m、吡多辛10×10-7m、核黄素1×10-7m、碳酸氢钠10×10-2m、氯化钠1×10-1m、磷酸氢二钠10×10-4m、磷酸二氢钠1×10-4m、丙酮酸钠1×10-3m、硫胺素1×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷10×10-6m、硫酸锌0.1×10-6m、氯化胆碱10×10-4m、胰岛素5mg、转铁蛋白15mg、三典甲状腺氨酸1×10-12m以及二硫苏糖醇20×10-6m。
制备方法为：将所有培养基成份进行精加工混在一起成培养基干粉，将按配方比例进行组合好的培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解20分钟，然后加入氢氧化钠搅拌20分钟，再加碳酸氢钠再进行搅拌20分钟，配制后ph＝7.2-7.4。
实施例2
一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用超纯水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8m、氯化钙2×10-3m、硫酸铜7.8×10-9m、氰钴胺3×10-7m、d-泛酸钙5×10-5m、d-葡萄糖1.8×10-2m、硫酸亚铁5×10-6m、叶酸1×10-4m、谷胱甘肽6.5×10-7m、氢化可的松5×10-8m、次黄嘌呤3×10-5m、肌醇7×10-5m、硝酸铁1.2×10-7m、l-丙氨酸5×10-5m、l-精氨酸7×10-4m、l-天冬酰胺5×10-5m、l-天冬氨酸5×10-5m、l-半胱氨酸1×10-4m、l-胱氨酸1×10-4m、l-谷氨酸5×10-5m、l-谷氨酰胺2.5×10-3m、甘氨酸2.5×10-4m、l-组氨酸1.5×10-4m、l-异亮氨酸4.2×10-4m、l-亮氨酸4.5×10-4m、l-赖氨酸5×10-4m、l-蛋氨酸1.2×10-4m、l-苯丙氨酸2.2×10-4m、l-脯氨酸1.5×10-4m、l-丝氨酸2.5×10-4m、l-苏氨酸4.5×10-4m、l-色氨酸4.4×10-5m、l-酪氨酸2.1×10-4m、l-缬氨酸4.5×10-4m、硫辛酸5.1×10-7m、氯化镁6×10-5m、硫酸镁7×10-4m、烟酰胺1.7×10-5m、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3m、腐胺5×10-7m、吡多辛1.5×10-7m、核黄素5.8×10-7m、碳酸氢钠2.9×10-2m、氯化钠1.19×10-1m、磷酸氢二钠5×10-4m、磷酸二氢钠4.5×10-4m、丙酮酸钠1×10-3m、硫胺素6.4×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6m、硫酸锌1.5×10-6m、氯化胆碱1×10-4m、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12m以及二硫苏糖醇6.5×10-6m。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节ph＝7.2-7.4。
实施例3
一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用去离子水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素2×10-8m、氯化钙3×10-3m、硫酸铜5.8×10-9m、氰钴胺5×10-7m、d-泛酸钙2×10-5m、d-葡萄糖2.2×10-2m、硫酸亚铁1×10-6m、叶酸1.5×10-4m、谷胱甘肽3.5×10-7m、氢化可的松8×10-8m、次黄嘌呤1×10-5m、肌醇9×10-5m、硝酸铁0.8×10-7m、l-丙氨酸8×10-5m、l-精氨酸4×10-4m、l-天冬酰胺8×10-5m、l-天冬氨酸2×10-5m、l-半胱氨酸2×10-4m、l-胱氨酸0.5×10-4m、l-谷氨酸8×10-5m、l-谷氨酰胺1×10-3m、甘氨酸4×10-4m、l-组氨酸0.5×10-4m、l-异亮氨酸5×10-4m、l-亮氨酸3×10-4m、l