本发明属于基因工程领域，涉及一种单质粒载体，特别涉及一种转座子协同crispr/cas9系统的稳定敲除单质粒载体及其应用。
背景技术：
：基因功能验证是基因工程的先导，包括基因过表达和基因沉默两种主要方法。crispr/cas9系统是新兴的准确高效的基因敲除系统，该系统借鉴于细菌适应性免疫系统，利用sgrna和cas9两个主要元件。其中，sgrna含有位点特异性靶点序列，引导cas9核酸酶准确结合到基因组特异位置切割形成dna双链断裂，生物体损伤修复的不精确性会导致该靶点处基因突变，导致其功能丧失。常规的crispr/cas9系统由两个质粒构建而成，将sgrna与cas9蛋白在两个质粒系统分开表达，具有构建过程繁琐、时间长、效率低的缺陷。转座子(transposon)亦称跳跃基因或可移动元件，最早由mcclintock在研究玉米籽粒的颜色变异中发现。利用“睡美人”(sleepingbeauty)转座系统作为基因导入手段已在多个
技术领域：
得到广泛应用，该系统利用转座酶sb100x识别转座子两端特异反向重复序列(irdr)，将转座子序列切出，通过dna攻击的方式插入新的基因组位置。与传统病毒感染构建稳定细胞株的方法相比，该系统缩短了稳定株构建的时间，避免了包装病毒过程中所产生的生物安全问题，同时提高了稳定重组的效率。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种转座子协同crispr/cas9系统的稳定敲除单质粒载体。该载体以更为方便快捷地用于基因组编辑。该单质粒载体仅需一次转染即可完成sgrna与cas9蛋白的共同表达，同时载体上融入的sleepingbeauty转座子元件(irdr)在转座酶sb100x的作用下，将上述cas9系统整合受体基因组中，构建出目的基因敲除稳定株。本发明的另一目的在于提供上述转座子协同crispr/cas9系统的稳定敲除单质粒载体的应用。本发明的目的通过下述技术方案实现：本发明提供一种转座子协同crispr/cas9系统的稳定敲除单质粒载体，是含有irdr-l-irdr-r盒的双链环状质粒，所述irdr-l-irdr-r盒包括irdr-l序列、启动子、grnascaffold序列、cas9蛋白序列、抗性筛选基因序列和irdr-r序列。所述的irdr-l序列为seqidno：1中自5′端第11417位～11643位碱基的反向互补序列；所述的irdr-r序列为seqidno：1中自5′端第8271位～8498位碱基。所述的启动子是u6启动子，其序列为seqidno：1中自5′端第10位～250位碱基。所述的grnascaffold序列为seqidno：1中自5′端第2140位～2215位碱基。所述的cas9蛋白序列为seqidno：1中自5′端第2513位～6616位碱基。所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列为seqidno：1中自5′端第6755位～7351位碱基。所述的单质粒载体psm-crispr-puro的核苷酸序列如seqidno：1所示。所述的单质粒载体在构建基因敲除稳定株中的应用。此外本发明还提供了psm-crispr-puro载体在构建基因敲除稳定株中的方法及应用，包括以下步骤：(1)利用在线网站(http://crispr.mit.edu/)设计靶向目的基因的guidesequence序列；(2)选取合适的sgrna序列，合成两条包含接头的引物；(3)bsmbi酶切psm-crispr-puro克隆载体，产物跑胶回收，得酶切回收产物；(4)引物退火，得退火产物；(5)连接酶切回收产物与退火产物；(6)连接产物转化感受态细胞，挑取单克隆，测序获得阳性菌；(6)阳性菌株扩繁，大提质粒；(7)将带有目的基因sgrna序列的psm-crispr-puro载体与转座酶质粒sb100x共转染宿主细胞，使cas9系统整合至宿主基因组中；(8)使用嘌呤霉素筛选得到目的基因敲除的稳转细胞株，扩大培养；(9)收集培养的细胞，在非变性状态下裂解细胞，离心抽取蛋白，免疫印迹检测(westernblot)目的基因表达水平；获得目的基因敲除稳定株。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)本发明的单质粒载体仅需要一次构建、一次转染即可实现sgrna和cas9蛋白的表达，该法过程简单、高效、快捷，大大简化质粒构建流程，缩短实验周期，提高工作效率。(2)本发明的载体带有转座酶识别序列，不使用病毒，能方便、快速、安全地建立基因敲除稳定株。(3)本发明的质粒载体包括嘌呤霉素(puromycin)筛选抗性，便于稳定株的筛选。附图说明图1是psm-crispr-puro质粒载体结构示意图。图2是bsmbi核酸内切酶酶切psm-crispr-puro载体，产物琼脂糖凝胶电泳示意图。图3是通过免疫印迹检测(westernblot)的方法检测psm-crispr-puro-sgrcc2基因敲除稳定株中rcc2蛋白的表达水平，并以微管蛋白(tubulin)作为内参。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。本发明中若无特别说明，原料均可市购获得，方法为本领域的常规方法。本发明实施例中所述的psm-crispr-puro质粒载体结构示意图，如图1所示。实施例1：本实施例以rcc2(genebank登录号：bc042141.1)为目标基因，以宫颈癌细胞系hela为模型，构建了rcc2基因稳定敲除的hela细胞株。