-赖氨酸8×10-4m、l-蛋氨酸0.8×10-4m、l-苯丙氨酸4×10-4m、l-脯氨酸1×10-4m、l-丝氨酸4×10-4m、l-苏氨酸2×10-4m、l-色氨酸6×10-5m、l-酪氨酸1×10-4m、l-缬氨酸6×10-4m、硫辛酸2×10-7m、氯化镁9×10-5m、硫酸镁2×10-4m、烟酰胺4×10-5m、对氨基苯甲酸0.5g、氯化钾6×10-3m、腐胺2×10-7m、吡多辛3×10-7m、核黄素3×10-7m、碳酸氢钠6×10-2m、氯化钠0.5×10-1m、磷酸氢二钠8×10-4m、磷酸二氢钠2×10-4m、丙酮酸钠1.8×10-3m、硫胺素3×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷4×10-6m、硫酸锌0.5×10-6m、氯化胆碱2×10-4m、胰岛素5mg、转铁蛋白10mg、三典甲状腺氨酸2×10-12m以及二硫苏糖醇9×10-6m。
制备方法为：将所有培养基成份进行精加工混在一起成培养基干粉，将按配方比例进行组合好的培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解20分钟，然后加入氢氧化钠搅拌20分钟，再加碳酸氢钠再进行搅拌20分钟，配制后ph＝7.2-7.4。
实施例4
一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用注射用水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素5×10-8m、氯化钙1×10-3m、硫酸铜9.8×10-9m、氰钴胺1×10-7m、d-泛酸钙7×10-5m、d-葡萄糖1.3×10-2m、硫酸亚铁8×10-6m、叶酸0.5×10-4m、谷胱甘肽9.5×10-7m、氢化可的松3×10-8m、次黄嘌呤5×10-5m、肌醇5×10-5m、硝酸铁1.6×10-7m、l-丙氨酸2×10-5m、l-精氨酸10×10-4m、l-天冬酰胺2×10-5m、l-天冬氨酸8×10-5m、l-半胱氨酸0.5×10-4m、l-胱氨酸2×10-4m、l-谷氨酸2×10-5m、l-谷氨酰胺4×10-3m、甘氨酸1×10-4m、l-组氨酸2.5×10-4m、l-异亮氨酸3×10-4m、l-亮氨酸6×10-4m、l-赖氨酸2×10-4m、l-蛋氨酸1.6×10-4m、l-苯丙氨酸1×10-4m、l-脯氨酸4×10-4m、l-丝氨酸1×10-4m、l-苏氨酸6×10-4m、l-色氨酸2×10-5m、l-酪氨酸4×10-4m、l-缬氨酸2×10-4m、硫辛酸8×10-7m、氯化镁2×10-5m、硫酸镁12×10-4m、烟酰胺1×10-5m、对氨基苯甲酸4.5g、氯化钾2×10-3m、腐胺8×10-7m、吡多辛0.5×10-7m、核黄素8×10-7m、碳酸氢钠1×10-2m、氯化钠2.5×10-1m、磷酸氢二钠2×10-4m、磷酸二氢钠7×10-4m、丙酮酸钠0.3×10-3m、硫胺素9×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷0.5×10-6m、硫酸锌3×10-6m、氯化胆碱0.1×10-4m、胰岛素10mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸7×10-12m、二硫苏糖醇2×10-6m、亚油酸0.5×10-7m、苯酚红1×10-5m、泊洛沙姆3.5g、前列腺素e23×10-8m、h2seo35×10-8m以及na2sio32×10-7m。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节ph＝7.2-7.4。
实施例5
一种适应mdck细胞全悬浮培养的无血清培养基，以用注射用水溶解后为1升溶液计算，所述培养基包括以下成分：