1.1psm-crispr-puro-sgrcc2质粒载体的构建(1)登录在线网站(http://crispr.mit.edu/)设计靶向rcc2的sgrna序列；(2)选取两对合适的sgrna序列，加入接头，分别标记为sgrcc2-1、sgrcc2-2，交由华大基因公司合成，其序列如下：sgrcc2-1-f：5′-caccgtgcagtagcagcagcggcgg-3′；sgrcc2-1-r：5′-aaacccgccgctgctgctactgcac-3′；sgrcc2-2-f：5′-caccggcgacagcaggcaaggcggg-3′；sgrcc2-2-r：5′-aaaccccgccttgcctgctgtcgcc-3′；(3)bsmbi限制性核酸内切酶37℃酶切psm-crispr-puro载体30min，酶切体系如表1所示，产物琼脂糖胶电泳，电泳结果如图2所示，回收酶切后的大片段条带；表1酶切体系组分用量psm-crispr-puro载体2μgbsmbi酶1μl10×bsmbibuffer2μlddh2o补足20μl总体积20μl(4)高温退火合成的引物，程序为：95℃反应5min，0.1℃/s梯度降温至25℃；反应体系如表2所示：表2引物退火反应体系组分用量sgrcc2-1-f(100μm)1μlsgrcc2-1-r(100μm)1μlddh2o补足20μl总体积20μl或，组分用量sgrcc2-2-f(100μm)1μlsgrcc2-2-r(100μm)1μlddh2o补足20μl总体积20μl(5)22℃连接上述反应得到的胶回收产物与退火产物1h；连接体系如表3所示：表3连接体系组分用量酶切回收产物3μl引物退火产物10μlt4dnaligase0.5μlligationbuffer2μlddh2o补足20μl总体积20μl(6)取10μl连接产物转化stbl3感受态细胞(市售)，铺氨苄青霉素(amp+)抗性lb平板，37℃孵化过夜；(7)挑取抗性板上单克隆菌株，以u6通用引物测序，筛选出测序含有sgrna序列的阳性菌株；(8)扩繁阳性菌株，提取质粒，获得psm-crispr-puro-sgrcc2质粒载体。1.2rcc2稳定敲除hela细胞株的构建(1)选取生长状态良好的hela细胞，用胰酶消化并计数，吸取200万个细胞种板至6cm细胞培养皿中；(2)第二天待细胞完全贴壁后，使用lipofectamine2000共转染5μgpsm-crispr-puro-sgrcc2和5μgsb100x转座酶质粒于hela细胞中；(3)转染后36小时，使用含有终浓度为2μg/ml嘌呤霉素的培养基筛选稳定株，筛选4天左右可获得rcc2稳定敲除hela细胞株。1.3免疫印迹检测rcc2基因表达水平收取一部分细胞，ripa裂解抽取蛋白，经免疫印迹(westernblot)验证，结果如图3所示：该细胞系rcc2基因稳定敲除。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>中山大学孙逸仙纪念医院<120>转座子协同crispr/cas9系统的稳定敲除单质粒载体及其应用<130>1<160>5<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>11643<212>dna<213>artificialsequence<220><221>allele<222>(1)..(11643)<223>单质粒载体psm-crispr-puro的核苷酸序列<400>1taaggtaccgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggct60gttagagagataattagaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacg120tgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatg180gactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttg240tggaaaggacgaaacaccggagacggttgtaaatgagcacacaaaatacacatgctaaaa300tattatattctatgacctttataaaatcaaccaaaatcttctttttaataactttagtat360caataattagaatttttatgttcctttttgcaaacttttaataaaaatgagcaaaataaa420aaaacgctagttttagtaactcgcgttgttttcttcacctttaataatagctactccacc480acttgttcctaagcggtcagctcctgcttcaatcattttttgagcatcttcaaatgttct540aactccaccagctgctttaactaaagcattgtctttaacaactgacttcattagtttaac600atcttcaaatgttgcacctgattttgaaaatcctgttgatgttttaacaaattctaatcc660agcttcaacagctatttcacaagctttcatgatttcttcttttgttaataaacaattttc720cataatacatttaacaacatgtgatccagctgctttttttacagctttcatgtcttctaa780aactaattcataatttttgtcttttaatgcaccaatatttaataccatatcaatttctgt840tgcaccatctttaattgcttcagaaacttcgaatgcttttgtagctgttgtgcatgcacc900tagaggaaaacctacaacatttgttattcctacatttgtgccttttaataattctttaca960atagcttgttcaatatgaattaacacaaactgttgcaaaatcaaattcaattgcttcatc1020acataattgtttaatttcagctttcgtagcatcttgttttaataatgtgtgatctatata1080tttgtttagtttcattttttctcctatatattcatttttaattttaattctttaataatt1140tcgtctactttaactttagcgttttgaacagattcaccaacacctataaaataaattttt1200agtttaggttcagttccacttgggcgaacagcaaatcatgacttatcttctaaataaaat1260tttagtaagtcttgtcctggcatattatacattccatcgatgtagtcttcaacattaaca1320actttaagtccagcaatttgagttaagggtgttgctctcaatgatttcattaatggttca1380atttttaatttcttttcttctggtttaaaattcaagtttaaagtgaaagtgtaatatgca1440cccatttctttaaataaatcttctaaatagtctactaatgttttattttgttttttataa150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