生物素3×10-8m、氯化钙2×10-3m、硫酸铜7.8×10-9m、氰钴胺3×10-7m、d-泛酸钙5×10-5m、d-葡萄糖1.8×10-2m、硫酸亚铁5×10-6m、叶酸1×10-4m、谷胱甘肽6.5×10-7m、氢化可的松5×10-8m、次黄嘌呤3×10-5m、肌醇7×10-5m、硝酸铁1.2×10-7m、l-丙氨酸5×10-5m、l-精氨酸7×10-4m、l-天冬酰胺5×10-5m、l-天冬氨酸5×10-5m、l-半胱氨酸1×10-4m、l-胱氨酸1×10-4m、l-谷氨酸5×10-5m、l-谷氨酰胺2.5×10-3m、甘氨酸2.5×10-4m、l-组氨酸1.5×10-4m、l-异亮氨酸4.2×10-4m、l-亮氨酸4.5×10-4m、l-赖氨酸5×10-4m、l-蛋氨酸1.2×10-4m、l-苯丙氨酸2.2×10-4m、l-脯氨酸1.5×10-4m、l-丝氨酸2.5×10-4m、l-苏氨酸4.5×10-4m、l-色氨酸4.4×10-5m、l-酪氨酸2.1×10-4m、l-缬氨酸4.5×10-4m、硫辛酸5.1×10-7m、氯化镁6×10-5m、硫酸镁7×10-4m、烟酰胺1.7×10-5m、对氨基苯甲酸2g、氯化钾4.2×10-3m、腐胺5×10-7m、吡多辛1.5×10-7m、核黄素5.8×10-7m、碳酸氢钠2.9×10-2m、氯化钠1.19×10-1m、磷酸氢二钠5×10-4m、磷酸二氢钠4.5×10-4m、丙酮酸钠1×10-3m、硫胺素6.4×10-6m、胸腺嘧啶脱氧核苷1.5×10-6m、硫酸锌1.5×10-6m、氯化胆碱1×10-4m、胰岛素5mg、转铁蛋白5mg、三典甲状腺氨酸5×10-12m、二硫苏糖醇6.5×10-6m、亚油酸2×10-7m、苯酚红3.6×10-5m、泊洛沙姆2g、前列腺素e27×10-8m、h2seo33×10-8m以及na2sio35×10-7m。
制备方法为：以配制1升计，将培养基中质量大于0.1g的组份进行精加工混在一起成培养基干粉，培养基中质量小于0.1g的组份单独配成微量组份液。培养基干粉加入注射用水进行搅拌溶解30分钟，加入微量组份液搅拌10分钟，然后加入碳酸氢钠再进行搅拌10分钟，通过搅拌加入氢氧化钠调节ph＝7.2-7.4。
实验例1
本实验例提供了本发明所提供的gj-pyj201培养基对保藏编号为cctccno:c201857的mdck细胞的培养效果。
一、方法
1.1摇瓶细胞的制备
按常规方法从液氮中复苏冻存的悬浮种细胞，用吸管将细胞液加入到500ml三角摇瓶中，加入ph值为7.0±0.2的过滤除菌无血清培养基至100ml。将摇瓶置于摇床内，37℃，120转/分～140转/分进行培养扩繁。待细胞数量足够时，可接种反应器培养。
1.25l反应器细胞培养
取经摇瓶培养好的悬浮mdck细胞，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到5l反应器培养，培养体积为2l，转速120转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、ph值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定。待细胞密度≥2.0×106cells/ml时，将5l反应器的培养体积流加至4.5l，调整反应器控制参数(转速120转/分～140转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、ph值7.0±0.2)继续培养。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，转出4l至25l反应器内，余下0.5l用细胞培养液流加至5l体积继续培养。
1.3反应器放大培养
将从5l反应器转移出的细胞接入提前灭菌并预孵细胞培养液的25l反应器中培养，以1.0～2.0×106cells/ml的密度接种到25l反应器培养，培养体积为20l～25l，转速100转/分～130转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、ph值7.0±0.2，每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，待25l反应器的细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，将细胞转入提前灭菌并预孵细胞培养液的125l反应器中继续放大培养(转速80～100转/分、温度37℃、溶氧40％～50％、ph值7.0±0.2)。每隔24小时取样，观察细胞生长情况，同时进行细胞计数和葡萄糖含量测定，当细胞密度达到6.0～9.0×106cells/ml时，适时将细胞转入下一级放大的细胞反应器(5倍放大)，待终级反应器(6000l)细胞密度达到8.0×106～1.0×107cells/ml时可用于接毒培养。
1.4分别将3个6000l生物反应器准备好并灭菌备用，按照反应器编号将1#、2#、3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h。培养基预孵后无异常即可按照1.5×106-2.0×106cells/ml的密度将种细胞分别接种至三个反应器，接种后调整好反应器温度37℃、ph7.0、溶氧30-60％、搅拌转速40-60rpm等参数并开启自控。接种后24h取样观察并进行细胞计数，接种后48h再次取样观察并计数，细胞的比生长速率μ应该≥0.69。当细胞密度达到8.0×106～9.0×106cells/ml左右时即可补充接毒液调整细胞密度进行接毒。
二、结果：
2.1三种培养基的细胞增殖情况对比
当种细胞的接种密度均为1.5×106～2.0×106cells/ml的情况下，培养0h、24h、48h时取样进行活细胞计数并镜检观察细胞的状态，镜检观察1#、2#培养基培养细胞有少量结团外，且有形状不规则细胞，3#培养基培养细胞状态良好，细胞都比较圆润、表面光滑、大小均一。培养后0h、24h、48h时取样计数，从表1可以看出3#的细胞增殖最快，细胞密度达到1.0×107cells/ml以上，细胞活力维持在98％以上。
表1mdck细胞在不同培养基上的增殖情况
2.2h7-re1株在三种培养基培养的mdck细胞上的增殖情况对比
细胞培养48h后补充接毒液，将3个6000l反应器的细胞密度都调整至4.5×106cells/ml左右，按照moi为10-3接入同一批种毒。接毒后24小时取样测ha，3#反应器ha较高，达到1:256，病变也比较明显。最终48h收毒时3#反应器的毒价最高，ha达到1:1024，每1ml病毒含量达到108.37tcid50，每0.1ml病毒含量达到108.17eid50，结果见表2。
表2病毒在mdck细胞上的增殖情况
其中，1#培养基按照申请公布号cn105543163a，申请公布日为2016.05.04的专利申请文件的实施例3进行配制。
2#培养基的按照实施例2配制得到。
3#培养基的按照实施例5配制得到。
实验例2
按实验例1中1.1～1.4的培养条件培养申请人筛选得到的g01(保藏编号为cctccno:c201857的mdck细胞)、g02、g03细胞，培养基均采用3#培养基，区别仅在于，在步骤1.4中，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境。
在培养0h和24h时取样观察细胞活率。
表3不同mdck细胞在低氧环境下的细胞活率
其中，g01细胞明显具备更强的对低氧环境的忍耐能力。
按实验例1中1.1～1.4的培养条件培养申请人筛选得到的g01细胞，区别仅在于，在步骤1.4中，先均用3#培养基以无菌的方法过滤至对应的反应器中预孵24h，以使得3个反应器中的初始细胞活率一致。随后在正式培养时，将溶氧控制在25-35％，从而模拟生物反应器中局部缺氧的环境，同时将三个反应器中的培养基都分别替换为1#、2#、3#培养基。
表4不同培养基对mdck-g01细胞在低氧环境下的细胞活率
从表4可知，3#培养基能进一步提升mdck-g01细胞的耐低氧能力。
这可能是由于本申请所添加的既定量的谷胱甘肽、泊洛沙姆、pge2等成分能够有效调节mdck-g01细胞细胞膜的通透性，促进更高效率的气体交换。此外亚硒酸、na2sio3、亚油酸和泊洛沙姆等成分还能减少细胞的团聚，可进一步增加氧气的利用效率。
由于大型生物反应器容积较大，偶尔会发生氧气搅拌不均的问题，因而更易造成细胞缺氧死亡。本发明申请人制备疫苗时常采用3000l～6000l的大型生物反应器进行细胞培养，因而对细胞的耐低氧能力要求较高。本发明所提供的mdck-g01细胞系配合特定的培养基可取得较为理想的培养效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。